本發(fā)明屬于活性氧檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種浮游植物細(xì)胞內(nèi)外活性氧的檢測方法。

背景技術(shù)：

活性氧對生物體十分重要，但過量會對生物體產(chǎn)生氧化損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于活性氧壽命短、反應(yīng)活性高，且大部分都存在于體內(nèi)很難被捕獲，因此活體中ros的直接檢測對于解釋生命機(jī)體的各種生理反應(yīng)有著重要的意義。目前能夠用于解決該問題的方法比較有限，已報道的電子順磁共振技術(shù)(electronparamagneticresonance，epr)是一種檢測自由基的波譜學(xué)方法，可以直接檢測·o2^-、·oh等活性氧自由基及參與其形成的過渡金屬離子的化學(xué)變化。電子自旋共振，色譜分析等技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在活性氧的研究中。這些檢測技術(shù)精度高，但存在需要昂貴的實驗設(shè)備，且實驗過程復(fù)雜，檢測工作量大，受限因素多等缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種浮游植物細(xì)胞內(nèi)外活性氧的檢測方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種浮游植物細(xì)胞內(nèi)外活性氧的檢測方法，包括如下步驟：

(1)取近海典型浮游植物于f/2培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，該f/2培養(yǎng)基中含有用以標(biāo)記近海典型浮游植物的sa-cds，獲得sa-cds標(biāo)記培養(yǎng)液，具體培養(yǎng)條件如下：f/2培養(yǎng)基中含有14～16mg/lcds，置于光照強(qiáng)度為130～150μmolphotons(m²s)^-1，光暗比為12～15h：8～10h，溫度為18～20℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以80～120rpm攪拌海藻懸浮液模擬海水流動，同時減少cds在容器壁上吸附；

(2)以h2o2溶液作為活性氧標(biāo)準(zhǔn)液，根據(jù)上述sa-cds在不同濃度的活性氧標(biāo)準(zhǔn)液的熒光強(qiáng)度變化的情況，獲得第一線性工作曲線：y＝0.2599x+2.404，其線性范圍：6-9.6×10⁵ng/l，其中x表示h2o2濃度，y表示熒光強(qiáng)度；根據(jù)上述sa-cds在不同濃度的活性氧標(biāo)準(zhǔn)液的顯色吸光度變化情況，獲得第二線性工作曲線：y＝-0.0002x+0.1941，其線性范圍：3-2400ng/l，其中x表示h2o2濃度，y表示吸光強(qiáng)度；

(3)步驟(1)獲得的sa-cds標(biāo)記培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞懸浮于適量海水中，于17～19℃同時在高壓汞燈持續(xù)照射下，以80～100rpm的速度持續(xù)攪拌0.8～1.2h，然后取適量進(jìn)行超聲波破碎，得破碎液，在破碎液中加入適量fecl3溶液后于激發(fā)波長343nm，發(fā)射波長440nm下掃描其熒光光譜slit2.5/5，記錄試劑空白和試液的熒光強(qiáng)度f0和f1，計算熒光強(qiáng)度變化值δf＝f0-f1，最后將該熒光強(qiáng)度變化值δf作為y代入步驟(2)所得的第一線性工作曲線，所得x即為藻細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度檢測結(jié)果；

