本發(fā)明涉及一種快速評價外周血中調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的免疫抑制功能的檢測方法。該方法用于監(jiān)測調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的抑制活性，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

人體的免疫系統(tǒng)受多重精密調(diào)節(jié)，其中調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(regulatorytcell,treg)發(fā)揮重要的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，是阻斷免疫監(jiān)測和抑制有效抗腫瘤免疫的主要免疫細(xì)胞。treg細(xì)胞在體內(nèi)所占的比例很少，在正常人外周血中僅占cd4⁺細(xì)胞的5-10%左右，而具有免疫抑制能力的treg細(xì)胞比例更低。treg細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞表面分子，如cd4、cd25、foxp3、ctla4、gitr和cd103等，如何識別檢測具有免疫抑制功能的特異性treg細(xì)胞是目前細(xì)胞治療研究的重點(diǎn)。早期曾認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子foxp3是treg細(xì)胞最特異的標(biāo)記物，但是僅表達(dá)foxp3不足以定義treg細(xì)胞及決定treg細(xì)胞的功能和表型，最新研究發(fā)現(xiàn)，還有其他的分子標(biāo)志影響了treg細(xì)胞的成熟和功能。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明在現(xiàn)有檢測技術(shù)基礎(chǔ)上，優(yōu)化了一種體外檢測調(diào)節(jié)性t細(xì)胞免疫功能的方法，利用helios結(jié)合cd4\cd25\foxp3作為標(biāo)記功能性treg細(xì)胞的方法，在總體調(diào)節(jié)性t細(xì)胞中通過發(fā)現(xiàn)靶位找到具有實際調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞群，可以更有效的檢測具備免疫抑制功能的細(xì)胞群體，達(dá)到科學(xué)量化具有抑制活性的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的目的。

下面對本發(fā)明步驟進(jìn)行詳細(xì)描述：

1采集：取外周血5-10ml；

2處理樣本：取流式管分別加入100μl外周血樣本，每管加入2ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫孵育15分鐘，1500轉(zhuǎn)/分20℃離心5min洗滌1遍，加入2mlpbs液相同條件再次洗滌1遍，加入100μlpbs液重懸成單細(xì)胞懸液；

3.表面抗體的標(biāo)記：加入抗體cd4、cd25各5μl標(biāo)記調(diào)節(jié)性t細(xì)胞表面分子標(biāo)記，室溫避光孵育20分鐘，pbs液1500轉(zhuǎn)/分20℃離心5min洗滌1遍；

4.細(xì)胞固定破膜：加入1ml固定破膜劑：10%甲醛/0.2%triton-x/pbs重懸細(xì)胞，室溫避光孵育1小時，加入2mlpbs液洗滌2遍；

5.核內(nèi)抗體染色：加入100μlpbs液重懸細(xì)胞，加入核內(nèi)抗體foxp3、helios各5ul標(biāo)記核內(nèi)抗體，室溫避光孵育1小時，加入2mlpbs液洗滌2遍；

6.流式檢測：加入400μl的pbs液重懸成單細(xì)胞懸液，濾網(wǎng)過濾加入流式孔板，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測cd4⁺cd25⁺foxp3⁺helios⁺細(xì)胞占cd4⁺細(xì)胞比例；

7單個核細(xì)胞分離：外周血全血樣本按照體積比1：1的比例將外周血緩慢加入ficoll淋巴細(xì)胞分離液中，2500轉(zhuǎn)/分離心25-30分鐘，收集中間白膜層的單個核細(xì)胞，加入15mlpbs液，1800轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，洗滌2遍；

8分選：磁珠分選cd4⁺cd25⁺treg細(xì)胞，其中陰性分選cd4⁺細(xì)胞，陽性分選cd25⁺細(xì)胞，cfse實驗檢測不同組cd4⁺cd25⁺treg細(xì)胞對cd4⁺cd25^-th細(xì)胞的免疫抑制功能；

