本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種gapdhs蛋白64位發(fā)生質(zhì)量偏移的蘇氨酸作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精診斷試劑中的用途。

背景技術(shù)：

不孕不育已成為全世界范圍內(nèi)的生殖健康問題，其中由于男性因素造成的不育大概占50％左右，且近年來呈上升的趨勢。造成男性不育的主要原因是少精弱精癥。根據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，如果a級精子數(shù)<25％，(a+b)級精子數(shù)<50％，且精子活率低于60％的話，就可診斷為弱精子癥。少精子癥是指精液中的精子數(shù)目低于正常具有生育能力男性的一種病癥，當(dāng)男性的精子在每毫升低于2千萬時，就為少精子癥。

目前關(guān)于精子蛋白質(zhì)組的研究有很多。saraswat等利用uplc-ms的方法在人類精子中定量了667個蛋白，并且分析出了20個健康人和弱精癥患者精子中的差異蛋白(saraswatm,joenvaaras,jaintetal.humanspermatozoaquantitativeproteomicsignatureclassifiesnormo-andasthenozoospermia.molecular&cellularproteomics:mcp,16(1),57-72(2017).)。最新更新的人類精子蛋白質(zhì)組共6198個蛋白(amarala,castilloj,ramalho-santosj,olivar.thecombinedhumanspermproteome:cellularpathwaysandimplicationsforbasicandclinicalscience.humanreproductionupdate,20(1),40-62(2014).)。gaigaiwang等利用高分辨質(zhì)譜在人類精子中鑒定出4675個蛋白(wangg,guoy,zhoutetal.in-depthproteomicanalysisofthehumanspermrevealscomplexproteincompositions.journalofproteomics,79,114-122(2013).)。絡(luò)氨酸磷酸化對于精子的運動、獲能、超激運動等過程重要作用。chying-chyuanchan等通過對20組正常人和弱精癥患者的精子進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)有12種包括tubgcp2在內(nèi)的蛋白發(fā)生了過磷酸化(chancc,shuiha,wuchetal.motilityandproteinphosphorylationinhealthyandasthenozoospermicsperm.journalofproteomeresearch,8(11),5382-5386(2009))。

非編碼氨基酸包括翻譯后修飾和氨基酸突變，是調(diào)控蛋白功能和結(jié)構(gòu)的重要方式，因此將疾病狀態(tài)下異常的或者數(shù)量變化極大的非編碼氨基酸作為疾病的生物標(biāo)志物，進而用于診斷疾病的進程具有重要意義。但目前還未有關(guān)于非編碼氨基酸作為與重度少弱精子疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的提供一種與重度少弱精子癥相關(guān)的生物標(biāo)志物的篩選與應(yīng)用。本發(fā)明首先利用nanohplc-ms/ms質(zhì)譜系統(tǒng)和非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對多組重度少弱精疾病的精子蛋白非編碼氨基酸進行了深度的質(zhì)譜分析；然后利用非限定氨基酸蛋白質(zhì)修飾分析方法對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行搜索，再經(jīng)過多變量高斯混合分布聚類分析，盡可能大量的鑒定出精子蛋白組中非編碼氨基酸；最后通過正常和病人精子蛋白組中非編碼氨基酸的比較，得到與重度少弱精癥相關(guān)的蛋白非編碼氨基酸位點，從而將其作為重度少弱精癥的分子標(biāo)志物。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供了一種與重度少弱精子癥相關(guān)的生物標(biāo)志物的篩選方法，包括如下步驟：

(1)提取精子細胞全蛋白；

(2)將精子細胞全蛋白采用凝膠電泳分離，切膠酶解，對酶解后的肽段進行脫鹽，制備得到樣品；

(3)將步驟(2)的樣品采用納流液相色譜分離，經(jīng)納流液相色譜分離后的樣品再進行質(zhì)譜檢測，采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)；

(4)利用非限定氨基酸蛋白質(zhì)修飾分析方法對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行搜索，再經(jīng)過多變量高斯混合分布聚類分析，盡可能大量的鑒定出精子蛋白組中非編碼氨基酸；最后通過正常個體和重度少弱精個體精子蛋白組中非編碼氨基酸的比較，得到與重度少弱精癥相關(guān)的蛋白非編碼氨基酸位點，即為與重度少弱精子癥相關(guān)的生物標(biāo)志物。

步驟(1)中，提取精子細胞全蛋白采用的方法為：將精子樣本采用dpbs洗滌，加入ripa裂解液超聲1～2min，置于冰上孵育30min裂解，離心，取上清。

優(yōu)選的，在4℃的條件下離心，離心轉(zhuǎn)速為14,000g，離心時間為20min。

步驟(2)中，優(yōu)選的，采用10％聚丙烯酰氨凝膠電泳(sds-page)對蛋白進行分離。

步驟(2)中，優(yōu)選的，采用ziptip對酶解后的肽段進行脫鹽。

步驟(3)中，納流液相色譜分離的色譜條件為：流動相a：含有0.1％甲酸的水，流動相b：含有0.1％甲酸的乙腈；納流液相質(zhì)譜分析系統(tǒng)為orbitrapelite(thermoscientific)

