本發(fā)明屬于新型功能納米材料、免疫分析和生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，食品污染日趨嚴(yán)重和頻繁，不僅造成巨額的經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康。赭曲霉毒素A是由多種生長(zhǎng)在糧食(小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類(lèi)等)、花生、蔬菜等農(nóng)作物上的曲霉和青霉產(chǎn)生的。由于分布廣泛，很容易通過(guò)污染的糧食或飼料以及該飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物等進(jìn)入食物鏈，間接的進(jìn)入人體內(nèi)，最終造成肝腎損傷、繁殖障礙、免疫抑制、致癌致畸等嚴(yán)重后果。

食品檢測(cè)是保證食品安全的重要環(huán)節(jié)，本發(fā)明提供了一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度和選擇性高的光電化學(xué)免疫分析方法。光電化學(xué)傳感器是基于物質(zhì)的光電轉(zhuǎn)換來(lái)確定待測(cè)物濃度的一類(lèi)檢測(cè)裝置，光電化學(xué)檢測(cè)方法具有靈敏度高、設(shè)備簡(jiǎn)單、易于微型化的特點(diǎn)，已經(jīng)成為一種極具應(yīng)用潛力的分析方法，在食品、環(huán)境、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了在可見(jiàn)光激發(fā)下檢測(cè)赭曲霉毒素A的光電化學(xué)免疫傳感器。該傳感器以TiO₂和BiVO₄為基底，其優(yōu)良的導(dǎo)電性和大的表面積能有效減小背景信號(hào)。通過(guò)在電極表面直接滴加AgNO₃和Na₂S溶液，原位生成高光電轉(zhuǎn)換率的窄帶隙Ag₂S作為信號(hào)放大材料。本發(fā)明制備的基于原位生成Ag₂S的光電化學(xué)傳感器，具有低成本、高靈敏、特異性好、檢測(cè)快速、制備過(guò)程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在可見(jiàn)光區(qū)域?qū)崿F(xiàn)了對(duì)赭曲霉毒素A的快速、靈敏檢測(cè)，有效克服了目前赭曲霉毒素A檢測(cè)方法的不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器的制備方法及應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)赭曲霉毒素A的超靈敏檢測(cè)。

本發(fā)明的目的之一是提供一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器的制備方法。

本發(fā)明的目的之二是將所制備的赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器，用于檢測(cè)赭曲霉毒素A。

本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟。

1. 一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器的制備方法，包括以下幾個(gè)步驟：

（1）將ITO導(dǎo)電玻璃切割至2.5 cm × 1.0 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超純水清洗30 min，氮?dú)獯蹈桑?/p>

（2）取8 ~ 12 μL、5 mg/mL的TiO₂滴加到導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電面，室溫下晾干，4 ~ 6 μL、3 mg/mL的BiVO₄滴加到TiO₂上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO₄/TiO₂，然后在其上面原位生長(zhǎng)Ag₂S, 制得Ag₂S@BiVO₄/TiO₂修飾電極；

（3）繼續(xù)在Ag₂S@BiVO₄/TiO₂修飾電極表面滴加2 ~ 4 μL、3 mmol/L的巰基乙酸，室溫下晾干，滴加3 ~ 5 μL 的含 1×10^-2 mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺EDC和2×10^-3 mol/L N-羥基琥珀酰亞胺NHS的混合溶液，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；

（4）繼續(xù)將3 ~ 5 μL、10 μg/mL的赭曲霉毒素A抗體滴加到電極表面，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；

（5）繼續(xù)將3 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% ~ 2% 的BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，4 ℃冰箱中晾干，超純水沖洗電極表面；

（6）將4 μL、5 pg/mL-750 ng/mL的一系列不同濃度的赭曲霉毒素A抗原溶液滴加到電極表面，4 ℃冰箱中孵化30 min，超純水沖洗電極表面除去未結(jié)合的赭曲霉毒素A抗原，制得一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器。