9檢測：構(gòu)建heliossirna，將heliossirna轉(zhuǎn)染到分選后的allcd4⁺cd25⁺treg細(xì)胞中，cfse實驗檢測treg細(xì)胞免疫抑制功能，未轉(zhuǎn)染treg細(xì)胞作為對照組。

綜上所述，本發(fā)明的目的是針對目前對treg細(xì)胞分子標(biāo)記的不完善，提供一種新的具有較強(qiáng)免疫抑制功能的人外周血treg細(xì)胞免疫標(biāo)記，從而檢測t細(xì)胞的免疫抑制功能。

附圖說明

圖1：all與健康兒童外周血中cd4⁺cd25⁺foxp3⁺helios⁺treg細(xì)胞的比例；

圖2：all與健康兒童外周血中treg免疫抑制功能的差別；

圖3：helios表達(dá)對treg免疫抑制功能的影響；

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實施例1

treg細(xì)胞檢測

本實施例所用材料主要如下：

（1）標(biāo)本來源：該實例使用經(jīng)初發(fā)all患兒和正常健康查體患兒家屬同意授權(quán)的外周血作為單個核細(xì)胞的來源，共采集10份all外周血和10份正常對照外周血，加入肝素抗凝，每份3-5ml；

（2）主要試劑：鼠抗人cd4-fitc、foxp3-apc抗體購于美國ebiosicence公司，鼠抗人cd25-pe-cy5、helios-pe抗體分別購于美國biolegend公司，foxp3fix/permbuffer購于ebioscience，紅細(xì)胞裂解液購于美國bdbiosciences公司，細(xì)胞計數(shù)儀為beck-mancoulter(美國)，guavaeasycyte6ht流式細(xì)胞儀為美國emdmillipore公司生產(chǎn)；

（3）cd4⁺cd25⁺foxp3⁺helios⁺細(xì)胞占cd4⁺t細(xì)胞比例的流式檢測：取流式管分別加入100μl外周血樣本，每管加入2ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫避光孵育15分鐘，1500轉(zhuǎn)/分20℃離心5min洗滌1遍，加入2mlpbs相同條件再次洗滌1遍，加入100μlpbs重懸成單細(xì)胞懸液。向其中加入cd4-fitc和cd25-pe-cy5抗體各5μl，混勻，室溫避光孵育20min，經(jīng)pbs洗滌離心后分別加入1mlfixation/permeabilization固定破膜劑，室溫避光孵育30-60min，用1×permbuffer洗滌2次后，加入foxp3-apc(同型對照管加入5μl小鼠iggr1-apc)和helios-pe(同型對照管加入5μlarmenianhamsterigg)各5μl，避光孵育30-60min，經(jīng)1×permbuffer洗滌2次，用400μlpbs重懸，上流式機(jī)檢測cd4⁺cd25⁺foxp3⁺helios⁺treg占全血cd4⁺細(xì)胞的百分比（圖1）。實驗結(jié)果示：pre-ball組中，cd4⁺cd25⁺foxp3⁺helios⁺treg細(xì)胞占cd4⁺t細(xì)胞比例為（6.16±0.79）%，明顯高于對照組（2.62±0.34）%，差異具有顯著性的統(tǒng)計學(xué)意義（p=0.005）。

實施例2

單個核細(xì)胞的分離和treg細(xì)胞的分選

（1）標(biāo)本來源：該實例使用經(jīng)初發(fā)all患兒和正常健康查體患兒家屬同意授權(quán)的外周血作為單個核細(xì)胞的來源，共采集5份all外周血和5份正常對照外周血，加入肝素抗凝，每份10ml；

（2）主要試劑：淋巴細(xì)胞分離液購自sigma公司，cd4⁺cd25⁺treg細(xì)胞分選試劑盒、免疫磁珠分選儀(automacsproseparator)、macsbuffer、ld及msmacs分離柱均購自德國miltenyibiotec公司；

