本發(fā)明涉及生物技術檢測領域，特別是涉及一種用于檢測血清4型禽腺病毒(FAdV-4)抗體的間接ELISA試劑盒及其制備方法。

背景技術：

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒屬(Aviadenovirus)。該病毒粒子無囊膜，直徑約70-90nm，呈二十面體對稱，由衣殼、纖突、核酸芯髓及相關蛋白構成。根據(jù)群特異性抗原的不同，禽腺病毒可分為3群(I-III群)。其中I群禽腺病毒包括從雞、火雞、鵝及其它禽類分離獲得的腺病毒，其包含5個基因型(A-E)、12個血清型(1-11，8a，8b)。在FAdV的編碼蛋白中，F(xiàn)2纖突蛋白(fiber-2)的氨基酸組成不保守，表面帶有亞群及型的特異性抗原表位；同時，fiber-2蛋白可識別宿主細胞上的特異性受體，使病毒能夠吸附于宿主細胞，這一功能與病毒的感染能力、組織嗜性及毒力密切相關。

FAdV可經(jīng)糞便、氣管和鼻腔粘膜水平傳播，也可垂直傳播，主要為種雞產(chǎn)蛋期感染后1～2周內(nèi)經(jīng)蛋傳播給子代。雞群感染后表現(xiàn)為包含體肝炎和心包積液的臨床癥狀，引起死亡率在10％-80％之間，其中肝炎-心包積液綜合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome)也稱“安卡拉”病是由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)引起，也是致病性最強的一個血清型。近年來國內(nèi)報道FAdV-4感染有增多的趨勢，給國內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。

FAdV-4的診斷方法主要包括病毒的分離與鑒定，瓊脂擴散試驗，酶聯(lián)免疫吸附試驗等，病毒的分離與鑒定結果準確可信，但是檢測周期長，操作繁瑣，不利于疾病的快速診斷。

目前國內(nèi)市場上僅有的針對I群FAdV的通用抗體檢測的商品化ELISA試劑盒，由于是國外進口產(chǎn)品，價格昂貴，并且不能用于血清4型FAdV抗體的特異性檢測和FAdV-4疫苗免疫效果的評價。因此急需研發(fā)出針對血清4型FAdV的ELISA抗體檢測試劑盒。

公開于該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現(xiàn)有技術。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測血清4型禽腺病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其具有操作簡單、高特異性、高靈敏度、低成本的特點。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過所述間接ELISA試劑盒檢測血清4型禽腺病毒抗體的方法，從而可以更簡便、快捷、準確地檢測血清4型禽腺病毒抗體。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測血清4型禽腺病毒抗體的間接ELISA試劑盒，包括：ELISA反應板，重組FAdV-4fiber-2蛋白，辣根過氧化物酶標記的兔抗雞IgG抗體，包被液，封閉液，洗滌液，底物顯色液，和終止液。

上述檢測血清4型禽腺病毒抗體的間接ELISA試劑盒在另一種實施方式中，所述重組FAdV-4fiber-2蛋白是通過如下步驟獲得的：

原核表達：以NCBI數(shù)據(jù)庫中血清4型FAdV JSJ13株(GenBank登錄號為KM096544)基因組序列作為參考，設計特異性引物，擴增FAdV-4JSJ13株fiber-2基因完整的開放閱讀框，將其克隆至pET-32a原核表達載體，并轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中通過加入0.4-0.8mM IPTG誘導重組蛋白進行表達；

蛋白純化和復性：將重組菌株超聲處理后，提取菌體沉淀進行親和層析純化，進而通過梯度透析法復性，獲得可溶性FAdV-4fiber-2蛋白；

蛋白鑒定：利用Western blotting方法對純化后的FAdV-4fiber-2蛋白進行鑒定。

上述檢測血清4型禽腺病毒抗體的間接ELISA試劑盒在另一種實施方式中，所述FAdV-4fiber-2蛋白的基因序列擴增引物如下：

上游引物：5’-CCGGATATCATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAG-3’，插入EcoR V酶切位點；