洗脫條件為：0-100min，95-68％流動相a，5-32％流動相b；100-120min，68-20％流動相a，32-80％流動相b；120-150min，20％流動相a，80％流動相b；

流速為300nl/min。

步驟(3)中，質(zhì)譜檢測的條件為：350-1800m/z的全掃描，分辨率為60,000(m/z200)。二級圖譜掃描時，活化時間為10ms，隔離寬度為2m/z；碎裂方式為誘導(dǎo)碰撞解離(collision-induceddissociation,cid)，歸一化碰撞能量設(shè)定為35％，動態(tài)排出時間為90s。

步驟(4)中，對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行搜索的參數(shù)設(shè)置為：蛋白酶為胰蛋白酶，漏切位點設(shè)置為2，母離子質(zhì)量偏差為10ppm，碎片離子的質(zhì)量偏差為0.6da，盲搜上限設(shè)為1000，盲搜下限設(shè)為-200，蛋白fdr為0.01；

選擇肽段分?jǐn)?shù)>200和fdr<0.01的肽段作為wildcardsearch^tm搜索到的未知修飾數(shù)據(jù)，組成質(zhì)量變化的一維數(shù)據(jù)矩陣(-200da-400da)，再將數(shù)據(jù)按照1da的變化范圍，0.5da為界限，分割成601個數(shù)據(jù)窗口。

步驟(4)中，多變量高斯混合分布聚類分析的方法為：針對每一個數(shù)據(jù)窗口，用r語言中的mclust程序包做高斯混合分布聚類分析，根據(jù)bic取最優(yōu)值，再對每一個峰進行合并分析，然后用高斯分布擬合每一個峰，確定峰值；聚類之后的每個峰中所包含的肽段位點數(shù)據(jù)，根據(jù)位點氨基酸分布，選擇分布大于5％的數(shù)據(jù)作為一類非編碼氨基酸。

步驟(4)中，將正常個體和重度少弱精個體的非編碼氨基酸按照其檢測頻率的t檢驗(p<0.05)和比值(ratio>2)進行篩選，從而得到差異非編碼氨基酸。

上述篩選方法是用于獲得生物標(biāo)志物，且不是以獲得疾病的診斷和治療結(jié)果為目的；經(jīng)上述篩選方法獲得的生物標(biāo)志物可用于重度少弱精子癥的理論研究或者新藥物的開發(fā)。

本發(fā)明的第二方面，提供根據(jù)上述篩選方法篩選得到的與重度少弱精子癥相關(guān)的生物標(biāo)志物，所述生物標(biāo)志物包括但不限于：

akap3蛋白208位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸(標(biāo)記為s+79.96685；根據(jù)質(zhì)量偏移值，確定該位置的絲氨酸發(fā)生了磷酸化修飾)；

akap4蛋白186位發(fā)生-113.05347質(zhì)量偏移的天門冬酰胺(標(biāo)記為n-113.05347)；

akap4蛋白186位發(fā)生-114.04278質(zhì)量偏移的天門冬酰胺(標(biāo)記為n-114.04278)；

akap4蛋白617位發(fā)生-17.02660質(zhì)量偏移的谷氨酰胺(標(biāo)記為q-17.02660)；

akap4蛋白733位發(fā)生+211.09682質(zhì)量偏移的賴氨酸(標(biāo)記為k+211.09682)；

atp5a1蛋白531位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸(標(biāo)記為k+42.01108；根據(jù)質(zhì)量偏移值，確定該位置的賴氨酸發(fā)生了乙?；揎?；

cox4i1蛋白87位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸(標(biāo)記為k+42.01108；根據(jù)質(zhì)量偏移值，確定該位置的賴氨酸發(fā)生了乙?；揎?；

gapdhs蛋白64位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的蘇氨酸(標(biāo)記為t+79.96685；根據(jù)質(zhì)量偏移值，確定該位置的蘇氨酸發(fā)生了磷酸化修飾)；

和kiaa1683蛋白692位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸(標(biāo)記為s+79.96685；根據(jù)質(zhì)量偏移值，確定該位置的絲氨酸發(fā)生了磷酸化修飾)。

本發(fā)明的第三方面，提供akap3蛋白208位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。

優(yōu)選的，akap3蛋白208位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸還可以作為重度少弱精治療的靶標(biāo)，從而用于重度少弱精的治療。

進一步的，本發(fā)明還提供akap3蛋白208位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的治療藥物中的用途。

本發(fā)明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標(biāo)志物(akap3蛋白208位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸)的試劑。

