本發(fā)明屬于生物毒素檢測領(lǐng)域，涉及一種赭曲霉素A的檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

赭曲霉素A（Ochratoxin A，OTA）是一類真菌毒素，是曲霉素和青霉素的某些菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，具有很強的致畸、致癌、致突變性，廣泛存在于各種食物中，包括谷類、豆類及豆制品、干果、咖啡及咖啡豆和酒類等。

鑒于赭曲霉素A的危害性和廣泛分布，發(fā)展一種快速、靈敏的檢測赭曲霉素A的方法在食品安全和環(huán)境健康等方面具有重要的意義。傳統(tǒng)的檢測方法主要包括薄層層析法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和質(zhì)譜法等，但這些方法所使用儀器昂貴，費時，對樣品的預(yù)處理時間長，難以實現(xiàn)快速檢測。因此，迫切需要建立一種新型赭曲霉素A檢測方法，并使檢測過程無需使用檢測儀器，簡化操作，縮減成本，便于攜帶，以實現(xiàn)現(xiàn)場分析和高通量篩查。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于利用具有催化功能的核酸循環(huán)放大信號，建立一種可視化赭曲霉素A的檢測方法及檢測試劑盒。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種赭曲霉素A的檢測試劑盒，包括以下成分：

莖環(huán)結(jié)構(gòu)核酸序列H1：具有A 區(qū)域、B 區(qū)域和C區(qū)域，其中A是赭曲霉素A的核酸適體，能與赭曲霉素A特異性結(jié)合；B是具有催化功能的核酸序列，C與A的部分序列互補，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖結(jié)構(gòu)；此時，B位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)結(jié)構(gòu)中，其催化功能被抑制；在H1溶液中加入赭曲霉素A；赭曲霉素A與H1的A相互作用，打開H1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使H1的B暴露出來，形成具有催化功能的核酸；

底物序列H2：具有D 區(qū)域、識別位點和E區(qū)域，其中識別位點的核酸為TrAG，被B識別和切割，其中切割位點為rA；D和E臨接識別位點的區(qū)域中各有至少6個堿基與H1的B互補，D和E遠離識別位點的區(qū)域至少有6個堿基互補，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖結(jié)構(gòu)；

F序列修飾的膠體金1：F序列與膠體金之間通過連接臂連接，F(xiàn)與E的一端互補；

G序列修飾的膠體金2：G序列與膠體金之間通過連接臂連接，G與E的另一端互補；

緩沖液中含有Mg²⁺和Ca²⁺。

其中，只有Mg²⁺存在，核酸才能發(fā)揮催化功能。只有Ca²⁺存在，赭曲霉素A才能與核酸適體相互作用。

優(yōu)選的，H1莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，C與A的部分序列互補，互補的堿基數(shù)為8-11個，形成莖結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，H1莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，C與A的部分序列互補，互補的堿基數(shù)為9個，形成莖結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，H2莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，D和E互補的堿基數(shù)為6-10個，進一步優(yōu)選為8個。

優(yōu)選的，D區(qū)域的堿基數(shù)為16-22個。

優(yōu)選的，D區(qū)域的堿基數(shù)為18個。

優(yōu)選的，E區(qū)域的堿基數(shù)為18-22個。

優(yōu)選的，E區(qū)域的堿基數(shù)為20個。

優(yōu)選的，D和E臨接識別位點的區(qū)域中與H1的B互補的堿基數(shù)為6-8個。

優(yōu)選的，F(xiàn)和G與膠體金之間的連接臂序列為AAAAAA，連接臂末端通過巰基SH與膠體金相連。

其中AAAAAA可以防止膠體金的空間位阻效應(yīng)影響核酸雜交。

優(yōu)選的，F(xiàn)和G的堿基數(shù)為9-12個。

優(yōu)選的，緩沖液為10 mM Tris-HCl, pH 8.5, 包括下列成分120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl₂，15 mM MgCl₂。

優(yōu)選的，所述的檢測試劑盒包括下列成分：

莖環(huán)結(jié)構(gòu)核酸序列H1：3'-ACAGGCTACGAGGGAAATGCGGTGGGTGTGGGCTAG-TCTCATTGTACCCAC TTGGACCAATTAGCGACTATAG-CTAGCCCAC-5'（SEQ ID NO：1）；

底物序列H2：5'-GCTGGACTATTCAGAGTA-TrAG-GATATCTAACTGAGTCCAGC-3'（SEQ ID NO：2）；

F序列修飾的膠體金1，其核酸序列為：3'-SH-AAAAAA-CTATAGATTG-5'（SEQ ID NO：3）；

G序列修飾的膠體金2，其核酸序列為：5'-SH-AAAAAA-GCTGGACTCA-3'（SEQ ID NO：4）；

緩沖液為10 mM Tris-HCl, pH 8.5, 包括下列成分120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl₂，15 mM MgCl₂。

一種赭曲霉素A的檢測方法，是利用前面任一項所述的檢測試劑盒來進行赭曲霉素A的檢測。

在H1溶液中加入待測溶液，如果待測溶液中存在赭曲霉素A；赭曲霉素A與H1的A相互作用，打開H1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使H1的B暴露出來，形成具有催化功能的核酸。