下游引物：5’-CCGAAGCTTTTACGGGAGGGAGGCCGCTGG-3’，插入Hind III酶切位點。

上述檢測血清4型禽腺病毒抗體的間接ELISA試劑盒在另一種實施方式中，

所述包被液為碳酸鹽緩沖液，其通過稱取NACO₃ 1.5g及NaHCO₃2.9g，加入900mL超純水溶解后，定容至1000mL獲得；

可選的，所述洗滌液為PBST，并且所述PBST為含有體積分數(shù)0.05％吐溫-20的PBS溶液；

可選的，所述封閉液為5％脫脂乳，其通過將5g脫脂乳溶解于100mL PBS中獲得；

可選的，所述底物顯色液為雙組份TMB顯色液；

可選的，所述終止液為2mol/L稀硫酸。

本發(fā)明還提供了一種通過所述間接ELISA試劑盒檢測血清4型禽腺病毒抗體的方法，包括如下步驟：

(1)包被：使用包被液將重組FAdV-4fiber-2蛋白稀釋，將已稀釋的蛋白加至ELISA反應板中，4℃包被過夜；

(2)洗滌；

(3)封閉：將封閉液加至ELISA反應板中，于37℃封閉；

(4)洗滌；

(5)孵育待檢血清：以封閉液稀釋待檢血清樣品，將已稀釋的待檢血清樣品加至ELISA反應板中，于37℃孵育；

(6)洗滌；

(7)孵育酶標二抗：以封閉液稀釋辣根過氧化物酶標記的兔抗雞IgG抗體，將已稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗雞IgG抗體加至ELISA反應板中，于37℃孵育；

(8)洗滌；

(9)顯色：每孔加入顯色液，于37℃顯色；

(10)終止：每孔加入終止液，終止顯色反應；

(11)讀數(shù)：將ELISA反應板置于酶標儀中，在450nm波長下測定OD₄₅₀；

(12)檢測：利用統(tǒng)計學方法計算出陰性標準樣品的平均值和標準差(SD)，樣品則判定該樣品為FAdV-4陽性。

上述檢測血清4型禽腺病毒抗體的方法在另一種實施方式中，包括如下步驟：

(1)包被：使用包被液將重組FAdV-4fiber-2蛋白稀釋至1-2μg/mL，將已稀釋的蛋白以100μL/孔的量加至ELISA反應板中，4℃包被過夜；

(2)每孔加入300μL洗滌液洗滌3次；

(3)封閉：將封閉液以300μL/孔的量加至ELISA反應板中，于37℃封閉2h；

(4)每孔加入300μL洗滌液洗滌3次；

(5)孵育待檢血清：以封閉液稀釋待檢血清樣品50-300倍，將已稀釋的待檢血清樣品以100μL/孔的量加至ELISA反應板中，于37℃孵育15-45min；

(6)每孔加入300μL洗滌液洗滌3次；

(7)孵育酶標二抗：以封閉液稀釋辣根過氧化物酶標記的兔抗雞IgG抗體4000-8000倍，將已稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗雞IgG抗體以100μL/孔加至ELISA反應板中，于37℃孵育15-45min；

(8)每孔加入300μL洗滌液洗滌ELISA反應板3次；

(9)顯色：將每孔加入100μL已混均的顯色液，37℃顯色5-15min；

(10)終止：每孔加入50μL的終止液，終止顯色反應；

(11)讀數(shù)：將ELISA反應板置于酶標儀中，在450nm波長下測定OD₄₅₀；

(12)檢測：利用統(tǒng)計學方法計算出陰性標準樣品的平均值和標準差(SD)，樣品則判定該樣品為FAdV-4陽性。

上述檢測血清4型禽腺病毒抗體的方法在另一種實施方式中，所述重組FAdV-4fiber-2蛋白被稀釋至1.5μg/mL，所述待檢血清樣品被稀釋200倍，所述酶標二抗被稀釋6000倍，在所述步驟(5)和(7)中的孵育時間均為30min，所述顯色時間為10min。

