本發(fā)明涉及一種檢測(cè)鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼基底及其制備和使用方法，屬于細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

那西肽又名諾西肽、諾肽菌素或諾肽霉素，是含硫多肽類(lèi)抗生素，由法國(guó)科學(xué)家于1961年在streptomycesactlloslzs40037發(fā)酵液中首次發(fā)現(xiàn)，隨后在阿根廷的土壤中獲得一株合成那西肽的菌株，它對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌，特別是金葡萄菌、鏈球菌和魏氏梭狀芽孢桿菌敏感，通過(guò)阻礙細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成，阻抑了細(xì)菌生長(zhǎng)，因此可防治呼吸道疾病和壞死性腸炎。目前，很多國(guó)家和地區(qū)(如歐盟、日本、中國(guó)臺(tái)灣等地區(qū))允許把那西肽作為飼料添加劑使用，1998年我國(guó)批準(zhǔn)那西肽為國(guó)家三類(lèi)新獸藥，它具有明顯的促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)及改善飼料利用率的作用，在腸道內(nèi)不易吸收，排除體外可迅速分解，而且用量低，殘留量少，對(duì)環(huán)境影響小，屬于安全性較高的環(huán)保型飼料添加劑。目前，合成那西肽的方法主要分為活躍鏈霉菌發(fā)酵法和化學(xué)合成法，兩者相比，發(fā)酵法成本低廉，純度低，那西肽成品中混有鏈霉菌菌絲，而化學(xué)合成法成本較高，純度也高，成品中不含鏈霉菌菌絲。有廠家為了節(jié)約成本，用鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)那西肽，以次充好，謊稱(chēng)是化學(xué)合成法合成的那西肽。因此，發(fā)明一種可用于檢測(cè)鏈霉菌菌絲的方法來(lái)區(qū)分發(fā)酵法和化學(xué)合成法合成的那西肽刻不容緩。

目前，微生物的檢測(cè)方法主要有培養(yǎng)染色觀察法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和質(zhì)譜法，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法一般需要經(jīng)過(guò)富集、分離培養(yǎng)、染色或者生化鑒定等步驟，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大，一般需要4～7天才能出檢測(cè)結(jié)果，免疫學(xué)方法具有特異性好、敏感度高的優(yōu)點(diǎn)，但由于微生物血清型復(fù)雜，檢測(cè)中常出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果需要其他試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。近年來(lái)，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)的分子生物學(xué)技術(shù)由于特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)發(fā)展非常迅速，但是某些微生物會(huì)產(chǎn)生腐殖酸，抑制pcr反應(yīng)，造成假陽(yáng)性的結(jié)果。質(zhì)譜的方法進(jìn)行微生物檢測(cè)特異性強(qiáng)，靈敏度高，但是成本較高，不適合進(jìn)行大批量樣品的檢測(cè)。

針對(duì)上述問(wèn)題的解決方案是發(fā)明一種成本低廉、檢測(cè)快速、簡(jiǎn)單可行的檢測(cè)基底及檢測(cè)方法，鑒于上述微生物檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展，本發(fā)明提出一種那西肽預(yù)混劑中鏈霉菌菌絲的檢測(cè)基底及其制備和使用方法。它不僅使試劑的消耗降低，且使實(shí)驗(yàn)速度提高，費(fèi)用降低，充分體現(xiàn)了當(dāng)今實(shí)驗(yàn)室設(shè)備微型化的發(fā)展趨勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明的目的是提供一種鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼檢測(cè)基底，該基底成本低廉、樣品需要量少、檢測(cè)速度快、靈敏度高、檢測(cè)簡(jiǎn)單。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種鏈霉菌菌絲的檢測(cè)基底的制備方法，該方法制備簡(jiǎn)單。

本發(fā)明的另一目的是提供一種鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼檢測(cè)的使用方法，用于鏈霉菌菌絲的快速檢測(cè)，操作方便，成本低廉。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種檢測(cè)鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼基底，該基底由下至上分別為濾膜層、單分散納米粒子層和鍍金屬層，且各層之間以自然堆疊方式進(jìn)行連接。

其中：

所述的濾膜層的濾孔孔徑為100～450nm，其材料是尼龍微孔濾膜、硝酸纖維素濾膜或普通濾紙；所述的鍍金屬層為鍍銀層、鍍金層或者鍍銅層。

所述的單分散納米粒子層中納米粒子的粒徑為100～500nm，且比濾膜層的濾孔孔徑大；所述的單分散納米粒子層為單層或多層。

所述的單分散納米粒子層中的納米粒子為二氧化硅納米粒子、聚苯乙烯納米粒子、聚甲基丙烯酸甲酯納米粒子、二氧化鈦納米粒子、硅納米粒子或水凝膠納米粒子。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼基底的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、以濾膜層為底層，通過(guò)可拆卸濾器將納米粒子溶液過(guò)濾至濾膜層上，納米粒子在濾膜層上自組裝形成有序結(jié)構(gòu)，得到單分散納米粒子層；