2.所述 TiO₂的制備，步驟如下：

取0.02~0.03 mol鈦酸四丁酯溶解于30 mL乙醇中，30 ℃下加入10 mL超純水，攪拌120 min后，將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓釜中，200 ℃下反應(yīng)10 ~ 14 h，所得產(chǎn)物用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌，50 ℃真空干燥24 h，得到TiO₂粉末。

3.所述 BiVO₄的制備，步驟如下：

稱(chēng)取1.90 ~ 1.98 g的Bi(NO₃)₃·5H₂O和0.77 ~ 0.79 g檸檬酸溶于10 mL乙二醇，形成溶液A；稱(chēng)取0.46 ~ 0.47g NH₄VO₃ 溶于25 mL蒸餾水，形成淺黃色溶液B，將B溶液逐滴加入A溶液，再加入30 mL無(wú)水乙醇，攪拌30 min，再加入0.85 g Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH，將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓釜中，180 ℃下反應(yīng)20 ~ 24 h，所得產(chǎn)物用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌三次，60 ℃真空干燥18 ~22 h，得到BiVO₄。

4.所述Ag₂S@BiVO₄/TiO₂的制備，包括以下幾個(gè)步驟：

（1）BiVO₄/TiO₂的制備

取8 ~ 12 μL、5 mg/mL的TiO₂滴加到導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電面，室溫下晾干，4 ~ 6 μL、3 mg/mL的BiVO₄滴加到TiO₂上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO₄/TiO₂；

（2）Ag₂S@BiVO₄/TiO₂的合成

取2 ~ 4 μL、0.1 mol/L 的巰基乙酸滴加到BiVO₄/TiO₂，室溫晾干，超純水沖洗，取2 ~ 4 μL、0.08 mol/L 的AgNO₃滴加到巰基乙酸修飾的BiVO₄/TiO₂，避光反應(yīng)30 ~35 min，超純水沖洗，最后取2 ~ 4 μL、0.1 mol/L的Na₂S滴加到BiVO₄/TiO₂，室溫下反應(yīng)30 ~ 40 min，超純水沖洗，得到Ag₂S@BiVO₄/TiO₂。

5.赭曲霉毒素A的檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下：

（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測(cè)試，如權(quán)利要求1所制備的光電化學(xué)傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，在10 mL、pH 7.4的含0.1 mol/L抗壞血酸的PBS緩沖溶液進(jìn)行測(cè)試；

（2）用時(shí)間-電流法對(duì)分析物進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置電壓為0.1 V，運(yùn)行時(shí)間100 s，照射LED燈波長(zhǎng)為400 ~ 450 nm；

（3）當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔10 s開(kāi)燈持續(xù)照射10 s，然后記錄光電流，繪制工作曲線(xiàn)；

（4）將待測(cè)的赭曲霉毒素A樣品溶液代替赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果可通過(guò)工作曲線(xiàn)查得。

本發(fā)明所用原材料均可在化學(xué)試劑公司或生物制藥公司購(gòu)買(mǎi)。

本發(fā)明的有益成果

（1）本發(fā)明使用了以TiO₂和BiVO₄為基底，TiO₂擁有良好的光電活性、大的表面積、高穩(wěn)定性和低成本；表面多孔結(jié)構(gòu)的BiVO₄，不但促進(jìn)可見(jiàn)光的吸收，而且可加速電子空穴對(duì)的分離和增加其導(dǎo)電性；有效減小背景信號(hào)，以巰基乙酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺為交聯(lián)劑，促進(jìn)了抗體的有效結(jié)合。

（2）采用在電極表面直接滴加AgNO₃和Na₂S溶液，原位生成高光電轉(zhuǎn)換率的窄帶隙Ag₂S作為信號(hào)放大材料, Ag₂S作為光敏劑擁有高可見(jiàn)光吸收和快速電子轉(zhuǎn)移路徑，在BiVO₄表面原位生長(zhǎng)窄帶隙的Ag₂S，得到的Ag₂S@BiVO₄/TiO₂有效促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移和降低電子空穴對(duì)的符合，從而提高光電轉(zhuǎn)化效率。在可見(jiàn)光區(qū)域?qū)崿F(xiàn)了對(duì)赭曲霉毒素A的快速、從而提高了傳感器的靈敏度，降低了檢測(cè)限；

