本發(fā)明涉及指紋圖譜技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜的建立方法，以及利用上述方法建立的金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜。

背景技術(shù)：

指紋圖譜是指某些復(fù)雜物質(zhì)，比如天然本草、某種生物體或某種組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖。

中藥指紋圖譜技術(shù)已涉及眾多方法，包括薄層掃描(TLCS)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)和高效毛細(xì)管電泳法(HPLC)等色譜法以及紫外光譜法(UV)、紅外光譜法(IR)、質(zhì)譜法(MS)、核磁共振法(NMR)和X-射線衍射法等光譜法。其中色譜方法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成為公認(rèn)的三種常規(guī)分析手段。由于HPLC具有分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，天然本草成分絕大多數(shù)可在高效液相色譜儀上進(jìn)行分析檢測(cè)，且已積累較豐富的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，因此高效液相色譜法已成為天然本草指紋圖譜技術(shù)的首選方法。隨著HPLC-MS和GC-MS等聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用，天然本草指紋圖譜技術(shù)更趨完善。

金圣香的中藥配方中突出了“補(bǔ)腎陽(yáng)，益肺氣”的作用，從《本草綱目》和《中國(guó)藥典》的收載的100余種中藥中篩選出補(bǔ)益肺腎、清咽利嗓的中藥。針對(duì)吸煙對(duì)人體的危害，主攻方向?yàn)橐志?、消炎、止咳、祛痰，通過(guò)補(bǔ)肺達(dá)到益腎的目的。從對(duì)煙氣的藥理、藥效、毒理試驗(yàn)及化學(xué)成分分析和人群試驗(yàn)證明，金圣香的配方是經(jīng)過(guò)中醫(yī)藥理論論證和現(xiàn)代科學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的科學(xué)組方。金圣香卷煙天然添加劑由大黃等藥材配伍而成。大黃性苦、寒、無(wú)毒,有瀉熱通腸、調(diào)中化食、涼血解毒、逐瘀通徑、安和五臟的作用；復(fù)配一些具有止咳平喘、生津回甜的天然輔料，金圣香溫腎助陽(yáng)，涼血解毒，瀉熱通腸。用于陽(yáng)痿腎虛，筋骨痿軟、目赤咽腫，小便赤熱屬上述證候者?，F(xiàn)代研究表明金圣香具有增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞抗向氧化功能、保護(hù)細(xì)胞膜、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境等多種生理、生化功能，具有明顯降低卷煙危害的作用及明確的機(jī)理，整體降害效果達(dá)到全國(guó)領(lǐng)先水平。可以說(shuō)，金圣已成為行業(yè)內(nèi)運(yùn)用中草藥草本獨(dú)特中式減害技術(shù)研發(fā)最早、研發(fā)時(shí)間最長(zhǎng)、技術(shù)應(yīng)用最成熟、經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益并舉的中式低害特色卷煙領(lǐng)跑者。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜及其建立方法，且該指紋圖譜建立方法簡(jiǎn)單、快速、有效。

一種金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜，其特征峰為20號(hào)峰大黃酚，其相對(duì)保留時(shí)間為71.825min。

特征峰還包括：相對(duì)保留時(shí)間為2.968min的1號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為4.822min的2號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為17.956min的3號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為19.035min的4號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為22.473min的5號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為23.332min的6號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為24.181min的7號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為24.512min的8號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為25.811min的9號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為33.966min的10號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為34.731min的11號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為40.987min的12號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為42.773min的13號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為44.179min的14號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為48.809min的15號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為54.099min的16號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為60.273min的17號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為62.647min的18號(hào)峰，相對(duì)保留時(shí)間為67.773min的19號(hào)峰。

一種金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：

步驟1，制備金圣卷煙天然添加劑供試品溶液和參照物溶液：提供不同批次的金圣卷煙天然添加劑供試品，分別取一定量的金圣卷煙天然添加劑供試品，加入50v/v％醇溶液稀釋，搖勻，過(guò)濾，取濾液即得供試品溶液；參照物溶液為一定濃度的大黃酚溶液；

步驟2，對(duì)供試品溶液和參照物溶液進(jìn)行高效液相色譜分析；分別精密吸取供試品溶液與參照物溶液各10μL，注入液相色譜儀測(cè)定，記錄80min圖譜；

高效液相色譜條件如下：

流動(dòng)相A和B分別為，乙腈-體積百分比濃度0.1％甲酸溶液或甲醇-體積百分比濃度0.1％甲酸溶液；

流速為0.8mL/min～1.2mL/min；

柱溫為25℃～35℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)為200～400。

優(yōu)選的，步驟1的具體過(guò)程為：取金圣卷煙天然添加劑供試品100μL加50v/v％醇溶液溶解，定容至2mL容量瓶中，搖勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜即得供試品溶液；取大黃酚適量，加50v/v％醇溶液制成每1ml含6.05μg的溶液，即得參照物溶液。

