本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫診斷領(lǐng)域，具體地，涉及一種血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：1976年rosenthal等人從血清中分離出一種相對(duì)分子量約12000且與組織淀粉樣蛋白a具有相似的免疫原性的高度異質(zhì)性蛋白，研究表明該物質(zhì)是組織淀粉樣蛋白a的前體，因此該類蛋白稱為血清淀粉樣蛋白a(serumamyloida，簡(jiǎn)稱saa)。saa的合成基因位于第11號(hào)染色11p15.1的短臂上，跨度為150kd。saa主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生，同是肝外細(xì)胞也有體質(zhì)性表達(dá)。在機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)或感染急性期時(shí)，在48～72小時(shí)內(nèi)由巨噬細(xì)胞釋放的白細(xì)胞介素(il)-1和腫瘤壞死因子(tnf)協(xié)同作用增加il-6的分泌，進(jìn)一步刺激肝細(xì)胞大量表達(dá)saa，同時(shí)受到糖皮質(zhì)激素的調(diào)控，當(dāng)saa進(jìn)入血漿后迅速與高密度脂蛋白(hdl)結(jié)合，代替apoa-i成為急性期hdl的主要載脂蛋白。與crp類似，saa是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，用以評(píng)估急性相反應(yīng)進(jìn)程；當(dāng)機(jī)體受到感染、炎癥、外傷和腫瘤的刺激后，肝細(xì)胞大量分泌saa并釋放入血液中，隨著機(jī)體的炎性反應(yīng)發(fā)展，在5～6小時(shí)內(nèi)血清中的saa濃度迅速升高約1000倍，絕對(duì)高于同期的crp濃度；由于crp的正常水平的中位數(shù)值與參考范圍上限的差距約有10倍，而在saa中僅有5倍，故在敏感性上saa要高于crp；同時(shí)saa的半衰期僅50min，當(dāng)機(jī)體的炎性反應(yīng)得到控制后，saa迅速恢復(fù)到正常水平，從而使saa成為目前最敏感的急性炎癥新標(biāo)志物之一。透射免疫比濁法，是基于分光光度法原理，測(cè)定在反應(yīng)液中檢測(cè)樣本的抗原與特異性抗體免疫結(jié)合產(chǎn)生的濁度，依據(jù)朗伯比爾定律計(jì)算樣本中檢測(cè)物的含量。當(dāng)一定波長(zhǎng)的光沿著水平軸照射，遇到抗原抗體結(jié)合的免疫份子，光源的透射強(qiáng)度減弱，透射光的強(qiáng)度變化與抗原抗體的免疫分子含量成正比。但由于免疫比濁法的測(cè)定靈敏度達(dá)不到臨床要求，故使用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法。其原理是首先將抗體與膠乳微球交聯(lián)，當(dāng)遇到相應(yīng)的抗原時(shí)，因抗原抗體結(jié)合遭遇出現(xiàn)膠乳凝集；因單個(gè)膠乳微球的大小在入射光波長(zhǎng)內(nèi)，可以使光線透過(guò)；當(dāng)兩個(gè)或兩個(gè)以上的膠乳微球凝集在一塊時(shí)，使透射光減弱且減弱的程度與膠乳微球凝集的程度成正比，亦與抗原含量成正比。在我國(guó)獸醫(yī)臨床應(yīng)用上，對(duì)動(dòng)物的炎性感染的診斷僅有crp的測(cè)定試劑盒，但由于crp在動(dòng)物中濃度極低，當(dāng)crp升高并被檢測(cè)時(shí)，機(jī)體受到炎性反應(yīng)或感染的時(shí)間較長(zhǎng)，而saa作為新的炎癥標(biāo)志物之一，無(wú)論檢測(cè)窗口期比crp要早，還是敏感性上在優(yōu)于crp，因此檢測(cè)saa可以快速診斷動(dòng)物的感染程度，輔助并指導(dǎo)獸醫(yī)用藥。目前已知測(cè)定的血清淀粉樣蛋白a的試劑盒極少，尚未得到推廣及應(yīng)用，同時(shí)由于其他方法上也存在操作繁瑣、產(chǎn)品靈敏度低和產(chǎn)品不穩(wěn)定等特點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了提供一種操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性好的用于血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒及其制備方法。本發(fā)明第一方面提供一種血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑r1和試劑r2雙液體組分，其中，試劑r1組分包括緩沖液1；試劑r2組分包括緩沖液2和saa抗體納米膠乳微球。