(4)步驟(1)獲得的sa-cds標(biāo)記培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞懸浮于適量海水中，于17～19℃同時在高壓汞燈持續(xù)照射下，以80～100rpm的速度持續(xù)攪拌0.8～1.2h，得細(xì)胞懸浮液，在該細(xì)胞懸浮液中加入適量fecl3溶液后于波長λ525檢測吸光強(qiáng)度，最后將該吸光強(qiáng)度作為y代入步驟(2)所得的第二線性工作曲線，所得x即為藻細(xì)胞外活性氧濃度檢測結(jié)果。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述近海典型浮游植物包括威氏海鏈藻ccma-102和小球藻ccma-410。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述sa-cds的制備方法如下：取1.0mlcds儲備液于100ml容量瓶中，再稱取0.0138g水楊酸加入其中溶解后定容至刻度線，避光攪拌24h后置暗處2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述cds儲備液的中cds的粒徑為2-5nm，濃度為3g/l，量子產(chǎn)率量子產(chǎn)率≥60％，表面基團(tuán)含氨基、羥基和羰基，其激發(fā)波長為343nm，發(fā)射波長為440nm。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述f/2培養(yǎng)基由濃度為75.0g/l硝酸鈉母液、濃度為5.0g/l的磷酸鈉母液、濃度為30.0g/l的硅酸鈉母液、微量元素母液、維生素母液和海水組成，且硝酸鈉母液、磷酸鈉母液、硅酸鈉母液、微量金屬母液、維生素母液和海水的體積比為2∶2∶2∶2∶1∶2000，其中微量元素母液中含有氯化鐵3.15g/l、硫酸銅9.8g/l、鉬酸鈉6.3g/l、硫酸鋅22.0g/l、氯化鈷10.0g/l、氯化錳180.0g/l，維生素母液含有維生素b121.0g/l、生物素0.1g/l和鹽酸硫胺0.2g/l。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述fecl3溶液的濃度為10mmol/l。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明應(yīng)用水楊酸表面修飾的碳量子點(sa-cds)，通過膜孔導(dǎo)入浮游植物細(xì)胞質(zhì)中，水楊酸與胞內(nèi)活性氧結(jié)合產(chǎn)生2，3-二羥基苯甲酸，其與fecl3反應(yīng)，誘發(fā)熒光猝滅，據(jù)熒光信號變化值間接測定胞內(nèi)活性氧含量。sa-cds表面酚羥基可與fe³⁺快速反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物[fe(c7h6o3)6]^3-，該絡(luò)合物可被胞外活性氧誘導(dǎo)分解，顏色逐漸恢復(fù)至黃色，用比色法于波長λ525檢測胞外活性氧含量，本發(fā)明的cds熒光信號穩(wěn)定、尺寸小，較其他的熒光量子點具有水溶性好和生物毒性低等優(yōu)勢，不僅能夠克服同位素示蹤、電子自旋共振，色譜分析等技術(shù)的缺陷，且具檢測線性范圍廣、精密度高、檢測限低等優(yōu)勢。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中水楊酸修飾碳量子點(sa-cds)前后的紫外圖譜。

圖2為本發(fā)明實施例1中水楊酸修飾碳量子點標(biāo)記浮游植物圖(左：小球藻；右：威氏海鏈藻)。

圖3為本發(fā)明實施例1中水楊酸修飾碳量子點標(biāo)記浮游植物穩(wěn)定性信號圖。

圖4為本發(fā)明實施例1中水楊酸修飾的碳量子點與胞內(nèi)活性氧反應(yīng)前(左)后(右)的熒光圖譜。

圖5為本發(fā)明實施例1中第一線性工作曲線。

圖6為本發(fā)明實施例1中第二線性工作曲線。

具體實施方式

以下通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。

實施例1：

(1)取近海典型浮游植物(威氏海鏈藻ccma-102和小球藻ccma-410)于f/2培養(yǎng)基(由濃度為75.0g/l硝酸鈉母液、濃度為5.0g/l的磷酸鈉母液、濃度為30.0g/l的硅酸鈉母液、微量元素母液、維生素母液和海水組成，且硝酸鈉母液、磷酸鈉母液、硅酸鈉母液、微量金屬母液、維生素母液和海水的體積比為2∶2∶2∶2∶1∶2000，其中微量元素母液中含有氯化鐵3.15g/l、硫酸銅9.8g/l、鉬酸鈉6.3g/l、硫酸鋅22.0g/l、氯化鈷10.0g/l、氯化錳180.0g/l，維生素母液含有維生素b121.0g/l、生物素0.1g/l和鹽酸硫胺0.2g/l)中進(jìn)行培養(yǎng)6d，該f/2培養(yǎng)基中含有用以標(biāo)記近海典型浮游植物的sa-cds，獲得sa-cds標(biāo)記培養(yǎng)液(如圖2和3所示)，具體培養(yǎng)條件如下：f/2培養(yǎng)基中含有15mg/lcds，置于光照強(qiáng)度為140μmolphotons(m²s)^-1，光暗比為14h：10h，溫度為19℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以100rpm攪拌海藻懸浮液模擬海水流動，同時減少cds在容器壁上吸附；

上述cds儲備液購于北京北達(dá)聚邦科技有限公司，其中的cds的粒徑為2-5nm，濃度為3g/l，量子產(chǎn)率≥60％，表面基團(tuán)含氨基、羥基和羰基，其激發(fā)波長為343nm，發(fā)射波長為440nm。sa-cds的制備方法如下：取1.0ml上述cds儲備液于100ml容量瓶中，再稱取0.0138g水楊酸加入其中溶解后定容至刻度線，避光攪拌24h后置暗處2～8℃保存?zhèn)溆?，水楊酸修飾前后的碳量子點的紫外圖譜如圖1所示；