（3）單個核細(xì)胞分離：抽取肝素抗凝外周血10ml，外周血加入等量pbs液稀釋，取50ml離心管，每管小心加入淋巴細(xì)胞分離液20ml，將20ml稀釋后血液沿管壁緩慢置于淋巴細(xì)胞分離液層面之上，2500轉(zhuǎn)/分20℃離心30min，收集淋巴細(xì)胞層中的淋巴細(xì)胞，加入15mlpbs，1800轉(zhuǎn)/分×10分鐘離心洗滌2次，細(xì)胞計數(shù)大約有1×10⁷-2×10⁷單個核細(xì)胞，每1×10⁷細(xì)胞加入90ulpbs重懸；

（4）treg細(xì)胞的macs分選：取分離后的單個核細(xì)胞，每10⁷個細(xì)胞加入biotin-antibody10ul混勻，置于2-8℃孵育5min，加入20μlanti-biotinmicrobeads/每10⁷個細(xì)胞，混勻，2-8℃孵育10min，將細(xì)胞調(diào)整至500μl體積，過ld柱，收集過柱后流下來的細(xì)胞懸液為cd4⁺t細(xì)胞(陰選)，用pbs將細(xì)胞洗滌離心后，每10⁷個細(xì)胞加入pbs90μl重懸，每10⁷個細(xì)胞加入cd25microbeads20ul，混勻，在2-8℃孵育15min，加入1mlpbs洗滌離心，傾去上清，重懸至500μl，過ls柱，把separator移開，放置1mlpbs于ls柱上，迅速將細(xì)胞打下，收集流下的為cd4⁺cd25⁺t細(xì)胞(陽選)，加入treg培養(yǎng)基培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。留取一部分細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測，流式細(xì)胞儀檢測cd4⁺cd25⁺陽性細(xì)胞分選率達(dá)90%以上。

實施例3

treg細(xì)胞免疫抑制功能的檢測

（1）主要試劑：共培養(yǎng)培養(yǎng)基：1640培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，100u/ml青霉素+鏈

霉素，50μm/l2-巰基乙醇和2mm/ll-谷氨酰胺，200iu/mlrhil-2。cd3/cd28dynbeads購自美國invitrogen公司，cfse購自日本同仁化學(xué)研究所；

（2）將實施例2中分選出的cd4⁺cd25^-細(xì)胞洗滌，加入pbs將其調(diào)整成1×10⁷濃度，按照cfse說明書標(biāo)記5μmcfse，37℃孵育15-30分鐘，pbs洗滌2次，取1×10⁶按細(xì)胞數(shù)2：1的比例分別與實驗組1、實驗組2、對照組treg細(xì)胞加入6孔板共培養(yǎng)，培養(yǎng)基使用共培養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中另加入比例為1：1的cd3/cd28dynbeads，培養(yǎng)72小時后利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測，利用modfitflt軟件分析結(jié)果，如圖2。結(jié)果示:實驗組cd4⁺cd25⁺t細(xì)胞抑制能力較對照組有明顯統(tǒng)計學(xué)意義的升高（11.40±0.64vs14.53±0.20，p=0.009）。

實施例4

helios表達(dá)對treg細(xì)胞功能的影響

為檢測helios基因?qū)reg細(xì)胞功能的影響，在白血病treg細(xì)胞中轉(zhuǎn)染helios-sirnas下調(diào)helios表達(dá)，helios-sirnas由吉馬生物有限公司合成。實驗分為兩個組：helios-sirna轉(zhuǎn)染組和對照組，按照lipofectamine2000的說明進(jìn)行操作將兩組sirna分別轉(zhuǎn)染到treg細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時后進(jìn)行定量pcr檢測helios基因表達(dá)下降，如圖3，cfse共培養(yǎng)抑制實驗結(jié)果顯示sirna-helios組treg細(xì)胞的免疫抑制功能較對照組平均下降34%（24.00±1.73vs16.33±0.88，p=0.001）。