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述saa抗體包括多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選地，所述膠乳微球的表面經(jīng)過(guò)-cooh修飾，更優(yōu)選地，所述膠乳微球的顆粒直徑在80～300nm之間，更優(yōu)選地，所述saa抗體膠乳微球濃度為0.5～2％w/v。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述緩沖液1和緩沖液2為本領(lǐng)域常見(jiàn)的各種緩沖液，其中緩沖液1和緩沖液2可以相同，也可以不同；優(yōu)選地，所述的緩沖液1和緩沖液2各自獨(dú)立選用pbs緩沖液、tris-hcl緩沖液、mopso緩沖液、甘氨酸緩沖液、2-嗎啉乙磺酸(mes)緩沖液、甘氨酸-磷酸鹽緩沖液和hepes緩沖液以及其他具有相似性質(zhì)的緩沖液中的一種或多種；更優(yōu)選地，所述緩沖液1和緩沖液2的濃度分別為10～50mmol/l；更優(yōu)選地，所述的緩沖液1和緩沖液2的ph值各自為6.0～8.0。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑r1組分還包括促凝劑和表面活性劑的至少一種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述促凝劑為不同聚合度的聚乙二醇(peg)或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)中的一種或兩種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述聚乙二醇為peg-4000、peg-6000、peg-8000、peg-10000、peg-20000的一種或多種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述聚乙烯吡咯烷酮為pvpk-17、pvpk-30、pvpk-60和pvpk-90的一種或多種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述促凝劑的濃度為0.2％～2.5％w/v。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述表面活性劑為陽(yáng)離子型表面活性性劑、陰離子型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑和非離子型表面活性劑中的一種或多種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述陽(yáng)離子表面活性劑為胺鹽陽(yáng)離子表面活性劑、季銨鹽陽(yáng)離子表面活性劑和雜環(huán)型陽(yáng)離子表面活性劑中的一種或多種，優(yōu)選地，所述胺鹽陽(yáng)離子表面活性劑為脂肪胺鹽、乙醇胺鹽和聚乙烯多胺鹽中的一種或多種；所述季銨鹽陽(yáng)離子表面活性劑的通式如式(i)所示：式中rl、r2、r3、r4是甲基、乙基、芐基或長(zhǎng)鏈烷基，x-是cl-、br-、i-、hso4-，rcoo-及oh-或其他陰離子基團(tuán)；所述雜環(huán)型陽(yáng)離子表面活性劑為咪唑啉、嗎啉胍類、三嗪類衍生物中的一種或多種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述陰離子表面活性劑為具有酰胺基或酯基的磺酸鹽陰離子表面活性劑、羧酸鹽類陰離子表面活性劑和磷酸鹽類陰離子表面活性劑的一種或多種，優(yōu)選地，所述陰離子表面活劑性選自下列化合物的堿金屬鹽、銨鹽、胺鹽、氨基醇鹽或堿土金屬鹽：烷基硫酸鹽、烷基醚硫酸鹽、烷基酰胺基醚硫酸鹽、烷基芳基聚醚硫酸鹽、甘油—硫酸酯鹽；烷基磺酸鹽、烷基磷酸鹽、烷基酰胺磺酸鹽、烷基芳基磺酸鹽、a-烯烴磺酸鹽、鏈烷烴磺酸鹽；烷基磺基琥珀酸鹽、烷基醚磺基琥珀酸鹽、烷基酰胺磺基琥珀酸鹽；烷基磺基乙酸鹽；?；“彼猁}；和酰基谷氨酸鹽，所有這些化合物的烷基和?；?至22個(gè)碳原子，且所述的芳基表示苯基或芐基；聚葡糖苷羧酸的c6-c24烷基酯；烷基磺化琥珀酰胺酸酯，酰基羥乙磺酸鹽和n-?；；撬狨?，所有這些化合物的烷基或?