本發(fā)明涉及細(xì)胞保護(hù)劑技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種能夠保持血液成份形態(tài)、血液中細(xì)胞的表面抗原特性、細(xì)胞核的完整性和核酸穩(wěn)定性的血液細(xì)胞穩(wěn)定劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
全血樣品采集時(shí)由于外周環(huán)境的溫度、pH和氧氣質(zhì)量百分?jǐn)?shù)發(fā)生了變化,血液離開人體后血小板會(huì)釋放促凝因子,引起血液凝固,同時(shí)血液細(xì)胞也會(huì)由于環(huán)境的變化而喪失細(xì)胞的緊密度,從而死亡。這個(gè)過程中,血漿的各組分和血液中細(xì)胞成分的物理化學(xué)特性和生物標(biāo)志物(包括蛋白、核酸、小分子等)也會(huì)發(fā)生改變,從而影響血液樣本中具有診斷意義的檢測(cè)結(jié)果。因此,穩(wěn)定血液樣品對(duì)于血樣品的運(yùn)輸和臨床試驗(yàn)流程的操作極為重要,必須對(duì)血液進(jìn)行恰當(dāng)?shù)谋4婀潭ㄊ沟醚杭?xì)胞呈現(xiàn)最好的狀態(tài)。
保存血液的經(jīng)典方法是全血樣品采集時(shí)加入普通抗血液抗凝試劑后,6小時(shí)內(nèi)(最多不超過12小時(shí))需對(duì)血液進(jìn)行分析或者其他處理。目前常見的抗凝試劑有EDTA,EDTA的主要用于螯合鈣離子,阻止了許多的酶促反應(yīng)而直接或者間接地防止了血液凝固。但是像EDTA這種常規(guī)的血液抗凝劑,對(duì)血液中的細(xì)胞沒有保護(hù)作用:在加了抗凝劑的血液中細(xì)胞仍然會(huì)隨著時(shí)間的推移而發(fā)生衰亡,不能保持血液細(xì)胞表面抗原的狀態(tài)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明的目的在于提供一種血液細(xì)胞穩(wěn)定劑及其應(yīng)用,該血液細(xì)胞穩(wěn)定劑使得血液中的血液成份和細(xì)胞能夠保存192小時(shí)以上,并且無(wú)需低溫處理,經(jīng)處理的血液樣品不會(huì)影響樣品的后續(xù)分子檢測(cè),可廣泛應(yīng)用于血液樣品中細(xì)胞成分的的免疫分析、核酸分析或蛋白質(zhì)分析的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
為解決上述問題,本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
一種血液細(xì)胞穩(wěn)定劑,其包括A液和B液,A液為用于維持細(xì)胞物理性質(zhì)的保存液,B液為用于固定細(xì)胞的固定液;其中,A液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:抗凝劑1~10%、磷酸酶抑制劑1~10%、蛋白酶抑制劑0.005~1%、水余量;B液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:醛類聚合物0.1~5%、堿性鹽0.1~5%、鹽酸0.1~5%、水余量。
作為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式,所述血液細(xì)胞穩(wěn)定劑的滲透壓為320~400mOsm/kg、pH值為4.5~8。
優(yōu)選地,所述抗凝劑選自EDTA、檸檬酸鹽、氟化鉀、肝素鈉中的一種或任意兩種以上的混合。
優(yōu)選地,所述磷酸酶抑制劑選自氟化鈉、原礬酸鈉、甘油磷酸鈉、焦磷酸鈉、四咪唑鹽酸鹽中的一種或任意兩種以上的混合。
優(yōu)選地,所述蛋白酶抑制劑選自4-(2-氨乙基)苯磺酰氟、苯甲基磺酰氟、亮肽素、抑肽酶、胃蛋白酶抑制劑、EDTA-Na2中的一種或任意兩種以上的混合。
優(yōu)選地,所述醛類化合物選自甲醛聚合物、乙醛聚合物或丙醛聚合物。
優(yōu)選地,所述堿性鹽選自氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液。
本發(fā)明還提供了上述血液細(xì)胞穩(wěn)定劑在穩(wěn)定血液細(xì)胞中的應(yīng)用。
具體地,所述血液細(xì)胞穩(wěn)定劑在使用前先將A液和B液混合15~120min,然后加入新鮮的血液中對(duì)血液細(xì)胞固定1~192h。
優(yōu)選地,A液和B液按照0.5~2:0.5~2的比例混合。
相比現(xiàn)有技術(shù),本發(fā)明的有益效果在于:
本發(fā)明所述的血液細(xì)胞穩(wěn)定劑具有保護(hù)組織細(xì)胞、對(duì)蛋白質(zhì)、酶等緩慢固定的化學(xué)物質(zhì),能夠穩(wěn)定血液細(xì)胞、保持血液細(xì)胞原有的形態(tài)、維持血液細(xì)胞原有的物理性質(zhì),能夠很好地固定血液中的細(xì)胞,該血液細(xì)胞穩(wěn)定劑使得血液中的血液成份和細(xì)胞能夠保存192小時(shí)以上,并且無(wú)需低溫處理,經(jīng)處理的血液樣品不會(huì)影響后續(xù)的樣品分子分析,可廣泛應(yīng)用于血液樣品中細(xì)胞成分的的免疫分析、核酸分析或蛋白質(zhì)分析的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
附圖說明
圖1為本發(fā)明血液溶血實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組于1h,24h,96h,192h的觀察圖;
圖2為本發(fā)明血液溶血實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組于1h,24h,96h,192h的觀察圖;