本發(fā)明還提供一種治療重度少弱精的藥物，所述藥物中含有能夠使akap3蛋白208位絲氨酸進行磷酸化修飾的組分。

本發(fā)明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本akap3蛋白208位絲氨酸發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的頻次，若檢測頻次小于1.5時，被判為少弱精患者。

本發(fā)明的第四方面，提供akap4蛋白186位發(fā)生-113.05347質(zhì)量偏移的天門冬酰胺作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。

本發(fā)明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標(biāo)志物(akap4蛋白186位發(fā)生-113.05347質(zhì)量偏移的天門冬酰胺)的試劑。

本發(fā)明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本akap4蛋白186位天門冬酰胺發(fā)生-113.05347質(zhì)量偏移的頻次，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者。

本發(fā)明的第五方面，提供akap4蛋白186位發(fā)生-114.04278質(zhì)量偏移的天門冬酰胺作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。

本發(fā)明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標(biāo)志物(akap4蛋白186位發(fā)生-114.04278質(zhì)量偏移的天門冬酰胺)的試劑。

本發(fā)明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本akap4蛋白186位天門冬酰胺發(fā)生-114.04278質(zhì)量偏移的頻次，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者。

本發(fā)明的第六方面，提供akap4蛋白617位發(fā)生-17.02660質(zhì)量偏移的谷氨酰胺作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。

本發(fā)明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標(biāo)志物(akap4蛋白617位發(fā)生-17.02660質(zhì)量偏移的谷氨酰胺)的試劑。

本發(fā)明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本akap4蛋白617位谷氨酰胺發(fā)生-17.02660質(zhì)量偏移的頻次，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者。

本發(fā)明的第七方面，提供akap4蛋白733位發(fā)生+211.09682質(zhì)量偏移的賴氨酸作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。

本發(fā)明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標(biāo)志物(akap4蛋白733位發(fā)生+211.09682質(zhì)量偏移的賴氨酸)的試劑。

本發(fā)明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本akap4蛋白733位賴氨酸發(fā)生+211.09682質(zhì)量偏移的頻次，檢測頻次小于3.5時，被判為少弱精患者。

本發(fā)明的第八方面，提供atp5a1蛋白531位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。

優(yōu)選的，atp5a1蛋白531位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸還可以作為重度少弱精治療的靶標(biāo)，從而用于重度少弱精的治療。

進一步的，本發(fā)明還提供atp5a1蛋白531位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的治療藥物中的用途。

本發(fā)明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標(biāo)志物(atp5a1蛋白531位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸)的試劑。

本發(fā)明還提供一種治療重度少弱精的藥物，所述藥物中含有能夠使atp5a1蛋白531位賴氨酸進行乙?；揎椀慕M分。

本發(fā)明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本atp5a1蛋白531位賴氨酸發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的頻次，若檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者。

本發(fā)明的第九方面，提供cox4i1蛋白87位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。

優(yōu)選的，cox4i1蛋白87位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸還可以作為重度少弱精治療的靶標(biāo)，從而用于重度少弱精的治療。

進一步的，本發(fā)明還提供cox4i1蛋白87位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的治療藥物中的用途。

本發(fā)明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標(biāo)志物(cox4i1蛋白87位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸)的試劑。

本發(fā)明還提供一種治療重度少弱精的藥物，所述藥物中含有能夠使cox4i1蛋白87位賴氨酸進行乙?；揎椀慕M分。

本發(fā)明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本cox4i1蛋白87位賴氨酸發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的頻次，若檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者。

本發(fā)明的第十方面，提供gapdhs蛋白64位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的蘇氨酸作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。

優(yōu)選的，gapdhs蛋白64位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的蘇氨酸還可以作為重度少弱精治療的靶標(biāo)，從而用于重度少弱精的治療。

進一步的，本發(fā)明還提供gapdhs蛋白64位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的蘇氨酸作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的治療藥物中的用途。

本發(fā)明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標(biāo)志物(gapdhs蛋白64位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的蘇氨酸)的試劑。

本發(fā)明還提供一種治療重度少弱精的藥物，所述藥物中含有能夠使gapdhs蛋白64位蘇氨酸進行磷酸化修飾的組分。

本發(fā)明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本gapdhs蛋白64位蘇氨酸發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的頻次，若檢測頻次小于3.5時，被判為少弱精患者。

本發(fā)明的第十一方面，提供kiaa1683蛋白692位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。

優(yōu)選的，kiaa1683蛋白692位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸還可以作為重度少弱精治療的靶標(biāo)，從而用于重度少弱精的治療。

進一步的，本發(fā)明還提供kiaa1683蛋白692位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸作為生物標(biāo)志物在制備重度少弱精的治療藥物中的用途。

本發(fā)明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標(biāo)志物(kiaa1683蛋白692位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸)的試劑。