（3）一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器對(duì)赭曲霉毒素A的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，信號(hào)響應(yīng)范圍寬，實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)，其線(xiàn)性范圍5 pg/mL ~ 750 ng/mL，檢測(cè)限最低1.6 pg/mL，表明一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器可以達(dá)到準(zhǔn)確測(cè)定的目的。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)將本發(fā)明通過(guò)具體實(shí)施方式進(jìn)一步說(shuō)明，但不限于此

實(shí)施例1一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器的制備方法，包括以下幾個(gè)步驟：

（1）將ITO導(dǎo)電玻璃切割至2.5 cm × 1.0 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超純水清洗30 min，氮?dú)獯蹈桑?/p>

（2）取8 μL、5 mg/mL的TiO₂滴加到導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電面，室溫下晾干，4 μL、3 mg/mL的BiVO₄滴加到TiO₂上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO₄/TiO₂，然后在其上面原位生長(zhǎng)Ag₂S, 制得Ag₂S@BiVO₄/TiO₂修飾電極；

（3）繼續(xù)在Ag₂S@BiVO₄/TiO₂修飾電極表面滴加2 μL、3 mmol/L的巰基乙酸，室溫下晾干，滴加3 μL 的含 1×10^-2 mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺EDC和2×10^-3mol/L N-羥基琥珀酰亞胺NHS的混合溶液，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；

（4）繼續(xù)將3 μL、10 μg/mL的赭曲霉毒素A抗體滴加到電極表面，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；

（5）繼續(xù)將3 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 的BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，4 ℃冰箱中晾干，超純水沖洗電極表面；

（6）將4 μL、5 pg/mL-750 ng/mL的一系列不同濃度的赭曲霉毒素A抗原溶液滴加到電極表面，4 ℃冰箱中孵化30 min，超純水沖洗電極表面除去未結(jié)合的赭曲霉毒素A抗原，制得一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器。

實(shí)施例2一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器的制備方法，包括以下幾個(gè)步驟：

（1）將ITO導(dǎo)電玻璃切割至2.5 cm × 1.0 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超純水清洗30 min，氮?dú)獯蹈桑?/p>

（2）取10 μL、5 mg/mL的TiO₂滴加到導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電面，室溫下晾干，5 μL、3 mg/mL的BiVO₄滴加到TiO₂上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO₄/TiO₂，然后在其上面原位生長(zhǎng)Ag₂S, 制得Ag₂S@BiVO₄/TiO₂修飾電極；

（3）繼續(xù)在Ag₂S@BiVO₄/TiO₂修飾電極表面滴加3 μL、3 mmol/L的巰基乙酸，室溫下晾干，滴加4 μL 的含 1×10^-2 mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺EDC和2×10^-3mol/L N-羥基琥珀酰亞胺NHS的混合溶液，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；

（4）繼續(xù)將4 μL、10 μg/mL的赭曲霉毒素A抗體滴加到電極表面，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；

（5）繼續(xù)將3 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5% 的BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，4 ℃冰箱中晾干，超純水沖洗電極表面；

（6）將4 μL、5 pg/mL-750 ng/mL的一系列不同濃度的赭曲霉毒素A抗原溶液滴加到電極表面，4 ℃冰箱中孵化30 min，超純水沖洗電極表面除去未結(jié)合的赭曲霉毒素A抗原，制得一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器。

實(shí)施例3一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器的制備方法，包括以下幾個(gè)步驟：

（1）將ITO導(dǎo)電玻璃切割至2.5 cm × 1.0 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超純水清洗30 min，氮?dú)獯蹈桑?/p>