(2)以h2o2溶液作為活性氧標(biāo)準(zhǔn)液，根據(jù)上述sa-cds在不同濃度的活性氧標(biāo)準(zhǔn)液的熒光強(qiáng)度變化的情況(圖4)，獲得如圖5所示的第一線性工作曲線：y＝0.2599x+2.404，其線性范圍：6-9.6×10⁵ng/l，其中x表示h2o2濃度，y表示熒光強(qiáng)度；根據(jù)上述sa-cds在不同濃度的活性氧標(biāo)準(zhǔn)液的顯色吸光度變化情況，獲得如圖6所示的第二線性工作曲線：y＝-0.0002x+0.1941，其線性范圍：3-2400ng/l，其中x表示h2o2濃度，y表示吸光強(qiáng)度

(3)步驟(1)獲得的sa-cds標(biāo)記培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞經(jīng)pbs緩沖液(ph＝7.4)清洗三遍去除細(xì)胞表面吸附的剩余cds后，懸浮于500ml海水中，于18±0.5℃同時在高壓汞燈持續(xù)照射下，以100rpm的速度持續(xù)攪拌1h，然后取2ml進(jìn)行超聲波破碎，得破碎液，在破碎液中加入20μl10mmol/lfecl3溶液后于激發(fā)波長343nm，發(fā)射波長440nm下掃描其熒光光譜slit2.5/5，記錄試劑空白和試液的熒光強(qiáng)度f0和f1，計算熒光強(qiáng)度變化值δf＝f0-f1，最后將該熒光強(qiáng)度變化值δf作為y代入步驟(2)所得的第一線性工作曲線，所得x即為藻細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度檢測結(jié)果；

(4)步驟(1)獲得的sa-cds標(biāo)記培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞經(jīng)pbs緩沖液(ph＝7.4)清洗三遍去除細(xì)胞表面吸附的剩余cds后，懸浮于適量海水中，于18±0.5℃同時在高壓汞燈持續(xù)照射下，以100rpm的速度持續(xù)攪拌h，得細(xì)胞懸浮液，在該細(xì)胞懸浮液中加入100μl10mmol/lfecl3溶液后于波長λ525檢測吸光強(qiáng)度，最后將該吸光強(qiáng)度作為y代入步驟(2)所得的第二線性工作曲線，所得x即為藻細(xì)胞外活性氧濃度檢測結(jié)果。

為了驗證本實施例方法中的碳量子點的生物低毒性，通過探討cds對威氏海鏈藻和小球藻細(xì)胞的光合活性、葉綠素a含量和存活率的影響來鑒定它在浮游植物細(xì)胞中的生物毒性。實驗結(jié)果顯示兩種浮游植物細(xì)胞光合活性和葉綠素a含量與對照組比較均不存在顯著性差異，存活率分別高達(dá)89.7％和94.5％，說明cds對浮游植物細(xì)胞幾乎無毒，見表1：

表1cds在浮游植物中毒性分析指標(biāo)

為了驗證本實施例方法中的水楊酸修飾的碳量子點對胞內(nèi)外活性氧含量檢測的適用性，按傳統(tǒng)的生物體內(nèi)過氧化物檢測方法peroxidetect^tmkit與該方法對兩種浮游植物細(xì)胞中的活性氧含量分析測定，結(jié)果如表2所示：

表2分析實際藻體樣品中的活性氧含量

綜上，本發(fā)明方法能夠克服同位素示蹤、電子自旋共振，色譜分析等技術(shù)的缺陷。碳量子點以粒徑小的優(yōu)勢直接通過浮游植物細(xì)胞膜且可在細(xì)胞質(zhì)或液中穩(wěn)定存在。胞內(nèi)和胞外檢測法均具線性范圍廣(6-9.6×10⁵ng/l和3-2400ng/l)、精密度高(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd6.38％和2.19％)、檢測限低(5.32ng/l和1.21ng/l)等優(yōu)勢。胞內(nèi)檢測法限比高效液相色譜法(同以水楊酸為捕獲劑)低10⁵倍。胞外檢測法與peroxidetect^tmkit法檢測結(jié)果不存在顯著性差異且檢測限低28倍。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。