本發(fā)明還提供一種治療重度少弱精的藥物，所述藥物中含有能夠使kiaa1683蛋白692位絲氨酸進行磷酸化修飾的組分。

本發(fā)明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本kiaa1683蛋白692位絲氨酸發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的頻次，若檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明首次建立了一種與重度少弱精子癥相關(guān)的生物標(biāo)志物的篩選方法，通過對大量樣本精子蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析處理，盡可能大量的鑒定出精子蛋白組中非編碼氨基酸；最后通過正常和病人精子蛋白組中非編碼氨基酸的比較，得到與重度少弱精癥相關(guān)的蛋白非編碼氨基酸位點，從而將其作為重度少弱精癥的分子標(biāo)志物。

(2)本發(fā)明進一步的對上述篩選方法得到的生物標(biāo)志物進行研究，發(fā)現(xiàn)可以通過上述生物標(biāo)志物的檢驗頻次來診斷重度少弱精癥，為重度少弱精癥提供了新的診斷和治療靶點。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當(dāng)限定。

圖1：akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率的roc曲線。

圖2：健康和少弱精樣本中akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率比較。

圖3：akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-113.05347檢測頻率的roc曲線。

圖4：健康和少弱精樣本的akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-113.05347檢測頻率比較。

圖5：akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-114.04278檢測頻率的roc曲線。

圖6：健康和少弱精樣本的akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-114.04278檢測頻率比較。

圖7：akap4蛋白617位非編碼氨基酸q-17.02660檢測頻率的roc曲線。

圖8：健康和少弱精樣本的akap4蛋白617位非編碼氨基酸q-17.02660檢測頻率比較。

圖9：akap4蛋白733位非編碼氨基酸k+211.09682檢測頻率的roc曲線。

圖10：健康和少弱精樣本的非編碼氨基酸k+211.09682檢測頻率比較。

圖11：atp5a1蛋白531位賴氨酸乙?；揎梜+42.01108檢測頻率的roc曲線。

圖12：健康和少弱精樣本的atp5a1蛋白531位賴氨酸乙?；揎梜+42.01108檢測頻率比較。

圖13：cox4i1蛋白87位賴氨酸乙?；揎梜+42.01108檢測頻率的roc曲線。

圖14：健康和少弱精樣本的cox4i1蛋白87位賴氨酸乙?；揎梜+42.01108檢測頻率比較。

圖15：gapdhs蛋白64位蘇氨酸上的磷酸化修飾t+79.96685檢測頻率的roc曲線。

圖16：健康和少弱精樣本中g(shù)apdhs蛋白64位蘇氨酸上的磷酸化修飾t+79.96685檢測頻率比較。

圖17：kiaa1683蛋白692位絲氨酸磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率的roc曲線。

圖18：健康和少弱精樣本中kiaa1683蛋白692位絲氨酸磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率比較。

具體實施方式

應(yīng)該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請?zhí)峁┻M一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中還未有關(guān)于非編碼氨基酸作為與重度少弱精子癥相關(guān)的生物標(biāo)志物的報道。基于此，本發(fā)明提出了一種與重度少弱精子癥相關(guān)的生物標(biāo)志物的篩選方法與應(yīng)用。

在本申請的一種實施方案中，提出了一種與重度少弱精子癥相關(guān)的生物標(biāo)志物的篩選方法，包括如下步驟：

(1)提取精子細胞全蛋白；

(2)將精子細胞全蛋白采用凝膠電泳分離，切膠酶解，對酶解后的肽段進行脫鹽，制備得到樣品；

(3)將步驟(2)的樣品采用納流液相色譜分離，經(jīng)納流液相色譜分離后的樣品再進行質(zhì)譜檢測，采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)；

(4)利用非限定氨基酸蛋白質(zhì)修飾分析方法對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行搜索，再經(jīng)過多變量高斯混合分布聚類分析，盡可能大量的鑒定出精子蛋白組中非編碼氨基酸；最后通過正常個體和重度少弱精個體精子蛋白組中非編碼氨基酸的比較，得到與重度少弱精癥相關(guān)的蛋白非編碼氨基酸位點，即為與重度少弱精子癥相關(guān)的生物標(biāo)志物。

由于精子樣本的易得性，精子成熟后其轉(zhuǎn)錄和翻譯處于停滯狀態(tài)，這也為我們在蛋白質(zhì)水平上研究少弱精子癥提供了方便，本申請首先利用nanohplc-ms/ms質(zhì)譜系統(tǒng)和非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對多組重度少弱精疾病的精子蛋白非編碼氨基酸進行了深度的質(zhì)譜分析；然后利用非限定氨基酸蛋白質(zhì)修飾分析方法對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行搜索，再經(jīng)過多變量高斯混合分布聚類分析，盡可能大量的鑒定出精子蛋白組中非編碼氨基酸。最后將正常與患病組的非編碼氨基酸按照其檢測頻率的t檢驗(p<0.05)和比值(ratio>2)進行篩選，從而得到差異非編碼氨基酸。然后利用spss軟件作出差異非編碼氨基酸roc曲線，并計算其曲線下面積(auc)，進而判斷其診斷價值。