（2）取12 μL、5 mg/mL的TiO₂滴加到導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電面，室溫下晾干，6 μL、3 mg/mL的BiVO₄滴加到TiO₂上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO₄/TiO₂，然后在其上面原位生長(zhǎng)Ag₂S, 制得Ag₂S@BiVO₄/TiO₂修飾電極；

（3）繼續(xù)在Ag₂S@BiVO₄/TiO₂修飾電極表面滴加4 μL、3 mmol/L的巰基乙酸，室溫下晾干，滴加5 μL 的含 1×10^-2 mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺EDC和2×10^-3mol/L N-羥基琥珀酰亞胺NHS的混合溶液，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；

（4）繼續(xù)將5 μL、10 μg/mL的赭曲霉毒素A抗體滴加到電極表面，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；

（5）繼續(xù)將3 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 的BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，4 ℃冰箱中晾干，超純水沖洗電極表面；

（6）將4 μL、5 pg/mL-750 ng/mL的一系列不同濃度的赭曲霉毒素A抗原溶液滴加到電極表面，4 ℃冰箱中孵化30 min，超純水沖洗電極表面除去未結(jié)合的赭曲霉毒素A抗原，制得一種赭曲霉毒素A光電化學(xué)傳感器。

實(shí)施例4所述 TiO₂的制備，步驟如下：

取0.02 mol鈦酸四丁酯溶解于30 mL乙醇中，30 ℃下加入10 mL超純水，攪拌120 min后，將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓釜中，200 ℃下反應(yīng)10 h，所得產(chǎn)物用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌，50 ℃真空干燥24 h，得到TiO₂粉末。

實(shí)施例5所述 TiO₂的制備，步驟如下：

取0.025 mol鈦酸四丁酯溶解于30 mL乙醇中，30 ℃下加入10 mL超純水，攪拌120 min后，將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓釜中，200 ℃下反應(yīng)12 h，所得產(chǎn)物用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌，50 ℃真空干燥24 h，得到TiO₂粉末。

實(shí)施例6所述 TiO₂的制備，步驟如下：

取0.03 mol鈦酸四丁酯溶解于30 mL乙醇中，30 ℃下加入10 mL超純水，攪拌120 min后，將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓釜中，200 ℃下反應(yīng)14 h，所得產(chǎn)物用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌，50 ℃真空干燥24 h，得到TiO₂粉末。

實(shí)施例7所述 BiVO₄的制備，步驟如下：

稱(chēng)取1.90 g的Bi(NO₃)₃·5H₂O和0.77 g檸檬酸溶于10 mL乙二醇，形成溶液A；稱(chēng)取0.46 g NH₄VO₃ 溶于25 mL蒸餾水，形成淺黃色溶液B，將B溶液逐滴加入A溶液，再加入30 mL無(wú)水乙醇，攪拌30 min，再加入0.85 g Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH，將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓釜中，180 ℃下反應(yīng)20 h，所得產(chǎn)物用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌三次，60 ℃真空干燥18 h，得到BiVO₄。

實(shí)施例8所述 BiVO₄的制備，步驟如下：

稱(chēng)取1.94 g的Bi(NO₃)₃·5H₂O和0.78 g檸檬酸溶于10 mL乙二醇，形成溶液A；稱(chēng)取0.465 g NH₄VO₃ 溶于25 mL蒸餾水，形成淺黃色溶液B，將B溶液逐滴加入A溶液，再加入30 mL無(wú)水乙醇，攪拌30 min，再加入0.85 g Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH，將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓釜中，180 ℃下反應(yīng)22 h，所得產(chǎn)物用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌三次，60 ℃真空干燥20 h，得到BiVO₄。

實(shí)施例9所述 BiVO₄的制備，步驟如下：

稱(chēng)取1.98 g的Bi(NO₃)₃·5H₂O和0.79 g檸檬酸溶于10 mL乙二醇，形成溶液A；稱(chēng)取0.47g NH₄VO₃ 溶于25 mL蒸餾水，形成淺黃色溶液B，將B溶液逐滴加入A溶液，再加入30 mL無(wú)水乙醇，攪拌30 min，再加入0.85 g Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH，將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓釜中，180 ℃下反應(yīng)24 h，所得產(chǎn)物用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌三次，60 ℃真空干燥22 h，得到BiVO₄。

