本發(fā)明涉及一步式免標(biāo)記熒光檢測(cè)汞離子的方法，屬于熒光檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

重金屬污染已成為一個(gè)重要的全球性問題，人類由于接觸污染的天然水和飲用水，尤其是劇毒的重金屬汞，嚴(yán)重威脅著人類的健康。無機(jī)汞，即hg和hg²⁺通過人為原因或者自然原因被釋放到環(huán)境中。汞的工業(yè)來源包括煤炭和黃金開采、垃圾焚燒、木材制漿、化石燃料燃燒和化學(xué)制造等。人類更多的暴露途徑包括家庭和工作場(chǎng)所、宗教活動(dòng)、牙科用汞齊合金等。此外，hg²⁺很難被生物降解，可通過生物放大作用在體內(nèi)富集，這將引起不同的人類疾病，如腎功能衰竭，產(chǎn)前腦損傷，認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)障礙，視力和聽力損失，甚至死亡。它同時(shí)也是一種神經(jīng)毒素，并可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能障礙。

基于hg²⁺對(duì)人類健康的嚴(yán)重危害以及可持續(xù)發(fā)展的要求，建立一種快速、低成本、高靈敏、高特異性檢測(cè)hg²⁺的方法非常有必要。傳統(tǒng)的定量檢測(cè)水樣中hg²⁺的方法包括電感耦合等離子體質(zhì)譜法、原子熒光光譜法(atomicfluorescencespectroscopy,afs)、原子吸收光譜法、熒光分光光度法和x射線吸收光譜法等。然而，這些傳統(tǒng)的方法往往需要精密儀器，復(fù)雜樣品前處理、較大的樣本量以及對(duì)操作的專業(yè)培訓(xùn)，這都限制了其廣泛應(yīng)用。因此，建立一種新型的高靈敏、高特異性、低成本、快速簡(jiǎn)便的適用于自然環(huán)境和生物環(huán)境中hg²⁺檢測(cè)的方法尤為重要。

sybrgreeni(sgi)作為一種熒光染料，在分析和診斷領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。自推出以來，sgi已經(jīng)被有效地應(yīng)用于凝膠中核酸的檢測(cè)，熒光成像技術(shù)，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)以及生物芯片領(lǐng)域等。它更傾向于與雙鏈dna(dsdna)結(jié)合，發(fā)出較強(qiáng)的熒光信號(hào)；而與單鏈dna(ssdna)相互作用較弱，只發(fā)出微弱的熒光信號(hào)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種一步式免標(biāo)記熒光快速檢測(cè)汞離子的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

(1)在6-8支離心管中加入200μl100nm汞特異性ssdna溶液和2μl100×用水稀釋的sybrgreeni熒光染料，再分別加入50μl濃度呈梯度的選自5-1000nm的6-8個(gè)hg²⁺水溶液，混勻，室溫下孵育0.5-3min；

(2)采用熒光分光光度計(jì)，以490nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在535nm的發(fā)射波長(zhǎng)下分別對(duì)步驟(1)獲得的液體進(jìn)行掃描，獲得各自的熒光強(qiáng)度值，制備熒光強(qiáng)度響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(3)重新取3-5支離心管，加入200μl100nm汞特異性ssdna溶液和2μl100×用水稀釋的sybrgreeni熒光染料，再加入經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾的50μl待測(cè)水樣，混勻，室溫下孵育0.5-3min；采用熒光分光光度計(jì)，以490nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在535nm的發(fā)射波長(zhǎng)下對(duì)待測(cè)水樣進(jìn)行掃描，獲得熒光強(qiáng)度值，與熒光強(qiáng)度響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得到待測(cè)水樣的hg²⁺濃度，所述ssdna的核苷酸序列用seqidno.1所示；所述ssdna溶液的溶劑的配方為：4-羥乙基哌嗪乙磺酸:10mm,nano3:20mm,ph:7.6，余量為水。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的方法靈敏、便捷、快速、經(jīng)濟(jì)，滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。

附圖說明

圖1為汞特異性ssdna序列二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖2為t-hg²⁺-t結(jié)構(gòu)示意圖，其中t為胸腺嘧啶。