采用本申請的上述篩選方法，得到了系列與重度少弱精子癥相關(guān)的生物標(biāo)志物，具體如下：

akap3蛋白208位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸(標(biāo)記為s+79.96685；根據(jù)質(zhì)量偏移值，確定該位置的絲氨酸發(fā)生了磷酸化修飾)；

akap4蛋白186位發(fā)生-113.05347質(zhì)量偏移的天門冬酰胺(標(biāo)記為n-113.05347)；

akap4蛋白186位發(fā)生-114.04278質(zhì)量偏移的天門冬酰胺(標(biāo)記為n-114.04278)；

akap4蛋白617位發(fā)生-17.02660質(zhì)量偏移的谷氨酰胺(標(biāo)記為q-17.02660)；

akap4蛋白733位發(fā)生+211.09682質(zhì)量偏移的賴氨酸(標(biāo)記為k+211.09682)；

atp5a1蛋白531位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸(標(biāo)記為k+42.01108；根據(jù)質(zhì)量偏移值，確定該位置的賴氨酸發(fā)生了乙?；揎?；

cox4i1蛋白87位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸(標(biāo)記為k+42.01108；根據(jù)質(zhì)量偏移值，確定該位置的賴氨酸發(fā)生了乙?；揎?；

gapdhs蛋白64位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的蘇氨酸(標(biāo)記為t+79.96685；根據(jù)質(zhì)量偏移值，確定該位置的蘇氨酸發(fā)生了磷酸化修飾)；

和kiaa1683蛋白692位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸(標(biāo)記為s+79.96685；根據(jù)質(zhì)量偏移值，確定該位置的絲氨酸發(fā)生了磷酸化修飾)。

在本申請的另一種實施方案中，提出了一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標(biāo)志物的試劑。

通過對上述生物標(biāo)志物進行檢測，可以實現(xiàn)對重度少弱精癥的診斷。

在本申請的另一種實施方案中，提出了一種治療重度少弱精的藥物，所述藥物中含有能夠使akap3蛋白208位絲氨酸、gapdhs蛋白64位蘇氨酸或kiaa1683蛋白692位絲氨酸進行磷酸化修飾的組分，或者含有能夠使atp5a1蛋白531位賴氨酸或cox4i1蛋白87位賴氨酸進行乙?；揎椀慕M分。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化修飾的akap3蛋白208位絲氨酸、gapdhs蛋白64位蘇氨酸和kiaa1683蛋白692位絲氨酸在重度少弱精樣本中顯著性的下調(diào)，乙?；揎椀腶tp5a1蛋白531位賴氨酸或cox4i1蛋白87位賴氨酸也在重度少弱精樣本中顯著性的下調(diào)。由此可以合理預(yù)期，以上述生物標(biāo)志物作為靶標(biāo)，通過對多重度少弱精患者該靶標(biāo)處的氨基酸進行磷酸化或乙?；揎棧梢云鸬綄χ囟壬偃蹙闹委熥饔?。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實施例詳細說明本申請的技術(shù)方案。

本發(fā)明實施例中所用的試驗材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗材料，均可通過商業(yè)渠道購買得到。

實施例1：與重度少弱精子癥相關(guān)的生物標(biāo)志物的篩選

具體篩選方法如下：

一、樣本處理及實驗分析

1.精子細胞全蛋白的提取：等量的重度少弱精和正常精子樣本分別用dpbs洗三次，加入等量ripa裂解液超聲1～2min，置于冰上孵育30min裂解，4℃離心14,000g×20min取上清。利用bradford方法測定蛋白濃度。

2.蛋白酶解：取約重度少弱精和正常精子樣本各150μg精子蛋白，使用10％聚丙烯酰氨凝膠電泳(sds-page)對蛋白進行分離，各分成5份進行切膠酶解。使用ziptip對肽段進行脫鹽。