實(shí)施例10所述Ag₂S@BiVO₄/TiO₂的制備，包括以下幾個(gè)步驟：

（1）BiVO₄/TiO₂的制備

取8 μL、5 mg/mL的TiO₂滴加到導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電面，室溫下晾干，4 μL、3 mg/mL的BiVO₄滴加到TiO₂上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO₄/TiO₂；

（2）Ag₂S@BiVO₄/TiO₂的合成

取2 μL、0.1 mol/L 的巰基乙酸滴加到BiVO₄/TiO₂，室溫晾干，超純水沖洗，取2 μL、0.08 mol/L 的AgNO₃滴加到巰基乙酸修飾的BiVO₄/TiO₂，避光反應(yīng)30 min，超純水沖洗，最后取2 μL、0.1 mol/L的Na₂S滴加到BiVO₄/TiO₂，室溫下反應(yīng)30 min，超純水沖洗，得到Ag₂S@BiVO₄/TiO₂。

實(shí)施例11所述Ag₂S@BiVO₄/TiO₂的制備，包括以下幾個(gè)步驟：

（1）BiVO₄/TiO₂的制備

取10 μL、5 mg/mL的TiO₂滴加到導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電面，室溫下晾干，5 μL、3 mg/mL的BiVO₄滴加到TiO₂上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO₄/TiO₂；

（2）Ag₂S@BiVO₄/TiO₂的合成

取3 μL、0.1 mol/L 的巰基乙酸滴加到BiVO₄/TiO₂，室溫晾干，超純水沖洗，取3 μL、0.08 mol/L 的AgNO₃滴加到巰基乙酸修飾的BiVO₄/TiO₂，避光反應(yīng)33 min，超純水沖洗，最后取3 μL、0.1 mol/L的Na₂S滴加到BiVO₄/TiO₂，室溫下反應(yīng)35 min，超純水沖洗，得到Ag₂S@BiVO₄/TiO₂。

實(shí)施例12所述Ag₂S@BiVO₄/TiO₂的制備，包括以下幾個(gè)步驟：

（1）BiVO₄/TiO₂的制備

取12 μL、5 mg/mL的TiO₂滴加到導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電面，室溫下晾干，6 μL、3 mg/mL的BiVO₄滴加到TiO₂上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO₄/TiO₂；

（2）Ag₂S@BiVO₄/TiO₂的合成

取4 μL、0.1 mol/L 的巰基乙酸滴加到BiVO₄/TiO₂，室溫晾干，超純水沖洗，取4 μL、0.08 mol/L 的AgNO₃滴加到巰基乙酸修飾的BiVO₄/TiO₂，避光反應(yīng)35 min，超純水沖洗，最后取4 μL、0.1 mol/L的Na₂S滴加到BiVO₄/TiO₂，室溫下反應(yīng)40 min，超純水沖洗，得到Ag₂S@BiVO₄/TiO₂。

實(shí)施例13赭曲霉毒素A的檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下：

（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測(cè)試，如權(quán)利要求1所制備的光電化學(xué)傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，在10 mL、pH 7.4的含0.1 mol/L抗壞血酸的PBS緩沖溶液進(jìn)行測(cè)試；

（2）用時(shí)間-電流法對(duì)分析物進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置電壓為0.1 V，運(yùn)行時(shí)間100 s，照射LED燈波長(zhǎng)為400 ~ 450 nm；

（3）當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔10 s開(kāi)燈持續(xù)照射10 s，然后記錄光電流，繪制工作曲線(xiàn)；

（4）將待測(cè)的赭曲霉毒素A樣品溶液代替赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，其線(xiàn)性范圍5 pg/mL ~ 750 ng/mL，檢測(cè)限最低1.6 pg/mL。