優(yōu)選的，所述醇溶液為50v/v％的甲醇。

優(yōu)選的，高效液相色譜條件，以乙腈為流動(dòng)相A，以體積百分比濃度0.1％甲酸溶液為流動(dòng)相B。

優(yōu)選的，高效液相色譜條件，流速為1.0mL/min。

優(yōu)選的，高效液相色譜條件，柱溫為25℃。

優(yōu)選的，高效液相色譜條件，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。

優(yōu)選的，高效液相色譜條件如下：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A，以體積百分比濃度0.1％甲酸溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0mL/min；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；梯度洗脫的流程為：0～48分鐘，90→66％流動(dòng)相A，10→34％流動(dòng)相B；48～65分鐘，66→18％流動(dòng)相A，34→82％流動(dòng)相B；65～80分鐘，18→0％流動(dòng)相A，82→100％流動(dòng)相B。

本發(fā)明的有益效果是：

1、用本發(fā)明所提供的方法所建立的金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜，能有效地表征金圣卷煙天然添加劑的質(zhì)量，有利于全面監(jiān)控藥物的質(zhì)量；

2、指紋圖譜注重各個(gè)構(gòu)成指紋特征峰的前后順序和相互關(guān)系，注重整體面貌特征，既避免了因測(cè)定個(gè)別化學(xué)成分而判定金圣卷煙天然添加劑質(zhì)量的片面性，又減少了為質(zhì)量達(dá)標(biāo)而人為處理的可能性；

3、該方法具有方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明供試品溶劑的選擇試驗(yàn)所獲得的色譜圖；

圖2為本發(fā)明檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇試驗(yàn)所獲得的色譜圖；

圖3為本發(fā)明洗脫系統(tǒng)的選擇試驗(yàn)所獲得的色譜圖；

圖4為本發(fā)明流速的考察試驗(yàn)所獲得的色譜圖；

圖5為本發(fā)明一種實(shí)施例的13批金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜；

圖6為本發(fā)明一種實(shí)施例的金圣卷煙天然添加劑對(duì)照指紋圖譜。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施例以及附圖對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行詳細(xì)描述，實(shí)施例中未注明具體條件者，按照現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行；其中所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為現(xiàn)有的可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

一種金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：

步驟1，制備金圣卷煙天然添加劑供試品溶液和參照物溶液：提供不同批次的金圣卷煙天然添加劑供試品，分別精密吸取金圣卷煙天然添加劑提取液100μL加50v/v％甲醇溶解，定容至2mL容量瓶中，搖勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜即得供試品溶液；取大黃酚適量，加50v/v％甲醇制成每1ml含大黃酚6.05μg的溶液，即得參照物溶液。

步驟2，對(duì)供試品溶液和參照物溶液進(jìn)行高效液相色譜分析；分別精確吸取參照物溶液和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄80分鐘的色譜圖；

金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜測(cè)定的色譜條件為：

以乙腈為流動(dòng)相A，以體積百分比濃度0.1％甲酸溶液為流動(dòng)相B。

流速為1.0mL/min。

柱溫為25℃。

檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。

本實(shí)施中具體建立方法過(guò)程如下：

儀器與試劑:儀器,SHIMADZU LC-2010A、Waters2695HPLC、Agilent1200HPLC和Agilent1100HPLC高效液相色譜儀，檢測(cè)器均為二極管陣列檢測(cè)器(安捷倫公司)Milli-Q超純水儀(密理博公司，法國(guó))XP205型電子天平(十萬(wàn)分之一，瑞士METTLERTOLEDO)；KM-12A型超聲波清洗機(jī)(廣州市科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；

對(duì)照品：大黃酚，批號(hào)：110796-201017，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

試劑：乙腈，色譜純，德國(guó)默克公司；水為超純水；其余試劑均為分析純。

藥品來(lái)源:本發(fā)明用金圣卷煙天然添加劑的批號(hào)分別為090421、090414、090407、090321、090314、090307、090228、090221、090214、090207、091023、090116、090109，金圣卷煙天然添加劑由江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

參照物：大黃酚為金圣卷煙天然添加劑含量測(cè)定的指標(biāo)成分，含量較穩(wěn)定，且在圖譜中保留時(shí)間適中、分離度較好，因此選擇大黃酚作為參照物。

供試品溶液的制備：試驗(yàn)對(duì)不同提取溶劑進(jìn)行了考察，具體操作為：取批號(hào)為090421批的金圣卷煙天然添加劑提取液100μL，加精密加入提取溶劑水、50v/v％甲醇、甲醇，定容至2mL容量瓶中，搖勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜即得供試品溶液，進(jìn)樣分析；結(jié)果表明溶劑為50v/v％甲醇提取效果較優(yōu)，峰型和分離情況較好；結(jié)果如圖1所示。