3.質(zhì)譜分析：納流液相色譜分離：a相：含有0.1％甲酸的水；b相：含有0.1％甲酸的乙腈

每個樣品分別用13.5μla相溶解,樣品進樣量為4μl，納流液相質(zhì)譜分析系統(tǒng)為orbitrapelite(thermoscientific)。樣品分離之前分別用4μla相平衡自制的預(yù)柱和分析柱。預(yù)柱和分析柱的規(guī)格分別為：預(yù)柱(4cm×150μmi.d.,c18填料粒徑5μm,)，分析柱(30cm×75μmi.d.,c18填料填充，粒徑3μm,dr.maischgmbh,germany)。平衡之后樣品在a相的帶動下首先載樣于預(yù)柱，然后在不同梯度下進行液相分離。150min色譜梯度變化如下：5-32％流動相b100min；32-80％流動相b，20min；80％流動相b，30min。流速始終保持在300nl/min。經(jīng)過納流液相分離的樣品直接進入esi離子噴霧源并進入orbitrapelite質(zhì)譜儀中進行質(zhì)譜檢測。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集：350‐1800m/z的全掃描，分辨率為60,000(m/z200)。二級圖譜掃描時，活化時間為10ms，隔離寬度為2m/z。碎裂方式為誘導(dǎo)碰撞解離(collision-induceddissociation,cid)，歸一化碰撞能量設(shè)定為35％，動態(tài)排出時間為90s。

二、質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

byonic分析：為了鑒定出精子蛋白的非編碼氨基酸，我們用byonic^tm分析21對正常與重度少弱精患者的精蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)。搜索參數(shù)如下：蛋白酶為胰蛋白酶，漏切位點設(shè)置為2，母離子質(zhì)量偏差為10ppm，碎片離子的質(zhì)量偏差為0.6da,盲搜上限設(shè)為1000，盲搜下限設(shè)為-200.蛋白fdr為0.01。

選擇肽段分?jǐn)?shù)>200和fdr<0.01的肽段作為wildcardsearch^tm搜索到的未知修飾數(shù)據(jù)，組成質(zhì)量變化的一維數(shù)據(jù)矩陣(-200da-400da)，再將數(shù)據(jù)按照1da的變化范圍，0.5da為界限，分割成601個數(shù)據(jù)窗口。針對每一個數(shù)據(jù)窗口，用r語言中的mclust程序包做高斯混合分布聚類分析，根據(jù)bic取最優(yōu)值，再對每一個峰進行合并分析，然后用高斯分布擬合每一個峰，確定峰值。聚類之后的每個峰中所包含的肽段位點數(shù)據(jù)，根據(jù)位點氨基酸分布，選擇分布大于5％的數(shù)據(jù)作為一類非編碼氨基酸。

將正常與患病組的非編碼氨基酸按照其檢測頻率的t檢驗(p<0.05)和比值(ratio>2)進行篩選，從而得到差異非編碼氨基酸。然后利用spss軟件作出差異非編碼氨基酸roc曲線，并計算其曲線下面積(auc)，進而判斷其診斷價值。

三、實驗結(jié)果：

經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和將正常與患病組的非編碼氨基酸比較，從而得到9個差異非編碼氨基酸，可以作為與重度少弱精子癥相關(guān)的生物標(biāo)志物，具體如下：

1.akap3蛋白208位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸(標(biāo)記為s+79.96685；根據(jù)質(zhì)量偏移值，確定該位置的絲氨酸發(fā)生了磷酸化修飾)

我們發(fā)現(xiàn)akap3蛋白208位絲氨酸上發(fā)生了磷酸化修飾s+79.96685，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)這一磷酸化修飾在重度少弱精樣本顯著性下調(diào)了10.7倍，p值為7.49e-15<0.05。

為評價akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率對重度少弱精的診斷效能，本發(fā)明采用了roc曲線分析，auc為roc曲線下的面積，是最常用的評價roc曲線特征的參數(shù)，是重要的試驗準(zhǔn)確度指標(biāo)。若auc在0.7以下，則表示診斷的準(zhǔn)確率較低；auc在0.7以上，則可以滿足臨床診斷的要求。

圖1為akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一磷酸化修飾的auc為0.856>0.7，說明具有較好的診斷效果，即akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685可以作為重度少弱精的診斷標(biāo)志物。

在檢驗頻次為1.5時，靈敏度為73％，特異度為88.9％。當(dāng)進行個體檢測時，檢測頻次小于1.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為11.1％)。

健康和少弱精樣本中akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率比較結(jié)果見圖2，由圖2可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發(fā)生了4.6次而在病理樣本中發(fā)生了0.4次(圖中實線)，并且其中位數(shù)(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。

鑒于上述結(jié)果，akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685可以作為少弱精子癥的潛在生物標(biāo)志物，從而對這一病癥進行預(yù)測。

2.akap4蛋白186位發(fā)生-113.05347質(zhì)量偏移的天門冬酰胺(標(biāo)記為n-113.05347)

經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)akap4蛋白的186位的天門冬酰胺有-113.05347的質(zhì)量偏移(n-113.05347)，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)這一非編碼氨基酸n-113.05347在重度少弱精樣本顯著性下調(diào)了9.2倍，p值為4.60e-13<0.05。

圖3為akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-113.05347檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一非編碼氨基酸n-113.05347的auc為0.852>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為1.5時，靈敏度為65.1％，特異度為93.7％。當(dāng)進行個體檢測時，檢測頻次小于1.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為6.3％)。