上述檢測血清4型禽腺病毒抗體的方法在另一種實施方式中，所述樣品OD_450nm大于臨界值0.130則判定該樣品為FAdV-4陽性。

上述檢測血清4型禽腺病毒抗體的方法在另一種實施方式中，所述陰性標準血清為采集自無特定病原的雞血清。

上述檢測血清4型禽腺病毒抗體的方法在另一種實施方式中，所述待檢血清還包括陽性標準血清，并且所述陽性標準血清為經(jīng)噬斑純化后FAdV-4型毒株滅活后通過皮下注射途徑免疫無特定病原雞，21天后再經(jīng)滴口途徑感染無特定病原雞，二次免疫后14天采集免疫雞的血分離的血清。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1)用于包被的fiber-2蛋白其氨基酸組成不保守，與不同血清型的抗原特異性相關，與其他血清型FAdV無交叉，利于較好的檢出FAdV-4，特異性佳；2)將FAdV-4標準陽性血清進行系列稀釋后，發(fā)現(xiàn)進行6400倍稀釋后利用本方法仍能檢測出FAdV-4陽性，表明該方法具有較高的敏感性；3)本發(fā)明對同一血清進行多次板內(nèi)及板間重復試驗，表明該方法變異系數(shù)小于10％，具有較好的重復性；4)該方法對其它常見禽病病原，如H5亞型禽流感病毒(AIV-H5)、H7亞型禽流感病毒(AIV-H7)、H9亞型禽流感病毒(AIV-H9)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、血清2型副粘病毒(APMV-2)、減蛋綜合征病毒(EDS)的陽性血清的檢測結果皆為陰性，沒有交叉反應，表明該方法亦具有良好的特異性；5)本發(fā)明對10份血清樣品測定的OD450值與樣品的中和效價具有良好的對應關系；6)本發(fā)明方法適用于養(yǎng)禽生產(chǎn)中進行FAdV-4血清抗體的檢測，具有高特異性、高敏感性、高重復性、低成本的特點，可在2h內(nèi)對FAdV-4的臨床血清樣品進行快速鑒別診斷，彌補了目前商品化試劑盒僅能檢測I群FAdV群特異性抗體的缺陷，針對引發(fā)肝炎-心包積液綜合征(安卡拉病)的FAdV-4抗體能進行快速檢測，并且為FAdV-4的血清學調(diào)查研究提供了可靠的技術手段。

附圖說明

圖1是使用特異性引物擴增fiber-2基因的ORF；

其中，1-M：Trans 5k Marker，1-1：fiber-2基因的ORF。

圖2是0.6mM IPTG誘導重組fiber-2蛋白表達的結果；

其中，2-M：Protein ladder，2-1：空載體對照，2-2：未誘導重組菌株，2-3：誘導后重組菌株上清，2-4：誘導后重組菌株沉淀。

圖3是重組fiber-2蛋白純化結果；

其中，3-M：Protein ladder，3-1：流穿液，3-2：洗液1，3-3：洗

液2，3-4：重組蛋白。

圖4是純化后fiber-2蛋白的Western Blotting結果；

其中，4-M：Protein ladder，4-1：以His-tag單抗為一抗，4-2：以FAdV-4陽性血清為一抗。

圖5是本發(fā)明方法的陰性臨界值測定結果。

圖6是本發(fā)明方法的敏感性檢測結果。

具體實施方式

下面結合附圖，對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述，但應當理解本發(fā)明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。