圖3為本發(fā)明細(xì)胞完整實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組MCF-7循環(huán)腫瘤細(xì)胞的FITC綠色熒光染色圖;
圖4為本發(fā)明細(xì)胞完整實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組單組MCF-7循環(huán)腫瘤細(xì)胞的FITC綠色熒光染色圖;
圖5為本發(fā)明細(xì)胞完整實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組MCF-7循環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核DAPI染色圖;
圖6為本發(fā)明細(xì)胞完整實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組白細(xì)胞的細(xì)胞核DAPI染色圖;
圖7為本發(fā)明細(xì)胞完整實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組單個(gè)白細(xì)胞的細(xì)胞核DAPI染色圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
一種血液細(xì)胞穩(wěn)定劑,其包括A液和B液,A液為用于維持細(xì)胞物理性質(zhì)的保存液,B液為用于固定細(xì)胞的固定液;其中,A液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:抗凝劑1~10%、磷酸酶抑制劑1~10%、蛋白酶抑制劑0.005~1%、水余量;B液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:醛類聚合物0.1~5%、堿性鹽0.1~5%、鹽酸0.1~5%、水余量。
血液細(xì)胞穩(wěn)定劑的滲透壓為320~400mOsm/kg、pH值為4.5~8??鼓齽┻x自EDTA、檸檬酸鹽、氟化鉀、肝素鈉中的一種或任意兩種以上的混合。磷酸酶抑制劑選自氟化鈉、原礬酸鈉、甘油磷酸鈉、焦磷酸鈉、四咪唑鹽酸鹽中的一種或任意兩種以上的混合。蛋白酶抑制劑選自4-(2-氨乙基)苯磺酰氟、苯甲基磺酰氟、亮肽素、抑肽酶、胃蛋白酶抑制劑、EDTA-Na2中的一種或任意兩種以上的混合。醛類化合物選自甲醛聚合物、乙醛聚合物或丙醛聚合物。堿性鹽選自氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液。所述水為MilliQ H2O。
本發(fā)明還提供了上述血液細(xì)胞穩(wěn)定劑在穩(wěn)定血液細(xì)胞中的應(yīng)用。具體地,血液細(xì)胞穩(wěn)定劑在使用前先將A液和B液混合15~120min,然后加入新鮮的血液中對(duì)血液細(xì)胞固定1~192h。優(yōu)選地,A液和B液按照0.5~2:0.5~2的比例混合。
實(shí)施例1:
一種血液細(xì)胞穩(wěn)定劑,其包括A液和B液,A液為用于維持細(xì)胞物理性質(zhì)的保存液,B液為用于固定細(xì)胞的固定液;其中,A液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:EDTA 5%、氟化鈉5%、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟0.5%、水89.5%;B液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:甲醛聚合物2.5%、氫氧化鈉溶液2.5%、鹽酸2.5%、水92.5%。
實(shí)施例2:
一種血液細(xì)胞穩(wěn)定劑,其包括A液和B液,A液為用于維持細(xì)胞物理性質(zhì)的保存液,B液為用于固定細(xì)胞的固定液;其中,A液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:檸檬酸鹽7%、原礬酸鈉4%、苯甲基磺酰氟0.7%、水88.3%;B液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:乙醛聚合物3%、氫氧化鉀溶液4%、鹽酸2%、水91%。
實(shí)施例3:
一種血液細(xì)胞穩(wěn)定劑,其包括A液和B液,A液為用于維持細(xì)胞物理性質(zhì)的保存液,B液為用于固定細(xì)胞的固定液;其中,A液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:氟化鉀4%、甘油磷酸鈉6%、亮肽素1%、水89%;B液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:丙醛聚合物2%、氫氧化鈉溶液5%、鹽酸1%、水92%。
實(shí)施例4:
一種血液細(xì)胞穩(wěn)定劑,其包括A液和B液,A液為用于維持細(xì)胞物理性質(zhì)的保存液,B液為用于固定細(xì)胞的固定液;其中,A液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:肝素鈉8%、焦磷酸鈉6%、抑肽酶0.6%、水85.4%;B液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:甲醛聚合物1%、氫氧化鉀溶液5%、鹽酸4%、水90%。
實(shí)施例5:
一種血液細(xì)胞穩(wěn)定劑,其包括A液和B液,A液為用于維持細(xì)胞物理性質(zhì)的保存液,B液為用于固定細(xì)胞的固定液;其中,A液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:EDTA 4%、四咪唑鹽酸鹽7%、胃蛋白酶抑制劑0.8%、水88.2%;B液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:乙醛聚合物4%、氫氧化鉀溶液3%、鹽酸2%、水91%。