圖4比較了非編碼氨基酸n-113.05347在健康和少弱精樣本的檢測頻率，可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發(fā)生了2.9次而在病理樣本中發(fā)生了0.3次(圖中實線)，并且其中位數(shù)(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。

鑒于上述結(jié)果，akap4蛋白的186位點的天門冬酰胺n-113.05347這一非編碼氨基酸可以作為少弱精子癥的潛在生物標(biāo)志物，從而對這一病癥進行預(yù)測。

3.akap4蛋白186位發(fā)生-114.04278質(zhì)量偏移的天門冬酰胺(標(biāo)記為n-114.04278)

經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)akap4蛋白的186位的天門冬酰胺有-114.04278的質(zhì)量偏移(n-114.04278)，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)這一非編碼氨基酸n-114.04278在重度少弱精樣本顯著性下調(diào)了7.3倍，p值為1.11e-11<0.05。

圖5為akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-114.04278檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一非編碼氨基酸n-114.04278的auc為0.817>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為0.5時，靈敏度為74.6％，特異度為84.1％。當(dāng)進行個體檢測時，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為15.9％)。

健康和少弱精樣本的akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-114.04278檢測頻率比較見圖6，由圖6可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發(fā)生了1.6次而在病理樣本中發(fā)生了0.2次(圖中實線)，并且其中位數(shù)(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。

鑒于上述結(jié)果，akap4蛋白的186位點的天門冬酰胺n-114.04278這一非編碼氨基酸可以作為少弱精子癥的潛在生物標(biāo)志物，從而對這一病癥進行預(yù)測。

4.akap4蛋白617位發(fā)生-17.02660質(zhì)量偏移的谷氨酰胺(標(biāo)記為q-17.02660)

經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)akap4蛋白的617位的谷氨酰胺有-17.02660的質(zhì)量偏移(q-17.02660)，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)這一非編碼氨基酸q-17.02660在重度少弱精樣本顯著性下調(diào)了4.8倍，p值為2.21e-09<0.05。

圖7為akap4蛋白617位非編碼氨基酸q-17.02660檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一非編碼氨基酸q-17.02660的auc為0.802>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為0.5時，靈敏度為77.8％，特異度為79.4％。當(dāng)進行個體檢測時，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為20.6％)。

健康和少弱精樣本的akap4蛋白617位非編碼氨基酸q-17.02660檢測頻率比較見圖8，由圖8可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發(fā)生了2.7次而在病理樣本中發(fā)生了0.6次(圖中實線)，并且其中位數(shù)(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。

鑒于上述結(jié)果，akap4蛋白的617位點的谷氨酰胺q-17.02660這一非編碼氨基酸可以作為少弱精子癥的潛在生物標(biāo)志物，從而對這一病癥進行預(yù)測。

5.akap4蛋白733位發(fā)生+211.09682質(zhì)量偏移的賴氨酸(標(biāo)記為k+211.09682)

經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)akap4蛋白的733位的賴氨酸有211.09682的質(zhì)量偏移(k+211.09682)，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)這一非編碼氨基酸k+211.09682在重度少弱精樣本顯著性下調(diào)了4.4倍，p值為5.79e-11<0.05。

圖9為akap4蛋白733位非編碼氨基酸k+211.09682檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一非編碼氨基酸k+211.09682的auc為0.804>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為3.5時，靈敏度為74.6％，特異度為71.4％。當(dāng)進行個體檢測時，檢測頻次小于3.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為28.6％)。

健康和少弱精樣本的非編碼氨基酸k+211.09682檢測頻率比較見圖10，由圖10可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發(fā)生了14次而在病理樣本中發(fā)生了3次(圖中實線)，并且其中位數(shù)(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。

鑒于上述結(jié)果，akap4蛋白的733位點的賴氨酸k+211.09682這一非編碼氨基酸可以作為少弱精子癥的潛在生物標(biāo)志物，從而對這一病癥進行預(yù)測。

6.atp5a1蛋白531位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸

經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)atp5a1蛋白531位賴氨酸上發(fā)生了乙?；揎梜+42.01108，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)這一乙?；揎椩谥囟壬偃蹙珮颖撅@著性下調(diào)了10.5倍，p值為3.48e-16<0.05。

圖11為atp5a1蛋白531位賴氨酸乙酰化修飾k+42.01108檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一乙酰化修飾的auc為0.848>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為0.5時，靈敏度為76.2％，特異度為85.7％。當(dāng)進行個體檢測時，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為14.3％)。

健康和少弱精樣本的atp5a1蛋白531位賴氨酸乙酰化修飾k+42.01108檢測頻率比較見圖12，可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發(fā)生了1.7次而在病理樣本中發(fā)生了0.2次(圖中實線)，并且其中位數(shù)(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。