圖3為實(shí)驗(yàn)原理圖。

圖4為不同濃度hg²⁺的熒光響應(yīng)曲線。

圖5為檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6為檢測(cè)體系的特異度驗(yàn)證。

陽(yáng)性對(duì)照組(虛線框):黑色柱:1μmhg²⁺；淺色柱:300nmhg²⁺。

實(shí)驗(yàn)組:黑色柱:1μm干擾離子；淺色柱:900nm干擾離子與300nmhg²⁺混合物。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

一種富含t堿基的汞特異性ssdna，它包含24個(gè)堿基，其中可以組成7對(duì)t-t。當(dāng)hg²⁺不存在時(shí)，ssdna為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，當(dāng)加入熒光染料sgi后，熒光信號(hào)較弱。通過mfold軟件模擬可知其自由能分別為δghairpinloop＝2.98kj/mol,δgexternalloop＝-0.49kj/mol，二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖1所示，結(jié)果表明該二級(jí)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，不會(huì)發(fā)生自雜交和假陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)hg²⁺存在時(shí)，由于t-hg²⁺-t(見圖2)的形成，ssdna可以形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因?yàn)閠-hg²⁺-t比a-t堿基對(duì)更穩(wěn)定。當(dāng)加入sgi時(shí)，它可以嵌入雙螺旋結(jié)構(gòu)的小溝里，在535nm的發(fā)射波長(zhǎng)處發(fā)出較強(qiáng)的熒光(圖3)，且熒光強(qiáng)度與形成的dsdna的量呈正相關(guān)，如果沒有hg²⁺存在，則sgi保持基線態(tài)，不發(fā)射熒光。因此，根據(jù)測(cè)得的熒光強(qiáng)度可以推算出水樣中hg²⁺的濃度。

實(shí)施例1

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1試劑與材料通過mfold(http://unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold/dna-folding-form)設(shè)計(jì)ssdna，由生工合成(上海，中國(guó))，通過高效液相色譜法純化。該汞特異性ssdna的序列為:5’-cttctttcttccccttgtttgttg-3’(seqidno.1所示)。sgi(10,000×)購(gòu)買于invitrogenbiotechnologyco.,ltd(上海，中國(guó))，在-20℃儲(chǔ)存。

hg²⁺，pb²⁺，ni²⁺，zn²⁺，ca²⁺，cu²⁺，fe³⁺，cr⁶⁺和cd²⁺的標(biāo)準(zhǔn)液購(gòu)買于accustandard,inc.(紐黑文，美國(guó))，濃度分別為1mgml^-1。其余的化學(xué)藥品均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。所有實(shí)驗(yàn)操作均在室溫下進(jìn)行。

1.2儀器熒光強(qiáng)度值(fis)由f-4500熒光分光光度計(jì)測(cè)得(日立，日本)，測(cè)量參數(shù)如下：反應(yīng)時(shí)間2s，光電管負(fù)高壓700v，掃描速度1200nmmin^-1，激發(fā)波長(zhǎng)490nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫為5nm。實(shí)驗(yàn)室方法比對(duì)采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)hg²⁺檢測(cè)方法-原子熒光光譜法(gb/t-5750.6-2006,中國(guó))(afs-9800,北京海光，北京，中國(guó))完成。

1.3汞特異性ssdna的準(zhǔn)備.將裝有汞特異性ssdna凍干粉的離心管在10000rpm下離心1分鐘，然后用超純水溶解，配置成100μm的儲(chǔ)備液，-20℃儲(chǔ)存。

1.4檢測(cè)方法

(1)在7支離心管中加入200μl100nm汞特異性ssdna溶液和2μl100×用水稀釋的sgi熒光染料，再分別加入50μl濃度呈梯度的hg²⁺(5，10，50，100，200，500和1000nm)水溶液，混勻，室溫下孵育1min；