在反應(yīng)體系中加入底物H2，H1的B在H2的識別位點（rA）切割底物H2，使H2的D和E序列分離。同時H1又可以循環(huán)進入下一輪的切割反應(yīng)，不斷切割H2，不斷使H2的D和E序列分離。

加入F序列修飾的膠體金1（AuNPs1）和G序列修飾的膠體金2（AuNPs2），E序列與F和G互補，從而拉近AuNPs1和AuNPs2的距離，使紅色的膠體金變成藍色。通過觀察顏色變化即可達到檢測赭曲霉素A的目的。

如果體系中沒有赭曲霉素A，催化功能的核酸序列無法暴露，H2無法被切割，膠體金無法變色。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明通過赭曲霉素A的激活，形成具有催化功能的核酸，可不斷循環(huán)切割底物序列，達到信號放大的目的。結(jié)合膠體金顏色變化，可實現(xiàn)肉眼直接觀察來檢測赭曲霉素A。

本發(fā)明具有較高的靈敏度，對赭曲霉素A的檢測限為10 pg/mL，檢測具有很好的特異性，常見干擾物對檢測不產(chǎn)生影響。

本發(fā)明操作簡單，無需任何檢測儀器，檢測結(jié)果直接肉眼可見，成本低廉，經(jīng)濟便宜，響應(yīng)迅速，適于大范圍應(yīng)用于基層篩查赭曲霉素A污染情況。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述檢測方法原理圖；

圖2為對不同濃度赭曲霉素A檢測結(jié)果圖；

圖3為特異性實驗結(jié)果圖。

具體實施方式

一種赭曲霉素A的檢測試劑盒，包括以下成分：

莖環(huán)結(jié)構(gòu)核酸序列H1：具有A 區(qū)域、B 區(qū)域和C區(qū)域，其中A是赭曲霉素A的核酸適體，能與赭曲霉素A特異性結(jié)合；B是具有催化功能的核酸序列，C與A的部分序列互補，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖結(jié)構(gòu)；此時，B位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)結(jié)構(gòu)中，其催化功能被抑制；在H1溶液中加入赭曲霉素A；赭曲霉素A與H1的A相互作用，打開H1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使H1的B暴露出來，形成具有催化功能的核酸；

底物序列H2：具有D 區(qū)域、識別位點和E區(qū)域，其中識別位點的核酸為TrAG，被B識別和切割，其中切割位點為rA；D和E臨接識別位點的區(qū)域中各有至少6個堿基與H1的B互補，D和E遠離識別位點的區(qū)域至少有6個堿基互補，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖結(jié)構(gòu)；

F序列修飾的膠體金1：F序列與膠體金之間通過連接臂連接，F(xiàn)與E的一端互補；

G序列修飾的膠體金2：G序列與膠體金之間通過連接臂連接，G與E的另一端互補；

緩沖液中含有Mg²⁺和Ca²⁺。

其中，只有Mg²⁺存在，核酸才能發(fā)揮催化功能。只有Ca²⁺存在，赭曲霉素A才能與核酸適體相互作用。

優(yōu)選的，H1莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，C與A的部分序列互補，互補的堿基數(shù)為8-11個，形成莖結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，H1莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，C與A的部分序列互補，互補的堿基數(shù)為9個，形成莖結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，H2莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，D和E互補的堿基數(shù)為6-10個，進一步優(yōu)選為8個，形成莖結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，D區(qū)域的堿基數(shù)為16-22個。

優(yōu)選的，D區(qū)域的堿基數(shù)為18個。

優(yōu)選的，E區(qū)域的堿基數(shù)為18-22個。

優(yōu)選的，E區(qū)域的堿基數(shù)為20個。

優(yōu)選的，D和E臨接識別位點的區(qū)域中與H1的B互補的堿基數(shù)為6-8個。

優(yōu)選的，F(xiàn)和G與膠體金之間的連接臂序列為AAAAAA，連接臂末端通過巰基SH與膠體金相連。

其中AAAAAA可以防止膠體金的空間位阻效應(yīng)影響核酸雜交。

優(yōu)選的，F(xiàn)和G的堿基數(shù)為9-12個。

優(yōu)選的，緩沖液為10 mM Tris-HCl, pH 8.5, 包括下列成分120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl₂，15 mM MgCl₂。

優(yōu)選的，所述的檢測試劑盒包括下列成分：

莖環(huán)結(jié)構(gòu)核酸序列H1：3'-ACAGGCTACGAGGGAAATGCGGTGGGTGTGGGCTAG-TCTCATTGTACCCAC TTGGACCAATTAGCGACTATAG-CTAGCCCAC-5'（SEQ ID NO：1）；

底物序列H2：5'-GCTGGACTATTCAGAGTA-TrAG-GATATCTAACTGAGTCCAGC-3'（SEQ ID NO：2）；

F序列修飾的膠體金1，其核酸序列為：3'-SH-AAAAAA-CTATAGATTG-5'（SEQ ID NO：3）；

G序列修飾的膠體金2，其核酸序列為：5'-SH-AAAAAA-GCTGGACTCA-3'（SEQ ID NO：4）；

緩沖液為10 mM Tris-HCl, pH 8.5, 包括下列成分120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl₂，15 mM MgCl₂。