；?2至20個(gè)碳原子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述兩性離子表面活性劑為(c8-c24)烷基酰胺基(c3-c8)烷基甜菜堿、磺基三甲銨乙內(nèi)酯、(c8-c24)烷基酰胺基(c6-c8)烷基磺基三甲銨乙內(nèi)酯、(c8-c24)烷基兩性一乙酸酯、(c8-c24)烷基兩性二乙酸酯、(c8-c24)烷基兩性一丙酸酯、(c8-c24)烷基兩性二丙酸酯和磷甜菜堿(請(qǐng)確認(rèn)或補(bǔ)充)中的一種或多種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述非離子型表面活性劑為的聚氧乙烯型非離子型表面活性劑和多元醇型非離子型表面活性劑中的一種或多種，優(yōu)選地，所述聚氧乙烯型非離子型表面活性劑為烷基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、脂肪酸甲酯乙氧基化物、聚丙二醇的環(huán)氧乙烷加成物的一種或多種，所述多元醇型非離子型表面活性劑為失水山梨醇酯、蔗糖酯、烷基醇酰胺中的一種或多種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述表面活性劑為吐溫-20、吐溫-80、brij35、十二烷基硫酸鈉、tritonx-100中的一種或幾種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述表面活性劑的濃度為0.1～2％w/v在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述表面活性劑的親水親油平衡值大于8.0。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑r2組分還包括穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述穩(wěn)定劑為蛋白質(zhì)、糖或無(wú)機(jī)鹽中的一種或多種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)為小牛血清白蛋白(bsa)、新生小牛血清(nbs)、酪蛋白或明膠中的一種或多種；在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述糖為蔗糖、海藻糖或甘露糖中的一種或多種；在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉中的一種或多種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述穩(wěn)定劑的濃度為0.2～2％w/v在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑r2組分和/或試劑r2組分還包括防腐劑。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述防腐劑可以相同，也可以不同；優(yōu)選地，所述防腐劑為山梨酸鈉、苯酚、苯甲酸鈉、疊氮鈉、proclin-300、硫柳汞中的一種或多種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述防腐劑的濃度為0.01～0.1％w/v。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑r1組分包括：所述試劑r2組分包括：在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑rl與所述試劑r2的體積比為1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒進(jìn)一步包括校準(zhǔn)品。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述校準(zhǔn)品中含有血清淀粉樣蛋白a抗原和稀釋液，優(yōu)選地，所述稀釋液中含有10mmol/l磷酸鹽緩沖液、0.01～0.1％w/v的疊氮鈉和0.5～3％w/v的bsa。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述校準(zhǔn)品包括若干支不同濃度的血清淀粉樣蛋白a抗原。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述校準(zhǔn)品的濃度水平數(shù)量為5～11個(gè)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述校準(zhǔn)品的系列濃度覆蓋0～100mg/l范圍并呈梯度。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述不同濃度的血清淀粉樣蛋白a校準(zhǔn)品中血清淀粉樣蛋白a抗原的濃度依次為0mg/l、6.3mg/l、12.6mg/l、25.2mg/l、50.3mg/l、100.6mg/l，或者依次為0mg/l、10mg/l、25mg/l、50mg/l、75mg/l、100mg/l。