(2)采用熒光分光光度計(jì)，以490nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在510到600nm的發(fā)射波長(zhǎng)下掃描，獲得熒光強(qiáng)度響應(yīng)曲線。隨著hg²⁺濃度的增大，熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)，說明熒光強(qiáng)度與hg²⁺濃度呈正相關(guān)，見圖4。在535nm的發(fā)射波長(zhǎng)下分別對(duì)步驟(1)獲得的液體進(jìn)行掃描，每個(gè)樣品均重復(fù)測(cè)量3次，獲得各自的熒光強(qiáng)度值，制備熒光強(qiáng)度響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及最低檢出限，熒光強(qiáng)度響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，在5-200nm之間，logistic回歸曲線方程為y＝0.5625-0.6577/(1+(x/43.5960)^1.9243)(r²＝0.9961)；在100-1000nm之間，線性方程為y＝7.3725x+1.4825(r²＝0.9996)。根據(jù)3σ可推知該方法的最低檢出限為3nm，低于美國(guó)環(huán)境保護(hù)署的標(biāo)準(zhǔn)(10nm)，其中σ為不加hg²⁺時(shí)空白對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)差。而且，整個(gè)檢測(cè)過程在1min內(nèi)即可完成，具有較高的靈敏度，滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。

(3)重新取3支離心管，加入200μl100nm汞特異性ssdna溶液和2μl100×用水稀釋的sybrgreeni熒光染料，再加入3個(gè)不同地域的，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾的50μl待測(cè)水樣，混勻，室溫下孵育1min；采用熒光分光光度計(jì)，以490nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在535nm的發(fā)射波長(zhǎng)下對(duì)待測(cè)水樣進(jìn)行掃描，獲得熒光強(qiáng)度值，與熒光強(qiáng)度響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得到待測(cè)水樣的hg²⁺濃度，檢測(cè)結(jié)果見表1，所述ssdna的核苷酸序列用seqidno.1所示；所述ssdna溶液的溶劑的配方為：4-羥乙基哌嗪乙磺酸:10mm,nano3:20mm,ph:7.6，余量為水。

表13個(gè)水質(zhì)樣品中hg²⁺的檢測(cè)結(jié)果(nm)

檢測(cè)方法的可行性通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來評(píng)估，并與實(shí)驗(yàn)室經(jīng)典檢測(cè)方法(afs)作比對(duì)，afs是中國(guó)飲用水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中hg²⁺的檢測(cè)方法(gb/t-5750.6-2006)，分析結(jié)果如表2所示。本發(fā)明的方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法afs相比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％，說明該方法的可靠性較好，兩種方法在檢測(cè)水樣時(shí)沒有明顯差異。因此，該方法適用于環(huán)境飲用水中hg²⁺的實(shí)際檢測(cè)。

表2水質(zhì)樣品中hg²⁺的檢測(cè)結(jié)果(nm)

1.5特異性檢測(cè)為了驗(yàn)證方法的特異性，在9支離心管中，加入200μl100nm汞特異性ssdna溶液和2μl100×用水稀釋的sgi熒光染料，再各自加入50μl濃度均為1μmhg²⁺,pb²⁺,ni²⁺,zn²⁺,ca²⁺,cu²⁺,fe³⁺,cr⁶⁺或cd²⁺，混勻，室溫下孵育1min；采用熒光分光光度計(jì)，以490nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在535nm的發(fā)射波長(zhǎng)下對(duì)待測(cè)水樣進(jìn)行掃描，獲得熒光強(qiáng)度值，見圖6的黑色柱，差異顯著。