下列實施例中常規(guī)的實驗方法，參見Crowther編寫的ELISA指導。儀器的使用參照儀器操作說明。Biometra PCR自動循環(huán)儀購自北京北方華奧貿(mào)易有限公司；超聲波組織破碎儀購自Cole Parmer公司產(chǎn)品；Centrifuge 5810R低溫臺式離心機購自德國Eppendorf公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱購自太倉市實驗設備廠；SK-O180-E標準型圓周搖床購自美國SCILOGEX公司；MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；LHS-100CH溫箱購自上海一恒科學儀器有限公司Infinite F200PRO酶標儀購自TECON公司；protein ladder購自北京全式金生物技術有限公司；Prime STAR，dNTP及5×Buffer購自北京索萊寶科技有限公司；T4連接酶、Hind III及EcoR V限制性內(nèi)切酶購自北京百靈克生物科技有限責任公司；蛋白Loading buffer購自中科邁晨科技有限公司；雙組份TMB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀生物技術有限公司；即用型透析袋購自北京索萊寶科技有限公司；ELISA酶標反應板、細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶購自北京明豪至遠醫(yī)藥技術開發(fā)中心。

本發(fā)明實施例中選用的生物材料如下：BL21(DE3)感受態(tài)大腸桿菌購自北京全式金生物技術有限公司；雞肝癌細胞系、無特定病原雞血清、禽流感病毒陽性血清、新城疫病毒陽性血清、傳染性支氣管炎陽性血清、血清2型副粘病毒陽性血清、減蛋綜合征陽性血清、血清4型禽腺病毒JSJ13株及其陽性血清均由中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院保藏和提供。

實施例1用于包被抗原的fiber-2蛋白的表達

1、根據(jù)FAdV-4JSJ13株的fiber-2基因序列，設計帶有EcoRV及HindIII限制性內(nèi)切酶位的特異性引物。上游引物：5’-CCG GATATC ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAG-3’(EcoR V)，下游引物：5’-CCG AAGCTT TTACGGGAGGGAGGCCGCTGG-3’(Hind III)。將特異性引物用于擴增fiber-2基因的開放閱讀框(ORF)，長度為1440bp。

2、使用DNAVzol法提取JSJ13株的基因組，以其基因組為模板對fiber-2基因片段進行擴增。PCR反應體系如下：

Prime STAR高保真酶的PCR反應程序如下：

3、將目的片段進行膠回收純化后與pET-32a載體共同使用EcoR V及Hind III進行雙酶切，酶切反應體系如下：

將酶切后的線性pET-32a及fiber-2基因片段再次進行膠回收純化。

4、將帶有EcoR V及Hind III酶切位點的FAdV-4JSJ13株的fiber-2基因及pET-32a載體進行連接，反應在16℃金屬浴中過夜，連接體系如下：

將連接產(chǎn)物即重組質(zhì)粒pET-32a-fib2轉化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。具體步驟按照感受態(tài)細胞轉化使用說明書進行。

5、將序列測定正確的重組菌種接種于LBA液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)過夜的菌液按1:100比例接種于10mL LBA液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床200r/min振蕩培養(yǎng)2h。當菌液OD₆₀₀值達到0.4-0.6時，在菌液中加入IPTG至其終濃度至0.6mM，并將其置于30℃恒溫搖床200r/min振蕩培養(yǎng)5h?？蛰d體轉化后的菌株及不添加IPTG的重組菌株對照。將誘導后的重組菌株進行超聲處理，如圖2所示，重組蛋白以包含體及可溶形式同時表達。

實施例2用于包被抗原的fiber-2蛋白的純化

棄去重組菌株裂解后的菌體上清，保留菌體沉淀。按照His-tag包含體蛋白純化試劑盒說明書進行操作。純化完成后，收集流穿液與洗脫液進行SDS-PAGE檢驗。檢驗結果如圖3所示，通過使用高濃度的咪唑洗脫鎳柱，得到了純度較高的fiber-2蛋白。

實施例3用于包被抗原的fiber-2蛋白的特異性鑒定及復性

1、分別吸取25μL純化后蛋白至于新的離心管中，加入5μL6×Protein Loading Buffer充分混勻。將混勻后的樣品100℃水浴5min，冰浴2min。

