本發(fā)明屬于水環(huán)境中痕量fe²⁺比色檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種水溶性長波長吸收染料的制備及其比色法檢測(cè)水環(huán)境中痕量fe²⁺的方法。

背景技術(shù)：

鐵是地殼含量第二高的金屬元素，也是生物體主要的組成元素之一。以人體為例：成人體內(nèi)約有4-5克鐵，其中72％以血紅蛋白、35％以肌紅蛋白、0.2以其它化合物形式存在，等等。fe是生物體中血紅蛋白的重要部分，是向細(xì)胞生命體提供氧氣，并將產(chǎn)生的二氧化碳帶出細(xì)胞的必要元素之一。鐵元素在醫(yī)藥上作抗貧血藥、局部收斂劑及補(bǔ)血?jiǎng)?，可用于子宮肌瘤引起的慢性失血；分析試劑及制鐵氧體原料；作為飼料添加劑的鐵強(qiáng)化劑；農(nóng)業(yè)上可用作農(nóng)藥，能防治小麥黑穗病，蘋果和梨的疤痂病、果樹的腐爛??；食用級(jí)用作營養(yǎng)增補(bǔ)劑，如鐵質(zhì)強(qiáng)化劑、果蔬發(fā)色劑。fe²⁺與免疫的關(guān)系也比較密切，在提高機(jī)體的免疫力、增加中性白細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的吞噬功能、和增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力的同時(shí)，亞鐵離子對(duì)呼吸道有刺激性，吸入引起咳嗽和氣短，對(duì)眼睛、皮膚和粘膜有刺激性；誤服引起虛弱、腹痛、惡心、便血、肺及肝受損、休克、昏迷等，嚴(yán)重者可致死。因此，fe²⁺含量的檢測(cè)具有重要理論和實(shí)踐意義。盡管近年來fe²⁺的分析手段取得了較大進(jìn)展，設(shè)計(jì)并提出了不同的分析方法，如熒光光譜法、液相色譜法、電分析方法等。但是，這些方法中大多數(shù)測(cè)試過程復(fù)雜，包括繁瑣的實(shí)驗(yàn)程序、樣品預(yù)處理難，靈敏度及選擇性不高，耗時(shí)長，所需的儀器價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，限制檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用。

比色檢測(cè)的方法，以其實(shí)驗(yàn)成本低，操作過程簡(jiǎn)單，尤其是可以通過裸眼代替復(fù)雜昂貴的分析儀器進(jìn)行檢測(cè)，已引起國內(nèi)外越來越多的學(xué)者的關(guān)注。如寧波大學(xué)危晶等人發(fā)明的“一種快速檢測(cè)鉛離子或者亞鐵離子的電增強(qiáng)顯色方法及其裝置”(專利申請(qǐng)?zhí)枺?012102048171)；常州釔金環(huán)保科技有限公司范義春等人發(fā)明的“一種快速檢測(cè)鍍鋅液中亞鐵離子含量的比色方法”(專利申請(qǐng)?zhí)枺?016103018171)；laschuk等(materdesign,2016,107,18)開發(fā)了一種基于tio2的比色傳感材料，裸眼檢測(cè)fe²⁺的檢測(cè)限可達(dá)0.3ppm；等等，充分證明了比色傳感器是一類充滿希望、方便、實(shí)用的fe²⁺離子檢測(cè)方法。

為了進(jìn)一步提高水相中fe²⁺比色檢測(cè)的選擇性和靈敏度，消除紫外及短波長可見光背景吸收的干擾，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種藍(lán)光吸收染料：3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸，將苯胺和萘生色團(tuán)通過偶氮基團(tuán)和氫鍵雙功能基團(tuán)偶聯(lián)，集–so3h,–ohand–n＝n–和氫鍵等多種活性基團(tuán)于一體，不僅穩(wěn)定性大大提高，由于共軛剛性平面的增強(qiáng)，光譜吸收峰明顯紅移到606nm。對(duì)其光譜性能，尤其是對(duì)亞鐵離子選擇性比色傳感性能優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將所設(shè)計(jì)的一種藍(lán)光吸收染料：3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸有效地應(yīng)用到環(huán)境水樣中痕量fe2+離子的比色檢測(cè)上，其他常見的共存離子對(duì)fe²⁺的比色檢測(cè)無干擾，檢測(cè)的線性范圍3.0～190×10^–7mol/l，相關(guān)系數(shù)(r)0.995，檢測(cè)限39nmol/l。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種水溶性長波長吸收染料的制備及其比色法檢測(cè)水環(huán)境中痕量fe²⁺的新方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單，選擇性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可在中性或弱堿性條件下，準(zhǔn)確的用于環(huán)境水樣品中痕量fe2+的定量測(cè)定。