色譜條件：

一、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇；

除檢測(cè)波長(zhǎng)條件外其他與供試品進(jìn)行色譜檢測(cè)的基本步驟相同。使用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行200-400nm全波長(zhǎng)掃描，并對(duì)等吸收?qǐng)D進(jìn)行分析，提取吸收峰較多的四個(gè)波長(zhǎng)(220、250、270、315nm)下的色譜圖進(jìn)行比較，顯示檢測(cè)波長(zhǎng)能較全面的反映金圣卷煙天然添加劑中的化學(xué)成分，且各色譜峰分離較好，基線平穩(wěn)，因此選擇作為金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜的采集波長(zhǎng)，如圖2所示。

二、流動(dòng)相的選擇；

使用phenomenexluna C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱比較了甲醇-體積百分比濃度0.1％甲酸溶液，乙腈-體積百分比濃度0.1％甲酸溶液為流動(dòng)相的分離效果對(duì)本品指紋圖譜的影響，結(jié)果上述各流動(dòng)相系統(tǒng)所得指紋圖譜中乙腈-水梯度洗脫能使各主要色譜峰達(dá)到較好的分離，因此金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜流動(dòng)相選擇乙腈-體積百分比濃度0.1％甲酸系統(tǒng)；如圖3所示。

三、柱溫的考察；在同一條件下考察柱溫對(duì)各組分的影響，結(jié)果以25℃時(shí)所得指紋圖譜中峰形和分離度較好。

四、流速的考察；試驗(yàn)比較了流速為0.8mL/min、1mL/min、1.2mL/min所得圖譜，結(jié)果流速為1mL/min時(shí)所得指紋圖譜的分離情況和峰形較好；如圖4所示。綜上所述，金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜檢測(cè)條件確定為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(色譜柱：phenomenexluna C₁₈，4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以體積百分比濃度為0.1％甲酸為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；柱溫為25℃。

分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄80min圖譜，即得。

方法學(xué)驗(yàn)證：精密度實(shí)驗(yàn):取批號(hào)為090421批的金圣卷煙天然添加劑，按照供試品進(jìn)行色譜檢測(cè)的基本步驟進(jìn)行檢測(cè)，精密吸取供試品10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各共有色譜峰的保留時(shí)間和積分面積，通過(guò)相似度軟件，考察色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間、峰面積比值的一致性。結(jié)果見表1，結(jié)果表明方法采用的HPLC儀器及整體系統(tǒng)精密度良好，分析結(jié)果穩(wěn)定、可信。

如下表1所示，金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜精密度考察結(jié)果

表1

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取批號(hào)為090421批的金圣卷煙天然添加劑，按照供試品進(jìn)行色譜檢測(cè)的基本步驟進(jìn)行檢測(cè)，同一供試品溶液分別于0h、1h、2h、4h、8h、12h和24h進(jìn)色譜分析，記錄指紋色譜圖譜，共測(cè)定7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)相似度軟件，考察色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間、峰面積比值的一致性。結(jié)果見表2。結(jié)果表明樣品在常溫實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定性較好，在24h時(shí)間能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)可靠。

如下表2所示，金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜穩(wěn)定性考察結(jié)果

表2

重復(fù)性試驗(yàn)：取批號(hào)為090421批的金圣卷煙天然添加劑，按照供試品進(jìn)行色譜檢測(cè)的基本步驟進(jìn)行檢測(cè)，同法制備供試品溶液6份，依法測(cè)定?？疾焐V峰的相對(duì)保留時(shí)間、峰面積比值的一致性。結(jié)果見表3。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

如下表3所示，金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜重現(xiàn)性考察結(jié)果

表3

以上方法學(xué)考察結(jié)果，表明該方法測(cè)定金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均較好，能夠準(zhǔn)確測(cè)定該制劑的指紋圖譜。金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜的建立：13批金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜的檢測(cè)；取13批金圣卷煙天然添加劑樣品，按照供試品進(jìn)行色譜檢測(cè)的基本步驟進(jìn)行檢測(cè)，不同批次的金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜見圖5。

對(duì)照指紋圖譜的獲得及共有峰的確定；上述13批樣品用藥典委員會(huì)提供的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算相似度，生成對(duì)照指紋圖譜，選擇13批樣品指紋圖譜中均存在的色譜峰作共有峰。見圖6。13批金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜相似度計(jì)算；采用對(duì)照指紋圖譜用藥典委員會(huì)提供的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算13批金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜相似度，結(jié)果見表4。

如下表4所示，13批金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜相似度結(jié)果；

表4

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，以對(duì)照指紋圖譜為參照計(jì)算相似度，13批金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜相似度均在0.95以上，因此暫定金圣卷煙天然添加劑指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)為：供試品圖譜應(yīng)與對(duì)照指紋圖譜一致，按中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜經(jīng)相似度計(jì)算，相似度不得低于0.90。

以上實(shí)施例僅為本發(fā)明的示例性實(shí)施例，不用于限制本發(fā)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍由權(quán)利要求書限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明做出各種修改或等同替換，這種修改或等同替換也應(yīng)視為落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。