2、配制凝膠后，將處理好的樣品重復加入上樣孔并進行垂直電泳90min。取出凝膠后，切取整個蛋白分子質(zhì)量大小的膠，并剪下面積相同的兩張PVDF膜浸泡于甲醇中活化。70V恒壓轉印60min。轉印完成后，將PVDF膜浸于5％脫脂乳中，37℃封閉1h。封閉完成后，將PVDF膜置于PBST中洗滌3次，5min/次。將兩張相同的PVDF膜分別浸于1:1000稀釋的His-tag單抗及1:200倍稀釋的JSJ13株陽性血清中。置于圓周搖床上，低速轉動，4℃孵育過夜。從稀釋的抗體中取出PVDF膜置于PBST中洗滌3次，10min/次。將PVDF膜浸于1:10000稀釋的酶標二抗中，置于圓周搖床上，室溫低速轉動1h。從稀釋的酶標二抗中取出PVDF膜置于PBST中洗滌3次，10min/次。向PVDF膜上加入化學發(fā)光試劑，置于化學發(fā)光成像系統(tǒng)下成像。

3、純化后的重組fiber-2蛋白放入即用型透析袋中，用夾子將兩端夾緊。浸于含有6M尿素的PBS溶液中，4℃透析12h。再更換溶液為含4M尿素的PBS溶液、2M尿素的PBS溶液及PBS中，透析時間不變。透析后吸出可溶性fiber-2蛋白，利用BCA法測定fiber-2蛋白的濃度。

實施例4檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法最佳抗原包被濃度、最佳顯色時間的摸索

本發(fā)明的間接ELISA步驟如下：

(1)利用1×ELISA包被液稀釋重組fiber-2蛋白，每孔加入100μL已稀釋的蛋白至ELISA反應板中，4℃過夜包被。

(2)每孔加入300μL PBST洗滌反應板3次，每次3min。

(3)將已配制的5％脫脂乳加至反應板中，每孔300μL，并將反應板置于溫箱中，37℃封閉2h。

(4)每孔加入300μL PBST洗滌反應板3次，每次3min。干燥后可放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(5)以封閉液稀釋待檢血清樣品，每孔加入100μL稀釋后血清至ELISA反應板中。將反應板置于溫箱中37℃孵育30min。

(6)每孔加300μL PBST洗滌反應板3次，每次3min。

(7)以封閉液稀釋酶標二抗，每孔加入100μL已稀釋的酶標二抗至ELISA反應板中，將反應板置于溫箱中37℃孵育30min。

(8)每孔加300μL PBST洗滌反應板3次，每次3min。

(9)將顯色A、B液混合，每孔加入100μL已混均的顯色液。將反應板置于37℃進行顯色反應。

(10)每孔加入50μL的2M硫酸，終止顯色反應。將反應板置于酶標儀中，在450nm波長下測定OD值(OD₄₅₀)。

選取蛋白包被濃度及顯色時間兩個條件進行摸索。

1、使用包被液將可溶性的fiber-2蛋白稀釋至1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL，每孔加入100μL已稀釋的蛋白進行包被。測定不同蛋白包被濃度下標準陽性血清及標準陰性血清的OD₄₅₀值。如表1所示，蛋白的最佳包被濃度為1.5μg/mL。

表1最佳抗原包被濃度的確定

2、在37℃條件下顯色，分別在顯色5min、10min、15min后加入終止液終止反應。測定不同顯色時間下的標準陽性血清及標準陰性血清的OD₄₅₀值。確定本方法的最佳顯色時間。如表2所示，顯色液最佳作用時間為10min。

表2顯色液最佳作用時間的確定

實施例5檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法最佳血清樣品、酶標二抗稀釋倍數(shù)的摸索

本發(fā)明選取了血清樣品最佳稀釋倍數(shù)及酶標二抗最佳稀釋倍數(shù)進行摸索。

1、將標準陽性血清及標準陰性血清進行1:50、1:100、1:200、1:300三個梯度稀釋，測定不同血清樣品稀釋度下，標準陽性血清及標準陰性血清的OD₄₅₀值。如表3所示，血清樣品的最佳稀釋倍數(shù)為1:200。