另取9支離心管，加入200μl100nm汞特異性ssdna溶液和2μl100×用水稀釋的sgi熒光染料，再分別加入離子如下：

離心管1：50μl300nmhg²⁺；

離心管2：50μl的hg²⁺和pb²⁺的混合溶液，其中hg²⁺濃度為300nm，pb²⁺濃度為900nm；

離心管3：50μl的hg²⁺和pb²⁺的混合溶液，其中hg²⁺濃度為300nm，ni²⁺濃度為900nm；

離心管4：50μl的hg²⁺和pb²⁺的混合溶液，其中hg²⁺濃度為300nm，zn²⁺濃度為900nm；

離心管5：50μl的hg²⁺和pb²⁺的混合溶液，其中hg²⁺濃度為300nm，ca²⁺濃度為900nm；

離心管6：50μl的hg²⁺和pb²⁺的混合溶液，其中hg²⁺濃度為300nm，cu²⁺濃度為900nm；

離心管7：50μl的hg²⁺和pb²⁺的混合溶液，其中hg²⁺濃度為300nm，fe³⁺濃度為900nm；

離心管8：50μl的hg²⁺和pb²⁺的混合溶液，其中hg²⁺濃度為300nm，cr⁶⁺濃度為900nm；

離心管9：50μl的hg²⁺和pb²⁺的混合溶液，其中hg²⁺濃度為300nm，cd²⁺濃度為900nm；

混勻，室溫下孵育1min；采用熒光分光光度計(jì)，以490nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在535nm的發(fā)射波長(zhǎng)下對(duì)待測(cè)水樣進(jìn)行掃描，獲得熒光強(qiáng)度值，見圖6的灰色柱，每組值非常接近。說明該檢測(cè)hg²⁺的方法幾乎不受其他離子的干擾，特異性良好，滿足實(shí)際檢測(cè)的需求。

實(shí)施例2

一步式免標(biāo)記熒光快速檢測(cè)汞離子的方法，包括如下步驟：

(1)在6支離心管中加入200μl100nm汞特異性ssdna溶液和2μl100×用水稀釋的sgi熒光染料，再分別加入50μl濃度呈梯度的選自5-1000nm的6個(gè)hg²⁺水溶液，分別為5，20，100，400，800和1000nm混勻，室溫下孵育0.5min；

(2)采用熒光分光光度計(jì)，以490nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在535nm的發(fā)射波長(zhǎng)下分別對(duì)步驟(1)獲得的液體進(jìn)行掃描，獲得各自的熒光強(qiáng)度值，制備熒光強(qiáng)度響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(3)重新取4支離心管，加入200μl100nm汞特異性ssdna溶液和2μl100×用水稀釋的sgi熒光染料，再加入50μl經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾的待測(cè)水樣，混勻，室溫下孵育0.5min；采用熒光分光光度計(jì)，以490nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在535nm的發(fā)射波長(zhǎng)下對(duì)待測(cè)水樣進(jìn)行掃描，獲得熒光強(qiáng)度值，與熒光強(qiáng)度響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得到待測(cè)水樣的hg²⁺濃度，所述ssdna的核苷酸序列用seqidno.1所示；所述ssdna溶液的溶劑的配方為：4-羥乙基哌嗪乙磺酸:10mm,nano3:20mm,ph:7.6，余量為水。

實(shí)施例3

一步式免標(biāo)記熒光快速檢測(cè)汞離子的方法，包括如下步驟：

(1)在8支離心管中加入200μl100nm汞特異性ssdna溶液和2μl100×用水稀釋的sgi熒光染料，再分別加入50μl濃度呈梯度的選自5-1000nm的8個(gè)hg²⁺水溶液，分別為5，10，20，80，160，320，640和1000nm混勻，室溫下孵育3min；

(2)采用熒光分光光度計(jì)，以490nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在535nm的發(fā)射波長(zhǎng)下分別對(duì)步驟(1)獲得的液體進(jìn)行掃描，獲得各自的熒光強(qiáng)度值，制備熒光強(qiáng)度響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(3)重新取5支離心管，加入200μl100nm汞特異性ssdna溶液和2μl100×用水稀釋的sgi熒光染料，再加入50μl經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾的待測(cè)水樣，混勻，室溫下孵育3min；采用熒光分光光度計(jì)，以490nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在535nm的發(fā)射波長(zhǎng)下對(duì)待測(cè)水樣進(jìn)行掃描，獲得熒光強(qiáng)度值，與熒光強(qiáng)度響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得到待測(cè)水樣的hg²⁺濃度，所述ssdna的核苷酸序列用seqidno.1所示；所述ssdna溶液的溶劑的配方為：4-羥乙基哌嗪乙磺酸:10mm,nano3:20mm,ph:7.6，余量為水。

sequencelisting

<110>廣州醫(yī)科大學(xué);蘭州大學(xué)

<120>一步式免標(biāo)記熒光快速檢測(cè)汞離子的方法

<130>

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<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>人工合成

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