實(shí)施例6:
一種血液細(xì)胞穩(wěn)定劑,其包括A液和B液,A液為用于維持細(xì)胞物理性質(zhì)的保存液,B液為用于固定細(xì)胞的固定液;其中,A液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:肝素鈉3%、原礬酸鈉8%、EDTA-Na2 1%、水88%;B液包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:丙醛聚合物5%、氫氧化鈉溶液1%、鹽酸1%、水93%。
一、血液溶血實(shí)驗(yàn):
將實(shí)施例1中的A液和B液按1:1的體積比預(yù)先混合15min作為實(shí)驗(yàn)組,配制0.9%生理鹽水作為對(duì)照組。取新鮮血液分成2組,每組8ml,向兩組血液中分別加入8ml已經(jīng)混合好的血液細(xì)胞穩(wěn)定劑和0.9%生理鹽水,血液樣本在常溫保存。分別于保存后的1h,24h,96h,192h四個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn),將固定后樣本顛倒混勻后,目視觀察是否有血液凝固;若無(wú)凝固,將血液樣本進(jìn)行離心,離心后,觀察是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,結(jié)果見圖1、圖2及表1。
表1實(shí)驗(yàn)組和對(duì)比組血液溶血實(shí)驗(yàn)離心結(jié)果
由圖1、圖2及表1可知,對(duì)比組24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)了溶血現(xiàn)象并隨著時(shí)間加深、96h內(nèi)開始出現(xiàn)血液現(xiàn)象,而加了血液細(xì)胞穩(wěn)定劑的實(shí)驗(yàn)組可保存血液至192小時(shí)并且不會(huì)出現(xiàn)溶血和血液凝固現(xiàn)象,能夠較好地維持血液細(xì)胞的原有形態(tài)和物理性質(zhì)。
二、細(xì)胞完整性實(shí)驗(yàn):
將實(shí)施例1中的A液和B液按1:1的體積比預(yù)先混合15min以上作為實(shí)驗(yàn)組,配制0.9%生理鹽水作為對(duì)照組。取新鮮血液8組,每組8ml。其中4組加入8ml已經(jīng)混合好的血液細(xì)胞穩(wěn)定劑并混勻,另取4組加入8ml 0.9%生理鹽水并混勻。向8組樣本均投入240個(gè)已經(jīng)計(jì)數(shù)好的MCF-7循環(huán)腫瘤細(xì)胞。將上述8組血液樣本置于常溫下保存,然后按照保存后的1h,24h,96h,192h四個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)固定后,將血液樣本進(jìn)行離心,將離心后的血漿移除,然后加入紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行紅細(xì)胞裂解;裂解后進(jìn)行離心,移除上清液后,用細(xì)胞結(jié)合緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗,然后再次離心;用細(xì)胞結(jié)合緩沖液重懸白細(xì)胞,然后加入FcR封閉劑,冰上反應(yīng)10min,然后加入已標(biāo)記生物素捕獲抗體進(jìn)行低溫孵育30分鐘。孵育后,使用細(xì)胞清洗液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗,以洗脫多余的未結(jié)合的抗體;接著進(jìn)行離心,移除上清液后加入磁珠、染色劑(DAPI),然后在鞘流環(huán)境中捕獲MCF-7循環(huán)腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察回收的細(xì)胞細(xì)胞核是否完整,對(duì)MCF-7循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算回收率。結(jié)果見圖3~圖7及表2。
表2 MCF-7循環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞回收率對(duì)比
由圖3~圖5可知,F(xiàn)ITC綠色熒光染色和DAPI染色顯示下的MCF-7循環(huán)腫瘤細(xì)胞形態(tài)完整、清楚,說明細(xì)胞是完整的,并可以與抗體抗-細(xì)胞角蛋白(CK+)結(jié)合;由圖6和圖7可知,DAPI染色顯示下的白細(xì)胞的細(xì)胞膜完整且可以被抗體結(jié)合并染色;通過計(jì)算細(xì)胞回收率,實(shí)驗(yàn)組的血液白細(xì)胞的細(xì)胞核與MCF-7循環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核是完整的,且回收率達(dá)80%以上;而對(duì)照組的保存1h后細(xì)胞回收率低于30%,并且24h后已經(jīng)捕獲不到MCF-7循環(huán)腫瘤。
綜上所述,本發(fā)明的血液細(xì)胞穩(wěn)定劑可保存血液192h,且不會(huì)出現(xiàn)溶血和血液凝固現(xiàn)象,并保持細(xì)胞表面抗原特性和細(xì)胞核完整性,利于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行血液樣品中細(xì)胞成分的的免疫分析、核酸分析或蛋白質(zhì)分析實(shí)驗(yàn)。
上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,不能以此來(lái)限定本發(fā)明保護(hù)的范圍,本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。