表3血清樣品最佳稀釋倍數(shù)的確定

2、將兔抗雞酶標二抗按照1:4000、1:6000、1:8000三個梯度進行稀釋。測定這三種條件下，標準陽性血清及標準陰性血清的OD₄₅₀值。摸索酶標二抗最佳稀釋度的結果如表4所示，1:6000為最佳條件。

表4酶標二抗最佳稀釋倍數(shù)的確定

實施例6檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法陰性臨界值確定

本發(fā)明選取已經(jīng)確定的間接ELISA最佳反應條件，測定35份FAdV-4陰性血清的OD₄₅₀值。利用統(tǒng)計學方法計算出35個陰性樣品的平均值和標準差(SD)。

樣品則判定該樣品為FAdV-4陽性。結果如圖5所示，計算出陰性臨界值為0.130

實施例7檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法敏感性與重復性檢測

1、將FAdV-4標準陽性血清按照1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800的比例進行稀釋。使用已建立的I-ELISA方法對不同稀釋倍數(shù)的血清進行檢測，測定間接ELISA的最低檢測限量。如圖6所示，在將標準陽性血清稀釋6400倍后仍能有效檢出FAdV-4的抗體，說明本發(fā)明具有較高的敏感性。

2、利用建立的間接ELISA方法檢測標準陽性及陰性血清的重復性。在同一板內(nèi)及不同板間，每份血清重復10次，計算間接ELISA測得的OD₄₅₀平均值標準差(SD)和變異系數(shù)(CV)。重復性結果如表5、6所示，標準陽性及陰性血清的板內(nèi)與板間重復性均小于10％，說明本發(fā)明具有較好的重復性。

表5同一板內(nèi)陽性、陰性血清重復性試驗結果

表6不同板間陽性、陰性血清重復性試驗結果

實施例8檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法交叉反應性檢測

使用本發(fā)明方法測定臨床禽病病原H5亞型禽流感病毒(AIV-H5)、H7亞型禽流感病毒(AIV-H7)、H9亞型禽流感病毒(AIV-H9)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、血清2型副粘病毒(APMV-2)、減蛋綜合征病毒(EDS)的陽性血清的OD₄₅₀值。結果如表7所示，交叉反應均為陰性，說明本發(fā)明與其他臨床常見禽病病原不存在交叉反應。

表7本發(fā)明方法與其他病原陽性血清的交叉反應

實施例9檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法與血清中和試驗的對應關系

選取本發(fā)明方法測定OD₄₅₀值后的9份血清，及標準陽性血清(共10份)進行血清中和試驗，確定本發(fā)明方法與血清中和試驗是否具有對應關系。具體步驟如下：

(1)將JSJ13毒株稀釋為200TCID₅₀病毒液，用于以下試驗。

(2)向血清中加入等體積青鏈霉素混合溶液，4℃過夜處理后56℃水浴30min，滅活血清。

(3)使用DMEM將血清樣品連續(xù)2倍比稀釋。向每一稀釋度血清中加入等體積的病毒液，37℃孵育1h。

(4)倒掉96孔細胞原有的細胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞一次。將病毒與血清混合液接種于細胞中，每孔100μL，37℃孵育2h。每個血清樣品的每個稀釋梯度重復4孔。

(5)倒棄細胞孔中的血清病毒混合液，每孔加入200μL細胞維持液，37℃培養(yǎng)7天。

培養(yǎng)期結束后，將細胞板至于顯微鏡下觀察每孔細胞狀態(tài)。若細胞變大變圓，發(fā)生聚集則為細胞病變，記錄10個血清每一稀釋度的細胞病變數(shù)，用Reed-Muench法(Reed and Muench，1983)計算血清中和效價。結果如表8所示，本發(fā)明測定的FAdV抗體效價與中和試驗測定的血清中和效價具有良好的對應關系。