步驟二、將金納米粒子溶液利用可拆卸濾器過(guò)濾至步驟一得到的單分散納米粒子層上，在單分散納米粒子層表面上通過(guò)物理吸附作用得到金納米粒子層；

步驟三、以上述金納米粒子層中金納米粒子為核，通過(guò)電鍍沉積法、無(wú)電解電鍍沉積法或電子束蒸鍍沉積法在其上生長(zhǎng)金屬，制得鍍金屬層，得到檢測(cè)鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼基底；其中，當(dāng)鍍金屬層為鍍金層和鍍銀層時(shí)，采用電鍍沉積法、無(wú)電解電鍍沉積法或電子束蒸鍍沉積法，當(dāng)鍍金屬層為鍍銅層時(shí)采用電鍍沉積法。

其中：

所述的可拆卸濾器的直徑為1～10cm，所述的濾膜層的直徑為1～10cm，且比可拆卸濾器的直徑??；所述金納米粒子溶液中的金納米粒子的粒徑為1～50nm，所述的納米粒子溶液為二氧化硅納米粒子溶液、聚苯乙烯納米粒子溶液、聚甲基丙烯酸甲酯納米粒子溶液、二氧化鈦納米粒子溶液、硅納米粒子溶液或水凝膠納米粒子溶液。

步驟一所述過(guò)濾的具體步驟如下：將濾膜層置于可拆卸濾器中，通過(guò)注射器將納米粒子溶液注入可拆卸濾器中，在濾膜層上自組裝形成有序結(jié)構(gòu)，得到單分散納米粒子層。

步驟三所述的無(wú)電解電鍍沉積法的具體步驟為：取出覆蓋有金納米粒子層的濾膜，烘干后將其浸入等體積混合有無(wú)電解電鍍a液和無(wú)電解電鍍b液的混合液中反應(yīng)1～60min，以金納米粒子層中金納米粒子為核生長(zhǎng)金屬，制得鍍金屬層，得到檢測(cè)鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼基底；當(dāng)鍍金屬層為鍍金層時(shí)，無(wú)電解電鍍a液由0.1～10g/ml的氯化鈉溶液與0.1～10wt％的氯金酸溶液按照體積比1:1～1:10混勻而成，無(wú)電解電鍍b液每100ml中含有0.1～10g酒石酸鉀鈉、1～20g氫氧化鈉、1～30ml乙醇，剩余成分為去離子水；當(dāng)鍍金屬層為鍍銀層時(shí)，無(wú)電解電鍍a液為硝酸銀與1～10vol％氨水按照質(zhì)量體積比1:1～1:100混合得到的溶液，無(wú)電解電鍍b液1～50wt％酒石酸鉀鈉溶液。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼基底的使用方法，將上述檢測(cè)鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼基底用于檢測(cè)那西肽成品中的鏈霉菌菌絲，具體步驟如下：

步驟1、將那西肽預(yù)混劑置于1000～10000rpm的條件下離心1～30min，或者室溫下靜置0.5～5h，得到樣品溶液；

步驟2、將步驟1得到的樣品溶液滴加在所述的檢測(cè)鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼基底上，靜置反應(yīng)1～60min，得到待檢測(cè)樣品；

步驟3、用拉曼光譜儀對(duì)待檢測(cè)樣品進(jìn)行拉曼檢測(cè)，當(dāng)分析激光照射待檢測(cè)樣品后得到拉曼光譜，之后對(duì)拉曼光譜進(jìn)行分析，得出檢測(cè)結(jié)果。

所述的拉曼光譜儀為手持式拉曼光譜儀、共聚焦顯微拉曼光譜儀或共振顯微拉曼光譜儀。

所述將樣品溶液滴加在所述的檢測(cè)鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼基底上使用的工具為微量移液器。

所述分析激光的波長(zhǎng)為785nm。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、基底制備簡(jiǎn)單，與一般的鏈霉菌菌絲檢測(cè)方法相比，該基底制備簡(jiǎn)單、成本低廉，避免了抗體檢測(cè)、pcr檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)中存在的抗體易失活、pcr假陽(yáng)性和質(zhì)譜檢測(cè)成本昂貴等缺點(diǎn)。

2、樣品需要量少、檢測(cè)速度快、靈敏度高：由于檢測(cè)反應(yīng)只在基底上進(jìn)行，基底對(duì)樣品溶液有過(guò)濾濃縮的效果，因此，檢測(cè)前樣品無(wú)需濃縮預(yù)處理，需要的待測(cè)樣品較少，縮短檢測(cè)時(shí)間；同時(shí)，檢測(cè)反應(yīng)以具有鍍有金屬層的單分散納米粒子層為載體，比表面積大，檢測(cè)靈敏度高；鍍金屬層與菌絲之間的間隙在亞微米級(jí)，在亞微米級(jí)的間隙內(nèi)形成熱點(diǎn)，對(duì)菌絲的拉曼光譜有增強(qiáng)效果，可以顯著提高菌絲的拉曼信號(hào)。