一種赭曲霉素A的檢測方法，是利用前面任一項所述的檢測試劑盒來進行赭曲霉素A的檢測。

在H1溶液中加入待測溶液，如果待測溶液中存在赭曲霉素A；赭曲霉素A與H1的A相互作用，打開H1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使H1的B暴露出來，形成具有催化功能的核酸。

在反應(yīng)體系中加入底物H2，H1的B在H2的識別位點（rA）切割底物H2，使H2的D和E序列分離。同時H1又可以循環(huán)進入下一輪的切割反應(yīng)，不斷切割H2，不斷使H2的D和E序列分離。

加入F序列修飾的膠體金1（AuNPs1）和G序列修飾的膠體金2（AuNPs2），E序列與F和G互補，從而拉近AuNPs1和AuNPs2的距離，使紅色的膠體金變成藍色。通過觀察顏色變化即可達到檢測赭曲霉素A的目的。

如果體系中沒有赭曲霉素A，催化功能的核酸序列無法暴露，H2無法被切割，膠體金無法變色（反應(yīng)原理見圖1）。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但不限于此。

實施例1

一種赭曲霉素A的檢測方法按照如下步驟進行：

（1）用緩沖液（10 mM Tris-HCl, pH 8.5, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl₂, 15 mMMgCl₂）充分溶解H1（500 nM），加入不同濃度的赭曲霉素A，充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘。

（２）加入H2，充分混勻，室溫反應(yīng)90分鐘。

（３）同時加入AuNPs1和AuNPs2，充分混勻，室溫放置15分鐘，觀察顏色變化。通過顏色變化判斷檢測體系中是否存在赭曲霉素A。

實施例2

一種赭曲霉素A的檢測試劑盒包括以下成分：

（１）莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列H1，序列如下：

H1：3'-ACAGGCTACGAGGGAAATGCGGTGGGTGTGGGCTAG（A）-TCTCATTGTACCCAC TTGGACCAATTAGCGACTATAG（B）-CTAGCCCAC（C）-5'（SEQ ID NO：1）；

（２）底物序列H2，序列如下：

H2: 5'-GCTGGACTATTCAGAGTA（D）-TrAG-GATATCTAACTGAGTCCAGC（E）-3'（SEQ ID NO：2）；

（３）F序列修飾的膠體金1（AuNPs1）：

AuPNs1: 3'-SH-AAAAAA-CTATAGATTG（F）-5'（SEQ ID NO：3）；

（４）G序列修飾的膠體金2（AuNPs2）：

AuPNs2: 5'-SH-AAAAAA-GCTGGACTCA（G）-3'（SEQ ID NO：4）；

（５）緩沖液為10 mM Tris-HCl, pH 8.5, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl₂，15 mM MgCl₂。

實施例3

對不同濃度赭曲霉素A的檢測：

配制赭曲霉素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為10 pg/mL，100 pg/mL，1 ng/mL，10 ng/mL和100 ng/mL，4℃避光保存。

將不同濃度的赭曲霉素A溶液分別加到實施例1中所述的反應(yīng)體系中，充分反應(yīng)后觀察實驗結(jié)果，如圖2所示，10 pg/mL的赭曲霉素A可產(chǎn)生明顯的藍色變化，說明其檢測限為10 pg/mL。隨著赭曲霉素A濃度的增加，藍色強度增加，并逐漸趨于飽和。

實施例4

特異性實驗：

配制濃度為100 ng/mL的不同干擾物標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別是赭曲霉素B，黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素M1，玉米赤霉烯酮和雙酚A。

將100 ng/mL的不同干擾物標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 npg/mL 赭曲霉素A標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加到實施例1中所述的反應(yīng)體系中，充分反應(yīng)后觀察顏色變化，如圖3所示，100 ng/mL的赭曲霉素B，黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素M1，玉米赤霉烯酮和雙酚A仍然保持紅色，對檢測不產(chǎn)生影響。只有當(dāng)加入赭曲霉素A后才會產(chǎn)生藍色變化，這證明該方法對赭曲霉素A的檢測具有很好的特異性。

實施例5

回收率實驗：

在玉米樣品中添加不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品（100 pg/mL，1 ng/mL, 10 ng/mL），充分混勻后用實施例1中所述的方法進行檢測，檢出濃度分別為96 pg/mL，0.94 ng/mL, 10.3 ng/mL，對應(yīng)的回收率分別為96%、94%以及103%，回收率范圍為94%-103%，能滿足實際樣品檢測需求。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省生態(tài)環(huán)境技術(shù)研究所

<120> 一種赭曲霉素A的檢測方法及檢測試劑盒

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acaggctacg agggaaatgc ggtgggtgtg ggctagtctc attgtaccca cttggaccaa 60

ttagcgacta tagctagccc ac 82

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctggactat tcagagtatr aggatatcta actgagtcca gc 42

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaaaactat agattg 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaaaaagctg gactca 16