表8血清樣品OD450值與血清中和試驗結果的比較

實施例10使用本發(fā)明檢測臨床樣品中FAdV-4特異性抗體

選取15個來自河北、北京、遼寧和山東的肉種雞場，其中每個種雞場采集樣品30份。450份臨床血清樣品的背景信息如表9所示。利用本發(fā)明方法測定450份血清樣品的OD₄₅₀值。雞群1到9為未免疫種雞，使用本發(fā)明檢測9個雞群的FAdV-4抗體陽性率低，且抗體滴度較低。來自這9個雞群的樣品OD₄₅₀值范圍多在0.00-0.253之間。雞群10到15免疫了FAdV-4組織滅活疫苗，使用本發(fā)明檢測這6個雞群的FAdV-4抗體，陽性率均大于73.3％，且血清抗體滴度較高，多數(shù)血清樣品OD₄₅₀值＞1.0。對15個雞群FAdV的血清抗體檢測結果顯示，未經(jīng)免疫的健康雞只體內(nèi)含有的FAdV-4抗體滴度較低，而免疫了FAdV疫苗的雞只體內(nèi)可產(chǎn)生較高的FAdV-4抗體。本發(fā)明建立的間接ELISA方法對來自不同采樣時間及不同采樣地點的血清樣本均適用。

前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應用，從而使得本領域的技術人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。

序列表

<110> 中國農(nóng)業(yè)大學

<120> 檢測血清4型禽腺病毒抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測方法

<130> P170359DD1F

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ccggatatca tgctccgggc ccctaaaaga ag 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ccgaagcttt tacgggaggg aggccgctgg 30

<210> 3

<211> 1440

<212> DNA

<213> 禽腺病毒屬（Fowl aviadenovirus C）

<400> 3

atgctccggg cccctaaaag aagacattcc gaaaacggga agcccgagac cgaagcggga 60

ccttccccgg ctccaatcaa gcgcgccaaa cgcatggtga gagcatccca gcttgacctg 120

gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccc gtcggagggc tcaacccgcc ttttttggga 180

ggctcaggac ccctagtgga ccagggcgga cagcttacgc tcaacgtcac cgatcccatc 240

atcatcaaga acagatcggt ggacttggcc cacgacccca gtctcgatgt caacgcccaa 300

ggtcaactgg cggtggccgt tgaccccgaa ggggccctgg acatcacccc cgatggactg 360

gacgtcaagg tcgacggagt gaccgtaatg gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa 420

gtcgacccgt ccggcggatt ggattccacc gcgggtggac tgggggtcag cgtggacgac 480

accttgctcg tggatcaggg agaactgggc gtacacctca accaacaagg acccatcact 540

gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg 600

accggaagcg gagtgctgga actcaaccta aaagcgcagg gaggcatcca agccgacagt 660

tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc ctacagattg tcaacaacac tctggaagtg 720

aaaccggatc ccagcggacc gcttacggtc tccgccaatg gcctagggct gaagtacgac 780

actaataccc tagcggtgac cgcgggcgct ttaaccgtgg tcggaggggg gagcgtctcc 840

acacccatcg ctacttttgt ctcgggaagt cccagcctca acacctacaa tgccacgacc 900

gtcaattcca gcgcgaacgc cttctcttgc gcctactacc ttcaacagtg gaacatacag 960

gggctccttg ttacctccct ctacttgaaa ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct 1020

ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 1080

caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga acggtcagcc cctccaccgc caccctcacg 1140

gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg accagcccat ggacgtactc ggccaatgga 1200

tactatgaac catccatcgg ggaattccaa gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg 1260

aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc cccgtgccgg tttcggcctc cggagagcga 1320

tacacccttc tatgctatag tctgcagtgc acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac 1380

agcggaacca tgatcgtggg acccgtgctc tacagctgtc cagcggcctc cctcccgtaa 1440

<210> 4

<211> 479

<212> PRT

<213> 禽腺病毒屬（Fowl aviadenovirus C）

<400> 4

Met Leu Arg Ala Pro Lys Arg Arg His Ser Glu Asn Gly Lys Pro Glu

1 5 10 15

Thr Glu Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro Ile Lys Arg Ala Lys Arg Met