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述校準(zhǔn)品與試劑rl和試劑r2的總體積的體積比在1:5到1:100之間，優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品與試劑rl和試劑r2的總體積的體積比為1:5、1:20、1:30、1:35、1:50、1:80、1:100中的一種，優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品與試劑rl和試劑r2的總體積的體積比為1:48。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒用于測(cè)定動(dòng)物樣品中的血清淀粉樣蛋白a的濃度。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述樣品為血清、血漿或全血.在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述動(dòng)物為貓科動(dòng)物。本發(fā)明第二方面提供一種血清淀粉樣蛋白a的測(cè)定試劑盒的制備方法，包括如下步驟：(a)制備r1試劑各組分，制得r1試劑；(b)制備saa抗體膠乳微球及r2試劑其他各組分，制得r2試劑。其中，所述saa抗體膠乳微球通過(guò)以下的步驟制備得到：(a)將經(jīng)過(guò)功能基團(tuán)修飾的膠乳微球加入活化緩沖液中；(b)加入活化交聯(lián)劑進(jìn)行活化；(c)加入saa抗體進(jìn)行交聯(lián)；(d)加入膠乳封閉液封閉殘留活化位點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述saa抗體包括多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選地，所述膠乳微球的表面經(jīng)過(guò)-cooh修飾，更優(yōu)選地，所述膠乳微球的顆粒直徑在80～300nm之間。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述活化緩沖液為1～10mmol/l、ph＝4～6的2-嗎啉乙磺酸緩沖液；在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述活化交聯(lián)劑中含有0.01～0.1％w/v的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.01～0.1％w/vn羥基琥珀酰胺；在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的膠乳封閉液中包括但不限于：0.2～2％w/v的穩(wěn)定劑2、10～50mmol/l的緩沖液3、0.01～0.1％w/v的防腐劑，優(yōu)選地，所述的緩沖液3選自pbs緩沖液、甘氨酸緩沖液、2-嗎啉乙磺酸(mes)緩沖液甘氨酸-磷酸鹽緩沖液、tris-鹽酸鹽緩沖液和hepes緩沖液以及其他具有相似性質(zhì)的緩沖液中的一種或多種，更優(yōu)選地，所述的緩沖液3的ph值為6.0～8.0。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，按照上述步驟制備所述saa單克隆抗體納米膠乳微球標(biāo)記液時(shí)，所述活化時(shí)間為1～2小時(shí)；所述的交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為2～4小時(shí)；優(yōu)選地，所述活化和交聯(lián)的步驟均在37℃下進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在加入活化交聯(lián)劑進(jìn)行活化完成后，在加入血清淀粉樣蛋白a單克隆抗體進(jìn)行交聯(lián)的步驟前，還需要先通過(guò)離心分離的步驟去掉膠乳微球液中殘留的活化交聯(lián)劑。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)一步包括校準(zhǔn)品的制備方法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行配制校準(zhǔn)品，其中校準(zhǔn)品的配制方法沒(méi)有特殊要求，對(duì)于校準(zhǔn)品的具體數(shù)量和濃度設(shè)置可采用本領(lǐng)域常規(guī)設(shè)計(jì)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述校準(zhǔn)品包括若干支不同濃度的血清淀粉樣蛋白a校準(zhǔn)品；所述血清淀粉樣蛋白a校準(zhǔn)品中含有血清淀粉樣蛋白a抗原和稀釋液；所述稀釋液中含有10mmol/l磷酸鹽緩沖液、0.01～0.1％w/v的疊氮鈉和0.5～3％w/v的bsa。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述校準(zhǔn)品可包括6支不同濃度的血清淀粉樣蛋白a校準(zhǔn)品，優(yōu)選地，6支不同濃度的血清淀粉樣蛋白a校準(zhǔn)品中血清淀粉樣蛋白a抗原濃度可以自行設(shè)定。