一種長波長吸收比色法檢測(cè)水環(huán)境中痕量fe²⁺的方法，包括以下操作步驟：

1)水溶性顯色劑3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料的制備

分別稱量取0.468g4-氨基-1-萘磺酸于50ml圓底燒瓶中，加入5ml水，10ml乙醇和2mldmf，超聲溶解后置于冰水浴中冷卻，并加入5滴濃鹽酸確保強(qiáng)酸性；緩慢滴加0.152g亞硝酸鈉水溶液2ml,并反應(yīng)30min，冰水浴條件下，加入0.33gn-乙基-n-羥乙基苯胺水溶液5ml，并控制ph為6.6；室溫反應(yīng)2h，抽濾，得粗產(chǎn)物，再經(jīng)乙醇重結(jié)晶3次，得深藍(lán)色晶體；

2)水溶性顯色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取上述深藍(lán)色晶體0.01g，溶于100ml雙重蒸餾水中，配制成濃度為2.41×10^–4mol·l^–1的水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在4℃下避光保存?zhèn)溆茫?/p>

3)fe²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取feso4·7h2o晶體0.0278g，溶于100ml雙重蒸餾水中，配置成濃度為1.0mmoll^–1的fe²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在4℃下保存；

4)環(huán)境水樣的制備

隨機(jī)量取三處環(huán)境的水各1000.0ml，分別依次用孔徑為4μm的微孔過濾膜過濾除去懸浮固體，再通過減壓蒸餾濃縮到10.0ml，得環(huán)境水樣后，分別標(biāo)記為水樣1、水樣2和水樣3，室溫下保存?zhèn)溆茫?/p>

(5)待測(cè)樣品中fe²⁺濃度的測(cè)定

向10ml的容量瓶依次加入濃度為2.41×10^–4mol/l的水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0ml、ph值為9.0的混合磷酸鹽緩沖溶液1.0ml和待測(cè)樣品1.0ml，最后加雙重蒸餾水定容至刻度線，搖勻，試劑空白作參比，1cm比色皿，606nm波長處測(cè)定溶液的吸光度，計(jì)算得待測(cè)樣品中fe²⁺濃度。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中的水溶性顯色劑3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料系通過偶氮基團(tuán)和氫鍵的雙重作用，將生色團(tuán)苯胺和萘基團(tuán)偶聯(lián)起來，不僅具有剛性平面結(jié)構(gòu)，共軛強(qiáng)度大，穩(wěn)定性也大大提高。

優(yōu)選地，所述步驟1)中的顯色劑4-(4-羥基-1-萘基偶氮)苯磺酸比色染料在606nm處有強(qiáng)吸收，吸光系數(shù)3.92×10⁴l·mol^-1·cm^-1。

優(yōu)選地，所述步驟1)中的水溶性顯色劑3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料是在冰水浴(0～5℃)條件下，以對(duì)4-氨基-1-萘磺酸、n-乙基-n-羥乙基苯胺和亞硝酸鈉為原料，攪拌反應(yīng)2h制得。

優(yōu)選地，所述步驟1)中的顯色劑4-(4-羥基-1-萘基偶氮)苯磺酸比色染料是經(jīng)減壓抽濾、洗滌，得粗產(chǎn)品，再用乙醇重結(jié)晶2次提純。

本發(fā)明從反應(yīng)原理入手，討論了體系的溶劑效應(yīng)、ph值、離子強(qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間及共存物質(zhì)的干擾等影響因素，確定了最佳測(cè)試條件：指示劑濃度為2.41×10^-5mol/l，ph值為9.0的混合磷酸鹽緩沖溶液測(cè)試的靈敏度最高。

最佳測(cè)試條件下，本方法能排除其他常見共存離子對(duì)fe²⁺比色檢測(cè)的干擾，采用uv分析儀，甚至裸眼即可對(duì)fe³⁺檢測(cè)，檢測(cè)的線性范圍3.0～190×10^–7mol/l，相關(guān)系數(shù)(r)0.9952，檢測(cè)限39nmol/l，樣品中fe²⁺回收率98.7％～101.5％之間，相對(duì)誤差(rsd)小于3.1％。

本發(fā)明的有益效果，在中性或弱堿性ph條件下即時(shí)對(duì)水環(huán)境中痕量fe²⁺的比色分析檢測(cè)，顯色劑的水溶解性好、穩(wěn)定性高，吸光系數(shù)大，因此對(duì)痕量fe²⁺的比色檢測(cè)靈敏度高，重現(xiàn)性好，同時(shí)該方法使用的波長為606nm長波長的可見光，可有效減少背景干擾吸收的同時(shí)，對(duì)有機(jī)體無傷害，有望用于生物免疫分析、檢測(cè)等領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料合成路線；

圖2為水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料與fe²⁺作用機(jī)理；

圖3為不同溶劑對(duì)痕量檢測(cè)fe²⁺體系吸收光譜的影響；

圖4為ph對(duì)痕量檢測(cè)fe²⁺體系吸收光譜的影響；

圖5為不同的共存離子對(duì)痕量檢測(cè)fe²⁺體系的影響；

圖6為水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料對(duì)痕量檢測(cè)fe²⁺選擇性比色響應(yīng)；