20 25 30

Val Arg Ala Ser Gln Leu Asp Leu Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Val Ala

35 40 45

Asp Pro Val Gly Gly Leu Asn Pro Pro Phe Leu Gly Gly Ser Gly Pro

50 55 60

Leu Val Asp Gln Gly Gly Gln Leu Thr Leu Asn Val Thr Asp Pro Ile

65 70 75 80

Ile Ile Lys Asn Arg Ser Val Asp Leu Ala His Asp Pro Ser Leu Asp

85 90 95

Val Asn Ala Gln Gly Gln Leu Ala Val Ala Val Asp Pro Glu Gly Ala

100 105 110

Leu Asp Ile Thr Pro Asp Gly Leu Asp Val Lys Val Asp Gly Val Thr

115 120 125

Val Met Val Asn Asp Asp Trp Glu Leu Ala Val Lys Val Asp Pro Ser

130 135 140

Gly Gly Leu Asp Ser Thr Ala Gly Gly Leu Gly Val Ser Val Asp Asp

145 150 155 160

Thr Leu Leu Val Asp Gln Gly Glu Leu Gly Val His Leu Asn Gln Gln

165 170 175

Gly Pro Ile Thr Ala Asp Ser Ser Gly Ile Asp Leu Glu Ile Asn Pro

180 185 190

Asn Met Phe Thr Val Asn Thr Ser Thr Gly Ser Gly Val Leu Glu Leu

195 200 205

Asn Leu Lys Ala Gln Gly Gly Ile Gln Ala Asp Ser Ser Gly Val Gly

210 215 220

Val Ser Val Asp Glu Ser Leu Gln Ile Val Asn Asn Thr Leu Glu Val

225 230 235 240

Lys Pro Asp Pro Ser Gly Pro Leu Thr Val Ser Ala Asn Gly Leu Gly

245 250 255

Leu Lys Tyr Asp Thr Asn Thr Leu Ala Val Thr Ala Gly Ala Leu Thr

260 265 270

Val Val Gly Gly Gly Ser Val Ser Thr Pro Ile Ala Thr Phe Val Ser

275 280 285

Gly Ser Pro Ser Leu Asn Thr Tyr Asn Ala Thr Thr Val Asn Ser Ser

290 295 300

Ala Asn Ala Phe Ser Cys Ala Tyr Tyr Leu Gln Gln Trp Asn Ile Gln

305 310 315 320

Gly Leu Leu Val Thr Ser Leu Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Ala Thr Met

325 330 335

Gly Asn Arg Pro Gly Asp Leu Asn Ser Ala Asn Ala Lys Trp Phe Thr

340 345 350

Phe Trp Val Ser Ala Tyr Leu Gln Gln Cys Asn Pro Ser Gly Ile Gln

355 360 365

Ala Gly Thr Val Ser Pro Ser Thr Ala Thr Leu Thr Asp Phe Glu Pro

370 375 380

Met Ala Asn Arg Ser Val Thr Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Ala Asn Gly

385 390 395 400

Tyr Tyr Glu Pro Ser Ile Gly Glu Phe Gln Val Phe Ser Pro Val Val

405 410 415

Thr Gly Ala Trp Asn Pro Gly Asn Ile Gly Ile Arg Val Leu Pro Val

420 425 430

Pro Val Ser Ala Ser Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr Ser Leu

435 440 445

Gln Cys Thr Asn Ala Ser Ile Phe Asn Pro Asn Asn Ser Gly Thr Met

450 455 460

Ile Val Gly Pro Val Leu Tyr Ser Cys Pro Ala Ala Ser Leu Pro

465 470 475