優(yōu)選地，所述6支不同濃度的血清淀粉樣蛋白a校準(zhǔn)品中血清淀粉樣蛋白a抗原濃度的濃度依次為0mg/l、6.3mg/l、12.6mg/l、25.2mg/l、50.3mg/l、100.6mg/l。優(yōu)選地，所述6支不同濃度的血清淀粉樣蛋白a校準(zhǔn)品中血清淀粉樣蛋白a抗原濃度的濃度依次為0mg/l、10mg/l、25mg/l、50mg/l、75mg/l、100mg/l。附圖說(shuō)明圖1顯示了利用實(shí)施1的血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒測(cè)定saa校準(zhǔn)品得到的濃度-反應(yīng)度校準(zhǔn)曲線。圖2顯示了利用實(shí)施2的血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒測(cè)定saa校準(zhǔn)品得到的濃度-反應(yīng)度校準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式經(jīng)過(guò)深入廣泛的研究，發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)了一種血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒，能夠方便、快速、精確測(cè)定血清淀粉樣蛋白a的濃度。此外，本發(fā)明還意外的發(fā)現(xiàn)了該試劑盒的制備方法。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒在本發(fā)明中，血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑r1和試劑r2雙液體組分，其中，所述試劑r1組分包括：所述試劑r2組分包括：血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒的制備方法在本發(fā)明中，血清淀粉樣蛋白a的測(cè)定試劑盒的制備方法包括如下步驟：(a)制備r1試劑各組分，制得r1試劑；(b)制備saa抗體膠乳微球及r2試劑其他各組分，制得r2試劑。其中，所述saa抗體膠乳微球通過(guò)以下的步驟制備得到：(a)將經(jīng)過(guò)功能基團(tuán)修飾的膠乳微球加入活化緩沖液中；(b)加入活化交聯(lián)劑進(jìn)行活化；(c)加入saa抗體進(jìn)行交聯(lián)；(d)加入膠乳封閉液封閉殘留活化位點(diǎn)。血清淀粉樣蛋白a的測(cè)定方法在本發(fā)明中，血清淀粉樣蛋白a的測(cè)定方法包括以下步驟：(a)使用本發(fā)明提供的血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒測(cè)定校準(zhǔn)品：先將r1試劑加入比色杯中，再加入校準(zhǔn)品后放置于測(cè)定儀中攪拌均勻，然后加入r2試劑，攪拌均勻后測(cè)定吸光度a1，繼續(xù)反應(yīng)后再次測(cè)定吸光度a2，計(jì)算反應(yīng)度δa：δa＝a2-a1；根據(jù)校準(zhǔn)品各個(gè)濃度水平的δa繪制濃度-反應(yīng)度的校準(zhǔn)曲線，并擬合得到回歸方程；(b)使用本發(fā)明提供的血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒測(cè)定待測(cè)樣品，利用步驟(a)的方法測(cè)量得到相應(yīng)的反應(yīng)度，根據(jù)步驟a得到的校準(zhǔn)品的濃度-反應(yīng)度數(shù)據(jù)，計(jì)算待測(cè)樣品中的血清淀粉樣蛋白a的濃度。在本發(fā)明中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行配制校準(zhǔn)品，其中校準(zhǔn)品的配制方法沒(méi)有特殊要求，對(duì)于校準(zhǔn)品的具體數(shù)量和濃度設(shè)置可采用本領(lǐng)域常規(guī)設(shè)計(jì)。在本發(fā)明中，所述校準(zhǔn)品包括若干支不同濃度的血清淀粉樣蛋白a抗原；所述血清淀粉樣蛋白a校準(zhǔn)品中含有血清淀粉樣蛋白a抗原和稀釋液；所述稀釋液中含有10mmol/l磷酸鹽緩沖液、0.01～0.1％w/v的疊氮鈉和0.5～3％w/v的bsa。在本發(fā)明中，所述校準(zhǔn)品可包括6支不同濃度的血清淀粉樣蛋白a校準(zhǔn)品，優(yōu)選地，6支不同濃度的血清淀粉樣蛋白a校準(zhǔn)品中血清淀粉樣蛋白a抗原濃度可以自行設(shè)定。