本申請屬于體外診斷和微流控技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種細(xì)胞分離制片染色一體裝置和循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells,ctcs)是指從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散進(jìn)入外周循環(huán)血液系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞，它的出現(xiàn)標(biāo)志著腫瘤細(xì)胞已經(jīng)開始從病灶組織向四周擴(kuò)散，從而可能導(dǎo)致更多器官組織產(chǎn)生病變。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞可在腫瘤發(fā)生的早期出現(xiàn)，且研究表明約90％的癌癥死亡案例與ctcs擴(kuò)散有關(guān)，因此，ctcs檢測在重大疾病的早期預(yù)防、治療效果評估、藥物敏感性測試及腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測等醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面具有十分重要的意義。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的最大難題在于其數(shù)量極少：通常在臨床上，人們研究的對象是一個(gè)非齊性總體，其中包含了大量的細(xì)胞信息，而ctcs對人體正常血細(xì)胞的比例僅約為1:109，或在1ml血液中僅有1～100個(gè)ctcs,因此在檢測前必須對其進(jìn)行分選富集，以去除血液中的大部分紅細(xì)胞和白細(xì)胞。

理想的ctcs分選應(yīng)能達(dá)到以下三點(diǎn)要求：首先要能將盡量多的非目標(biāo)細(xì)胞分離出去，其次要在特定的出口收集到盡量多的目標(biāo)細(xì)胞；最后要考慮到ctcs數(shù)量稀少導(dǎo)致需要處理的樣本量較大以及細(xì)胞活性等因素，要求能在短時(shí)間內(nèi)處理大量的樣品。

傳統(tǒng)的細(xì)胞分選多在宏觀尺度下進(jìn)行，如離心分選、化學(xué)溶解、基于熒光或磁珠技術(shù)的抗體標(biāo)記分選等，這些方法雖然成熟可靠，但系統(tǒng)復(fù)雜、操作繁瑣、需要樣品量大，在細(xì)胞轉(zhuǎn)移、容器更換及樣品化學(xué)處理等環(huán)節(jié)極易造成目標(biāo)細(xì)胞的損失，難以滿足上述三點(diǎn)分選要求。

目前唯一通過美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的用于血液中ctcs分選、計(jì)數(shù)的商業(yè)化產(chǎn)品，cellsearch采用外面包被了特異性抗體抗epcam(上皮細(xì)胞粘附因子)的免疫納米磁珠，通過抗原抗體反應(yīng)，與血液中表達(dá)epcam的ctcs結(jié)合，并進(jìn)一步通過熒光反應(yīng)識別ctcs。該計(jì)數(shù)雖然擁有較高的靈敏度，但存在儀器及消耗的試劑昂貴，并且采用抗體捕獲細(xì)胞的局限性大，并不是所有的腫瘤細(xì)胞都表達(dá)epcam，檢測效率較低。

興起于20世紀(jì)90年代的微流控技術(shù)，通過微米級別的流道精確操控微升、毫升級別的樣品。得益于其特征尺寸與細(xì)胞尺寸正好匹配，微流控技術(shù)在細(xì)胞分選方面優(yōu)勢巨大。與常規(guī)分選方法相比，微流控器件具有消耗樣品量少，有較高的分辨精度及靈敏度、易于集成及微型化等優(yōu)點(diǎn)，且在微流控器件中可以連續(xù)地實(shí)現(xiàn)樣品注入-細(xì)胞分選-目標(biāo)細(xì)胞識別的整個(gè)過程，極大簡化操作，并減少細(xì)胞損失。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞分離制片染色一體裝置和捕獲方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本申請實(shí)施例公開一種細(xì)胞分離制片染色一體裝置，包括基材以及沿第一方向延伸于基材內(nèi)的溝道，所述溝通位于第一方向的兩端分別形成有樣品入口和樣品出口，所述溝道內(nèi)并列設(shè)置有n排微柱陣列，n≥2，每排所述微柱陣列沿第二方向延伸，所述第二方向垂直于所述第一方向，每排所述微柱陣列分別包括間隔設(shè)置的多個(gè)微柱，相鄰所述微柱之間形成有捕捉間隙，并滿足：