鑒于上述結(jié)果，atp5a1蛋白531位賴氨酸上的乙?；揎梜+42.01108可以作為少弱精子癥的潛在生物標(biāo)志物，從而對這一病癥進行預(yù)測。

7.cox4i1蛋白87位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸(標(biāo)記為k+42.01108)

經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)cox4i1蛋白87位賴氨酸上發(fā)生了乙?；揎梜+42.01108，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)這一乙?；揎椩谥囟壬偃蹙珮颖撅@著性下調(diào)了11.3倍，p值為5.06e-13<0.05。

圖13為cox4i1蛋白87位賴氨酸乙?；揎梜+42.01108檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一乙?；揎椀腶uc為0.803>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為0.5時，靈敏度為66.7％，特異度為95.2％。當(dāng)進行個體檢測時，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為4.8％)。

圖14為健康和少弱精樣本的cox4i1蛋白87位賴氨酸乙酰化修飾k+42.01108檢測頻率比較，由圖14可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發(fā)生了1.1次而在病理樣本中發(fā)生了0.1次(圖中實線)，并且其中位數(shù)(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。

鑒于上述結(jié)果，cox4i1蛋白87位賴氨酸上的乙?；揎梜+42.01108可以作為少弱精子癥的潛在生物標(biāo)志物，從而對這一病癥進行預(yù)測。

8.gapdhs蛋白64位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的蘇氨酸(標(biāo)記為t+79.96685)

經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)gapdhs蛋白的64位蘇氨酸上發(fā)生了磷酸化修飾t+79.96685，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)這一磷酸化修飾在重度少弱精樣本顯著性下調(diào)了4.1倍，p值為1.82e-14<0.05。

圖15為gapdhs蛋白64位蘇氨酸上的磷酸化修飾t+79.96685檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一磷酸化修飾的auc為0.868>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為3.5時，靈敏度為71.4％，特異度為92.1％。當(dāng)進行個體檢測時，檢測頻次小于3.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為7.9％)。

圖16為健康和少弱精樣本中g(shù)apdhs蛋白64位蘇氨酸上的磷酸化修飾t+79.96685檢測頻率比較，由圖16可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發(fā)生了5.8次而在病理樣本中發(fā)生了1.4次(圖中實線)，并且其中位數(shù)(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。

鑒于上述結(jié)果，gapdhs蛋白64位蘇氨酸上的磷酸化修飾t+79.96685可以作為少弱精子癥的潛在生物標(biāo)志物，從而對這一病癥進行預(yù)測。

9.kiaa1683蛋白692位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸(標(biāo)記為s+79.96685)

經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)kiaa1683蛋白692位絲氨酸上發(fā)生了磷酸化修飾s+79.96685，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)這一磷酸化修飾在重度少弱精樣本顯著性下調(diào)了22倍，p值為2.73e-10<0.05。

圖17為kiaa1683蛋白692位絲氨酸磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一磷酸化修飾的auc為0.808>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為0.5時，靈敏度為65.1％，特異度為95.2％。當(dāng)進行個體檢測時，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為4.8％)。

圖18為健康和少弱精樣本中kiaa1683蛋白692位絲氨酸磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率比較，由圖18可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發(fā)生了2.1次而在病理樣本中發(fā)生了0.1次(圖中實線)，并且其中位數(shù)(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。

鑒于上述結(jié)果，kiaa1683蛋白692位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685可以作為少弱精子癥的潛在生物標(biāo)志物，從而對這一病癥進行預(yù)測。

實施例2：臨床檢測驗證

以4例健康樣本、8例已臨床確診的重度少弱精樣本作為研究對象進行驗證，分別檢測上述樣本的akap3蛋白208位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸、akap4蛋白186位發(fā)生-113.05347質(zhì)量偏移的天門冬酰胺、akap4蛋白186位發(fā)生-114.04278質(zhì)量偏移的天門冬酰胺、akap4蛋白617位發(fā)生-17.02660質(zhì)量偏移的谷氨酰胺、akap4蛋白733位發(fā)生+211.09682質(zhì)量偏移的賴氨酸、atp5a1蛋白531位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸、cox4i1蛋白87位發(fā)生+42.01108質(zhì)量偏移的賴氨酸、gapdhs蛋白64位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的蘇氨酸和kiaa1683蛋白692位發(fā)生+79.96685質(zhì)量偏移的絲氨酸各自的檢測頻次，并按實施例1中各生物標(biāo)志物進行個體檢測時的判斷標(biāo)準(zhǔn)對待測樣本進行診斷。

結(jié)果表明：分別以上述各生物標(biāo)志物進行單獨診斷時，診斷結(jié)果與已知結(jié)果一致。說明本發(fā)明篩選得到的9個生物標(biāo)志物可以各自作為重度少弱精的診斷標(biāo)志物。

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