優(yōu)選地，所述6支不同濃度的血清淀粉樣蛋白a校準(zhǔn)品中血清淀粉樣蛋白a抗原濃度的濃度依次為0mg/l、6.3mg/l、12.6mg/l、25.2mg/l、50.3mg/l、100.6mg/l。優(yōu)選地，所述6支不同濃度的血清淀粉樣蛋白a校準(zhǔn)品中血清淀粉樣蛋白a抗原濃度的濃度依次為0mg/l、10mg/l、25mg/l、50mg/l、75mg/l、100mg/l。在本發(fā)明中，步驟a中測(cè)量分析得到校準(zhǔn)曲線中的反應(yīng)度是采用透射比濁法或散射比濁法蛋白分析儀測(cè)量得到。在本發(fā)明中，所述計(jì)算待測(cè)樣品中的血清淀粉樣蛋白a的濃度濃度-反應(yīng)度，是指利用回歸分析方法或插值分析方法計(jì)算，優(yōu)選地，所述濃度-反應(yīng)度校準(zhǔn)曲線是利用線性回歸方法計(jì)算。在本發(fā)明中，所述試劑rl與與所述試劑r2的體積比為1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。在本發(fā)明中，所述待測(cè)樣品與試劑rl和試劑r2的總體積的體積比在1:5到1:100之間，優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品與試劑rl和試劑r2的總體積的體積比為1:5、1:20、1:30、1:35、1:50、1:80、1:100中的一種，優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品與試劑rl和試劑r2的總體積的體積比為1:48。在本發(fā)明中，所述繼續(xù)反應(yīng)時(shí)間為1min、2min、3min、4min或5min。在本發(fā)明中，所述待測(cè)品為動(dòng)物的血清、血漿或全血，優(yōu)選地，所述動(dòng)物為貓科動(dòng)物。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：(1)本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒填補(bǔ)了目前市面上用于膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定貓科動(dòng)物血清淀粉樣蛋白a的測(cè)定試劑的空白，彌補(bǔ)現(xiàn)在國(guó)內(nèi)獸醫(yī)臨床測(cè)定的不足。(2)本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒采用結(jié)合均相免疫的透射比濁法或散射比濁法進(jìn)行測(cè)定，具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。(3)本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒中r2試劑組分saa單克隆抗體納米膠乳微球標(biāo)記液的制備中，所述納米膠乳微球通過(guò)表面的-cooh與血清淀粉樣蛋白a單克隆抗體的-nh3共價(jià)結(jié)合。在此情況下，-cooh納米膠乳微球與抗體的結(jié)合是通過(guò)其表面的-cooh與抗體的-nh3共價(jià)結(jié)合，在微球與抗體之間有1個(gè)橋聯(lián)化學(xué)臂，降低了位阻效應(yīng)，不但提高了抗體的結(jié)合率，還為抗體提供合適的三維空間立方體結(jié)構(gòu)，有效地保護(hù)抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域，提高反應(yīng)的靈敏度。為了使本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中未注明的試劑的配制方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)配制方法。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。本發(fā)明中所涉及的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均可從市售渠道獲得。實(shí)施例1本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑r1和試劑r2雙液體組分，其中：試劑r1組分包括：試劑r2組分包括：實(shí)施例2本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑r1和試劑r2雙液體組分，其中：試劑r1組分包括：試劑r2組分包括：實(shí)施例3本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑r1和試劑r2雙液體組分，其中：試劑r1組分包括：試劑r2組分包括：實(shí)施例4本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白a測(cè)定試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑r1和試劑r2雙液體組分，其中：試劑r1組分包括：試劑r2組分包括：實(shí)施例5一、實(shí)施例1提供的試劑盒的制備方法1、取2ml聚苯乙烯膠乳微球(顆粒直徑150nm，5％w/v)用10mmol/l的ph＝4.5的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至10ml。