圖7為a為吸光度隨fe²⁺濃度的變化(fromuptodown:0,3,6,12,20,30,45,60,90,110,150,190×10^-7mol·l^-1)及b)線性關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一

(1)水溶性顯色劑3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料的制備

分別稱取0.468g4-氨基-1-萘磺酸于50ml圓底燒瓶中，加入5ml水，10ml乙醇和2mldmf，超聲溶解后置于冰水浴中冷卻，并加入5滴濃鹽酸確保強(qiáng)酸性；緩慢滴加0.152g亞硝酸鈉水溶液2ml,并反應(yīng)30min。冰水浴條件下，加入0.33gn-乙基-n-羥乙基苯胺水溶液5ml，并控制ph為6.6；室溫反應(yīng)2h，抽濾，得粗產(chǎn)物，再經(jīng)乙醇重結(jié)晶3次，得深藍(lán)色晶體，產(chǎn)率86.4％。

ir(kbr),υ(cm^-1):3430-3320(-oh),1624,1578,1526(ar),1376(ar-n(r1r)),1209(s＝o),1120(c-o)；1h-nmr(dmso-d6,500hz)δ(ppm):8.05(s,1h,ar-h),7.74(t,j＝7.5hz,1h,ar-h),7.63(t,j＝7.4hz,1h,ar-h),7.39(d,j＝7.8hz,1h,ar-h),7.30(d,j＝7.7hz,1h,ar-h),6.8(d,j＝6.7hz,1h,ar-h),6.31(d,j＝6.6hz,1h,ar-h),4.79(s,1h,ar-oh),3.6(m,j＝4.9hz,2h,-ch2oh),3.46(m,j＝4.8hz,2h,-ch2),2.09(m,j＝4.9hz,2h,-ch2),1.13(m,j＝4.8hz,3h,-ch3)；元素分析理論值(％)：c62.8,h5.27,n10.99,o20.92；實(shí)測(cè)值：c62.5,h5.35,n10.87,o21.67。

2)水溶性比色染料標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取上述深藍(lán)色晶體0.01g，溶于100ml雙重蒸餾水中，配制成濃度為2.41×10^–4mol·l^–1的水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在4℃下避光保存?zhèn)溆茫?/p>

3)fe³⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取feso4·7h2o晶體0.0278g，溶于100ml雙重蒸餾水中，配置成濃度為1.0mmoll^–1的fe²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在4℃下保存，使用時(shí)稀釋到所需濃度；

4)環(huán)境水樣的制備

隨機(jī)量取三處環(huán)境的水各1000.0ml，分別依次用孔徑為4μm的微孔過濾膜過濾除去懸浮固體，再通過減壓蒸餾濃縮到10.0ml，得環(huán)境水樣分別標(biāo)記為水樣1、水樣2和水樣3，室溫下保存，備用；

5)檢測(cè)條件的優(yōu)化

從反應(yīng)原理入手，討論了溶劑效應(yīng)體系的ph值、及共存物質(zhì)的干擾等影響因素，確定了最佳測(cè)試條件：指示劑濃度為2.41×10^–5mol/l，ph值為9.0的混合磷酸鹽緩沖溶液測(cè)試的靈敏度最高，環(huán)境中常見的共存金屬離子對(duì)檢測(cè)的影響均在誤差范圍內(nèi)。即最佳測(cè)試條件下，fe2+檢測(cè)的線性回歸方程為△a＝5.89×10^–3+1.31×10^–3c(10^–7mol/l)，檢測(cè)的線性范圍3.0～190×10^–7mol/l，相關(guān)系數(shù)(r)0.9952，檢測(cè)限39nmol/l，樣品中fe3+回收率98.7％～101.5％％之間，相對(duì)誤差(rsd)小于3.1％。

(6)待測(cè)樣品中fe2+濃度的測(cè)定

向10ml的容量瓶依次加入經(jīng)稀釋濃度為2.41×10^–4mol/l水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料的標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0ml、ph值為9.0的混合磷酸鹽緩沖溶液1.0ml和待測(cè)樣品1.0ml，最后加水定容至刻度線，搖勻，試劑空白作參比，1cm比色皿，606nm波長處測(cè)定溶液的吸光度，吸光度差值△a＝a0-a，其中a0為標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值，通過回歸方程為△a＝5.89×10^–3+1.31×10^–3c(10^–7mol/l)，計(jì)算得待測(cè)樣品中fe²⁺濃度。

該方法成功的用于對(duì)上述三類環(huán)境樣品中fe2+含量的檢測(cè)，結(jié)果見表1。樣品中fe2+回收率98.7％～101.5％之間，相對(duì)誤差(rsd)小于3.1％。

表1體系對(duì)環(huán)境樣品的檢測(cè)結(jié)果(n＝5)