(a)、自樣品入口至樣品出口方向，第x排微柱陣列的捕捉間隙＞第x+1排微柱陣列的捕捉間隙，1≤x＜n；

(b)、第n排微柱陣列的捕捉間隙小于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的外徑。

優(yōu)選的，在上述的細(xì)胞分離制片染色一體裝置中，所述基材包括上下疊加設(shè)置的聚二甲基硅氧烷和標(biāo)準(zhǔn)載玻片，所述溝通形成于聚二甲基硅氧烷和標(biāo)準(zhǔn)載玻片之間。

相應(yīng)的，本申請還公開了一種細(xì)胞分離制片染色一體裝置的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法，包括步驟：

(1)、采用紅細(xì)胞裂解液裂解腫瘤病人血樣中的紅細(xì)胞，離心吸取上清液，用細(xì)胞緩沖液重懸剩余細(xì)胞；

(2)、將獲得的細(xì)胞懸液從樣品入口通入微流控芯片中，將細(xì)胞固定液通入微流控芯片中，完成循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，步驟(1)中，所述的細(xì)胞裂解液為紅細(xì)胞裂解液。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，細(xì)胞緩沖液為牛血清白蛋白和tewwn20的磷酸緩沖液。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，細(xì)胞固定液為4％多聚甲醛水溶液。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，還包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞熒光染色步驟：

(3)、將細(xì)胞透膜液通入微流控芯片中，對細(xì)胞進(jìn)行透膜；將細(xì)胞清洗液通入微流控芯片，對透膜后的細(xì)胞進(jìn)行清洗；將免疫熒光染料通入微流控芯片中，避光孵育，對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色；將細(xì)胞核染料通入微流控芯片中，靜置，對細(xì)胞核進(jìn)行染色；將細(xì)胞清洗液通入微流控芯片，對染色后的細(xì)胞進(jìn)行清洗。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，所述細(xì)胞透膜液為表面活性劑tritonx100水溶液。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，所述細(xì)胞清洗液為磷酸緩沖液。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，所述的免疫熒光染料為抗細(xì)胞角蛋白熒光染料；所述的細(xì)胞核染料為hoechst染料。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明采用微流控芯片技術(shù)，與傳統(tǒng)的方法相比具有消耗樣品量少、有較高的分辨精度及靈敏度、易于集成及微型化等優(yōu)點(diǎn)。另外基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞外形尺寸不同的特性進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲，并不依賴于epcam抗體的表達(dá)，可以識別所有的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，避免假陽性和假陰性的結(jié)果。

附圖說明

為了更清楚地說明本申請實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本申請中記載的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中細(xì)胞分離制片染色一體裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2所示為圖1中a的放大示意圖；

圖3所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中被捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞抗細(xì)胞角蛋白染料表達(dá)陽性的染色圖；

圖4所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中被捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核染料表達(dá)陽性染色圖。

圖5所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中被捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞白細(xì)胞共同抗原染料表達(dá)陰性染色圖。

具體實(shí)施方式

循環(huán)腫瘤細(xì)胞：從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散進(jìn)入外周循環(huán)血液系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞。

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

結(jié)合圖1和圖2所示，細(xì)胞分離制片染色一體裝置，包括基材1以及沿第一方向延伸于基材內(nèi)的溝道2，溝通2位于第一方向的兩端分別形成有樣品入口3和樣品出口4，溝道2內(nèi)并列設(shè)置有n排微柱陣列5，n≥2，每排微柱陣列5沿第二方向延伸，第二方向垂直于第一方向，每排微柱陣列5分別包括間隔設(shè)置的多個(gè)微柱6，相鄰微柱6之間形成有捕捉間隙7，并滿足：

(a)、自樣品入口至樣品出口方向，第x排微柱陣列的捕捉間隙＞第x+1排微柱陣列的捕捉間隙，1≤x＜n；

(b)、第n排微柱陣列的捕捉間隙小于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的外徑。

進(jìn)一步地，基材1包括上下疊加設(shè)置的聚二甲基硅氧烷(pdms)和標(biāo)準(zhǔn)載玻片，溝通形成于聚二甲基硅氧烷和標(biāo)準(zhǔn)載玻片之間。