3、檢測(cè)簡(jiǎn)單、操作方便、成本低廉：由于基底可以剪裁成任意大小，將基底剪裁成共聚焦顯微拉曼的光斑大小，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)光斑大小范圍內(nèi)樣品所含菌絲的檢測(cè)，不用在基底上尋找菌絲確切位置，簡(jiǎn)化了操作難度；可擴(kuò)展性高：由于采用了可剪裁的濾膜基底，可以方便地進(jìn)行不同樣品檢測(cè)基底的集成，可以一次性同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，促進(jìn)了分析系統(tǒng)的微型化和集成化。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中檢測(cè)鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼基底的制備流程圖；

圖2為本發(fā)明中檢測(cè)鏈霉菌菌絲的增強(qiáng)拉曼基底工作原理示意圖；

圖中有：濾膜層1、單分散納米粒子層2、鍍金屬層3、微量移液器4、拉曼光譜儀5、分析激光6、拉曼光譜7、待檢測(cè)樣品8。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提出了一種那西肽預(yù)混劑中鏈霉菌菌絲的檢測(cè)基底及其制備和使用方法，該檢測(cè)基底由下至上分別為濾膜層1、單分散納米粒子層2、和鍍金屬層3；該檢測(cè)基是通過(guò)過(guò)濾的方法在濾膜上組裝光子晶體基底，然后通過(guò)電鍍?cè)诨妆砻驽兘饘僦苽?，基底通過(guò)共聚焦顯微拉曼進(jìn)行那西肽預(yù)混劑中的鏈霉菌菌絲特征拉曼光譜的檢測(cè)。

實(shí)施例1：制備尼龍微孔濾膜多層二氧化硅鍍銀拉曼檢測(cè)基底

1、首先，將1～100ml的100～500nm直徑的二氧化硅納米粒子溶液通過(guò)注射器注入到直徑大小為1～10cm的可拆卸濾器中，在可拆卸濾器內(nèi)的直徑1～10cm、濾孔孔徑為100～450nm(比二氧化硅納米粒子粒徑小)之間的尼龍微孔濾膜上組裝成多層有序結(jié)構(gòu)，得到單分散二氧化硅納米粒子層；

2、將1～50ml事先制備的粒徑為1～50nm的金納米粒子溶液注入到濾器內(nèi)，過(guò)濾到二氧化硅納米粒子表面，得到金納米粒子層；

3、取出覆蓋有金納米粒子層的尼龍微孔濾膜，置于熱臺(tái)上烘干，之后將其浸入無(wú)電解電鍍銀a液(1～20g硝酸銀，1～50ml氨水，10～1000ml去離子水)和b液(1～100g酒石酸鉀鈉，1～1000ml去離子水)等體積混合的溶液中鍍銀1～60min，得到檢測(cè)鏈霉菌菌絲的尼龍微孔濾膜多層二氧化硅鍍銀基底。

實(shí)施例2：檢測(cè)染料4-atp的拉曼光譜

1、將事先制備的尼龍微孔濾膜多層二氧化硅鍍銀基底剪裁成尺寸為3mm×3mm的基底；

2、用微量移液器取5μl、10^-3～10^-12m的4-atp染料，滴加到上述基底上，接著共聚焦顯微拉曼進(jìn)行4-atp特征拉曼光譜的檢測(cè)，得到染料4-atp的拉曼光譜；

3、反應(yīng)完畢，將使用過(guò)的基底丟棄，基底為一次性使用基底。

實(shí)施例3：檢測(cè)染料r6g的拉曼光譜

1、將事先制備的尼龍微孔濾膜多層二氧化硅鍍銀基底剪裁成尺寸為3mm×3mm的基底；

2、用微量移液器取5μl、10^-3～10^-12m的r6g染料，滴加到上述基底上，接著共聚焦顯微拉曼進(jìn)行r6g特征拉曼光譜的檢測(cè)，得到染料r6g的拉曼光譜；

3、反應(yīng)完畢，將使用過(guò)的基底丟棄，基底為一次性使用基底。

實(shí)施例4：分別檢測(cè)發(fā)酵方法、化學(xué)方法制備的那西肽預(yù)混劑中是否含有鏈霉菌菌絲

1、將事先制備的尼龍微孔濾膜多層二氧化硅鍍銀基底剪裁成尺寸為3mm×3mm的基底；

2、用微量移液器取5μl在10000rpm條件下離心10min的發(fā)酵方法制備(或者化學(xué)方法制備)的那西肽預(yù)混劑樣品，滴加到上述基底上，接著共聚焦顯微拉曼進(jìn)行鏈霉菌菌絲特征拉曼光譜的檢測(cè)，得到發(fā)酵方法制備(或者化學(xué)方法制備)的那西肽預(yù)混劑的拉曼光譜，通過(guò)與鏈霉菌菌絲特征光譜比對(duì)得到分析結(jié)果；

3、反應(yīng)完畢，將使用過(guò)的基底丟棄，基底為一次性使用基底。