2、再加入0.1％w/v的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.1％w/vn羥基琥珀酰胺進(jìn)行活化膠乳，37℃孵育1小時(shí)。3、離心活化后的膠乳，并棄去上清(含殘留活化交聯(lián)劑)，加入10ml含有10mmol/l、ph＝7.0磷酸鹽緩沖液、0.05％w/v疊氮鈉和2％w/vbsa的溶液溶解，再加入1mg血清淀粉樣蛋白a單克隆抗體進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，37℃孵育3小時(shí)。4、最后加入1ml含有1％w/v蛋白質(zhì)bsa、1％casein、0.05％w/v疊氮鈉和10mmol/l、ph＝7.0磷酸鹽緩沖液的膠乳封閉液，封閉膠乳表面殘留活化位點(diǎn)，離心并棄去上清，將沉淀溶于20ml含有10mmol/l、ph＝7.0磷酸鹽緩沖液、0.05％w/v疊氮鈉和2％w/vbsa的溶液，使膠乳的終濃度為0.5％w/v，得到r2試劑。5、制備10mmol/l、ph＝7.0磷酸鹽緩沖液1000ml，加入1％w/v的peg-20000、1％w/vtritonx-100、0.05％w/v疊氮鈉，混勻制得r1試劑。二、試劑盒在蛋白分析儀上的應(yīng)用1、將血清淀粉樣蛋白a抗原溶于含10mmol/l、ph＝7.0磷酸鹽緩沖液、0.05％w/v疊氮鈉和2％w/vbsa中，按不同稀釋倍數(shù)配制得到不同濃度的校準(zhǔn)品，分別為0mg/l、6.3mg/l、12.6mg/l、25.2mg/l、50.3mg/l、100.6mg/l。2、待測(cè)樣品來(lái)源于小貓1和小貓2，抽取小貓的血液，離心分離血清備用檢測(cè)。3、首先將r1試劑按標(biāo)準(zhǔn)的量加入比色杯中，再加入上述標(biāo)準(zhǔn)的量的saa校準(zhǔn)品攪拌均勻，再加入標(biāo)準(zhǔn)量的r2試劑進(jìn)行攪拌后立即讀取第一點(diǎn)吸光度a1，繼續(xù)放置至反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后再次讀取第二點(diǎn)的吸光度a2，計(jì)算測(cè)量的反應(yīng)度；反應(yīng)度的計(jì)算由采用透射比濁法原理的特定蛋白分析儀進(jìn)行測(cè)量得到，每個(gè)濃度檢測(cè)5次。測(cè)定步驟：先將400μlr1試劑加入比色杯中，再加入10μl校準(zhǔn)品后放置于測(cè)定儀中攪拌均勻，然后加入80μlr2試劑，攪拌均勻后測(cè)定吸光度a1，繼續(xù)反應(yīng)2min后再次測(cè)定吸光度a2，計(jì)算反應(yīng)度δa：δa＝a2-a1。檢測(cè)5次的結(jié)果分別如下所示。校準(zhǔn)品濃度0mg/l6.3mg/l12.6mg/l25.2mg/l50.3mg/l100.6mg/lδa1-0.00230.04140.0860.18380.33160.5291δa2-0.00080.04180.08760.18250.30940.5485δa3-0.00040.04240.08990.1760.31830.5207δa4-0.0010.04120.09020.18480.32170.5318δa5-0.00140.04230.09370.17720.30680.5415平均值δa-0.001180.041820.089480.180860.317560.534324、將上表1中各校準(zhǔn)品的濃度作橫坐標(biāo)，相應(yīng)的δa平均值作縱坐標(biāo)，以logit-4p四參數(shù)擬合，繪制濃度-反應(yīng)度校準(zhǔn)曲線，如圖1所示。5、同上述測(cè)定步驟測(cè)量待測(cè)品1得到反應(yīng)度δa＝0.4086，然后根據(jù)上述濃度-反應(yīng)度校準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算，待測(cè)品1的saa濃度為68.72mg/l。6、同上述測(cè)定步驟測(cè)量待測(cè)品2得到反應(yīng)度δa＝0.0169，然后根據(jù)上述濃度-反應(yīng)度校準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算，待測(cè)品2的saa濃度為2.62mg/l。