該技術(shù)方案中，微流控芯片采用多段微住陣列結(jié)構(gòu)串聯(lián)而成，注入芯片中的細(xì)胞依據(jù)其自身尺寸的不同會在微柱陣列處被捕獲。同時(shí)提供的檢測試劑盒包括：紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞緩沖液、細(xì)胞固定液、細(xì)胞透膜液、細(xì)胞清洗液、免疫熒光染料、細(xì)胞核染料。檢測試劑盒主要用于血樣的前處理以及在微流控芯片中捕獲到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的識別。本案主要用于腫瘤的早期診斷、預(yù)后評估、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移檢測、快速判斷化療效果以及指導(dǎo)個(gè)體化醫(yī)療。

基于細(xì)胞分離制片染色一體裝置的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲和檢測方法，包括步驟：

1)、血樣的前處理：

a:腫瘤病人血樣為2ml人體外周血，采用紅細(xì)胞裂解液裂解腫瘤病人血樣中的紅細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液優(yōu)選為利用細(xì)胞內(nèi)外存在鹽離子濃度差而導(dǎo)致細(xì)胞膜脹破的原理來裂解無核紅細(xì)胞。

b：紅細(xì)胞裂解后離心吸取上清液。

c:紅細(xì)胞裂解不完全時(shí)重復(fù)上述步驟1-2次。

d:上清液去除后，試管底部剩余白細(xì)胞和癌細(xì)胞，用細(xì)胞緩沖液重懸剩余細(xì)胞，細(xì)胞緩沖液優(yōu)選為牛血清白蛋白(bsa)和tewwn20(非離子型去污劑)的磷酸緩沖液。

2)、微流控芯片捕獲癌細(xì)胞。

a:將上述獲得的細(xì)胞懸液按一定流速通入芯片中。

b:將細(xì)胞固定液通入芯片中，完成循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲，細(xì)胞固定液優(yōu)選為4％多聚甲醛水溶液。

3)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞熒光染色。

a:將細(xì)胞透膜液通入芯片中，對細(xì)胞進(jìn)行透膜，細(xì)胞透膜液優(yōu)選為表面活性劑tritonx100(非離子型表面活性劑)水溶液。

b:將細(xì)胞清洗液通入芯片，對透膜后的細(xì)胞進(jìn)行清洗，細(xì)胞清洗液優(yōu)選為磷酸緩沖液。

c:將免疫熒光染料通入芯片中，避光孵育，對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，免疫熒光染料優(yōu)選為抗細(xì)胞角蛋白熒光染料。

d:將細(xì)胞核染料通入芯片中，靜置，對細(xì)胞核進(jìn)行染色，細(xì)胞核染料優(yōu)選為hoechst染料。

f:將細(xì)胞清洗液通入芯片，對染色后的細(xì)胞進(jìn)行清洗。

g:在熒光顯微鏡下觀察。

圖3所示為本實(shí)施例中被捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞抗細(xì)胞角蛋白染料表達(dá)陽性的染色圖。

圖4所示為本實(shí)施例中被捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核染料表達(dá)陽性染色圖。

圖5所示為本實(shí)施例中被捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞白細(xì)胞共同抗原染料表達(dá)陰性染色圖。

只有當(dāng)抗細(xì)胞角蛋白染料和hoechst染料同時(shí)表達(dá)陽性，白細(xì)胞共同抗原染料表達(dá)陰性時(shí)，才能判定該細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

綜上所述，本案基于人體外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞間外形尺寸的差異，采用多段微住陣列結(jié)構(gòu)串聯(lián)而成的微流控芯片進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲。并采用免疫組化的方法對捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識別。

在此，還需要說明的是，為了避免因不必要的細(xì)節(jié)而模糊了本發(fā)明，在附圖中僅僅示出了與根據(jù)本發(fā)明的方案密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)和/或處理步驟，而省略了與本發(fā)明關(guān)系不大的其他細(xì)節(jié)。

最后，還需要說明的是，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。