實(shí)施例6一、實(shí)施例2提供的試劑盒的制備方法1、取5ml聚苯乙烯膠乳微球(millipore，顆粒直徑300nm，3％w/v)用10mmol/l的ph＝5.5的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至20ml。2、再加入0.05％w/v的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.05％w/vn羥基琥珀酰胺進(jìn)行活化膠乳，37℃孵育2小時(shí)。3、離心活化后的膠乳，并棄去上清(含殘留活化交聯(lián)劑)，加入10ml含有10mmol/l、ph＝7.0磷酸鹽緩沖液、0.05％w/v疊氮鈉和2％w/v的bsa溶解，再加入1.5mg血清淀粉樣蛋白a單克隆抗體進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，37℃孵育4小時(shí)。4、最后加入1ml含有1％w/v海藻糖、0.05％w/vproclin-300和20mmol/l、ph＝7.5甘氨酸-磷酸鹽緩沖液的膠乳封閉液，封閉膠乳表面殘留活化位點(diǎn)，離心并棄去上清，將沉淀溶于20ml含有10mmol/l、ph＝7.0磷酸鹽緩沖液、0.05％w/v疊氮鈉和2％w/v的bsa，使膠乳的終濃度為0.7％，得到r2試劑。5、制備10mmol/l、ph＝8.0tris-鹽酸鹽緩沖液5000ml，加入1％w/v的pvp-k30、0.5％w/v十二烷基硫酸鈉、0.5％w/v吐溫-20、0.05％w/v疊氮鈉，混勻制得r1試劑。二、試劑盒在蛋白分析儀上的應(yīng)用1、將血清淀粉樣蛋白a抗原溶于含10mmol/l、ph＝7.0磷酸鹽緩沖液、0.05％w/v疊氮鈉和2％w/vnbs中，按不同稀釋倍數(shù)配制得到不同濃度的校準(zhǔn)品，分別為0mg/l、10mg/l、25mg/l、50mg/l、75mg/l、100mg/l。2、待測(cè)樣品來(lái)源于小貓1和小貓2抽取小貓的血液，離心分離血清備用檢測(cè)。3、首先將r1試劑按標(biāo)準(zhǔn)的量加入比色杯中，再加入上述標(biāo)準(zhǔn)的量的saa校準(zhǔn)品攪拌均勻，再加入標(biāo)準(zhǔn)量的r2試劑進(jìn)行攪拌后立即讀取第一點(diǎn)吸光度a1，繼續(xù)放置至反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后再次讀取第二點(diǎn)的吸光度a2，計(jì)算測(cè)量的反應(yīng)度；反應(yīng)度的計(jì)算由采用透射比濁法原理的特定蛋白分析儀進(jìn)行測(cè)量得到，每個(gè)濃度檢測(cè)5次。測(cè)定步驟：先將400μlr1試劑加入比色杯中，再加入10μl校準(zhǔn)品后放置于測(cè)定儀中攪拌均勻，然后加入80μlr2試劑，攪拌均勻后測(cè)定吸光度a1，繼續(xù)反應(yīng)2min后再次測(cè)定吸光度a2，計(jì)算反應(yīng)度δa：δa＝a2-a1。檢測(cè)5次的結(jié)果分別如下所示。校準(zhǔn)品濃度0mg/l10mg/l25mg/l50mg/l75mg/l100mg/lδa1-0.00170.07970.17960.31300.42470.5307δa2-0.00090.08030.18050.30730.44080.5418δa3-0.00010.08100.17890.31590.43710.5379δa4-0.00150.07990.18130.31960.43800.5295δa5-0.00070.08370.18200.32400.43290.5361平均值δa-0.00100.08090.18050.31600.43470.53524、將上表2中各校準(zhǔn)品的濃度作橫坐標(biāo)，相應(yīng)的δa平均值作縱坐標(biāo)，以logit-4p四參數(shù)擬合，繪制濃度-反應(yīng)度校準(zhǔn)曲線，如圖2所示。5、同上述測(cè)定步驟測(cè)量待測(cè)品1得到反應(yīng)度δa＝0.3925然后根據(jù)上述濃度-反應(yīng)度校準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算，待測(cè)品1的saa濃度為65.73mg/l。6、同上述測(cè)定步驟測(cè)量待測(cè)品2得到反應(yīng)度δa＝0.0237，然后根據(jù)上述濃度-反應(yīng)度校準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算，待測(cè)品2的saa濃度為2.57mg/l。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12