本發(fā)明屬于化學(xué)檢測領(lǐng)域，尤其是一種ase-hplc法測定馬鞭草中齊墩果酸和熊果酸含量的方法。
背景技術(shù)：
：馬鞭草為馬鞭草科植物的干燥地上部分。其性涼，味苦，無毒；具有清熱解毒、破血通經(jīng)、活血散瘀、利尿消腫的功效。研究表明，馬鞭草具有明顯抗炎、抗早孕及抗人絨毛膜癌的作用，進一步研究得知，其抗癌的有效成分為齊墩果酸和熊果酸。齊墩果酸和熊果酸為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)與性質(zhì)均極其相似，在天然植物中往往共生互存，分離測定較為困難。2005年版的《中國藥典》(一部)采用薄層掃描色譜法測定馬鞭草中熊果酸含量，此法受薄層板、溫度、點樣、顯色等諸多因素影響，易導(dǎo)致定量分析結(jié)果偏差，且無法準確測定出另外一種有效成分—齊墩果酸的含量。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述不足，本發(fā)明旨在提供一種可同時測定馬鞭草中齊墩果酸和熊果酸含量，且操作簡便、靈敏度高、穩(wěn)定性良好的ase-hplc法。為了實現(xiàn)上述技術(shù)效果，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ase-hplc法測定馬鞭草中的齊墩果酸和熊果酸總含量的方法，依次包括下述步驟：步驟1：采用ase法用甲醇對粉碎后的馬鞭草進行萃取，收集甲醇萃取液；步驟2：采用hplc法測定馬鞭草中齊墩果酸和熊果酸的含量，其中所用色譜柱為thermoacclaimc30。進一步的，步驟2所述的色譜柱的規(guī)格為3μm，2.1*150mm。進一步的，所述的步驟1包括下述子步驟：步驟s1：將馬鞭草樣品粉碎過三號篩，取0.25g與1g硅藻土混合；步驟s2：將步驟1所得混合物放于裝有纖維濾膜的10mlase萃取池，加硅藻土至與池口平行；步驟s3：用25ml甲醇進行萃取，結(jié)束后用甲醇定容至25ml，得甲醇萃取液。進一步的，步驟s3所述的萃取，參數(shù)如下：萃取溫度為100℃，萃取時間為6min，萃取次數(shù)為1次，壓力為1500psi，沖洗體積為60％，吹掃時間為60s。進一步的，步驟2所述的hplc法的檢測參數(shù)如下：柱溫為40℃；流速為0.3ml/min；流動相為甲醇-0.2％醋酸；檢測波長為205nm。進一步的，所述的流動相的甲醇-0.2％醋酸的體積比為90:10。進一步的，所述的ase法所使用的儀器為美國dionex公司的ase350快速溶劑萃取儀、hplc法所采用的儀器為安捷倫-1290高效液相色譜儀。本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，具有以下優(yōu)點：1.本發(fā)明曾對快速溶劑萃取使用的溶劑進行考察，有論文提到使用70％乙醇提取齊墩果酸和熊果酸相對含量較高，故對使用甲醇和70％乙醇和無水乙醇進行了溶劑考察，結(jié)果顯示甲醇、70％乙醇和無水乙醇提取齊墩果酸和熊果酸含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用甲醇作為提取溶劑；2.本發(fā)明考察了萃取次數(shù)對其影響，實驗中取樣品對其進行萃取1次、2次、3次，分析其結(jié)果，結(jié)果表明萃取一次幾乎完全，故實驗采用萃取一次的方法；3.本發(fā)明提高了溫度降低溶劑的黏度，減少了溶劑進入樣品基體的阻止，增加了溶劑進入樣品基體的擴散，降低溶劑和樣品基體之間的表面張力，使溶劑溶解待測物的容量增加；4.由于液體對溶質(zhì)的溶解能力遠大于氣體對溶質(zhì)的溶解能力，故萃取液體的沸點隨壓力升高而提高，從而使溶劑在高溫高壓下仍保持在液態(tài)。附圖說明圖1為齊墩果酸對照品和熊果酸對照品混合液的色譜圖；圖2為采用ase-hplc法測定的樣品中齊墩果酸和熊果酸的色譜圖；圖3為采用藥典方法測定的樣品中齊墩果酸和熊果酸的色譜圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護范圍內(nèi)所做的有限次修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護范圍內(nèi)。實施例11.儀器設(shè)備及試劑1.1儀器：電子分析天平(xa205du)、ase350快速溶劑萃取儀(美國dionex公司)、高效液相色譜儀(1290)1.2試劑(除特別注明外，本實驗所用試劑均為分析純)：水：符合gb/t6682規(guī)定的一級水；甲醇(ch4o)：色譜純(液相色譜用)；乙醇(c2h5oh)：分析純。2方法2.1對照品溶液的制備：取齊墩果酸對照品、熊果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含齊墩果酸50μg、熊果酸0.1mg的混合溶液，即得。2.2供試品溶液的制備2.2.1《中國藥典》2015年版一部制備供試品方法：取本品粉末(過四號篩)約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇25ml，稱定重量，加熱回流4小時，放冷，再稱定重量，用無水乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10ml，加1％氨水溶液3ml，混勻，用石油醚(30～60℃)振搖提取3次，每次15ml，棄去石油醚液，取乙醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。2.2.2快速溶劑萃取法(ase)制備供試品方法：樣品經(jīng)粉碎機粉碎，過三號篩，取0.25g，精密稱定，與約1g硅藻土混合均勻，待用，移入到預(yù)先放好纖維濾膜的ase10ml萃取池中再加入適量硅藻土，輕輕振搖使之與池口在同一水平線上，擰緊萃取池上蓋，放入快速萃取儀中進行萃取。萃取結(jié)束后，把萃取液轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用少量甲醇清洗萃取瓶3次合并至容量瓶中，使用甲醇定容至刻度，即得。2.3ase萃取條件所述的萃取，參數(shù)如下：萃取溫度為100℃，萃取時間為6min，萃取次數(shù)為1次，壓力為1500psi，沖洗體積為60％，吹掃時間為60s。2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.2％醋酸溶液(82.5:17.5)為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器檢測。理論板數(shù)按熊果酸峰計算應(yīng)不低于5000。2.5測定法照高效液相色譜法(通則0512)測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。檢測參數(shù)如下：儀器：安捷倫-高效液相色譜儀(1290)；色譜柱為thermoacclaimc30，3μm，2.1*150mm；柱溫為40℃；流速為0.3ml/min；流動相為體積比為90:10的甲醇-0.2％醋酸；檢測波長為205nm。2.6標(biāo)準限值要求本品按干燥品計算，含齊墩果酸(c30h48o3)和熊果酸(c30h48o3)的總量不得少于0.30％。2.7計算(外標(biāo)法)式中cr——對照品溶液濃度，單位為微克每升(mg/l)；ax——供試品的峰面積；ar——對照品峰面積。注意：使用前萃取池底部應(yīng)拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；萃取池底部的濾紙應(yīng)在密封圈內(nèi)，否則引起滲漏；萃取池裝樣時松緊適中，太松容易導(dǎo)致提取液過多；開機前檢查氣瓶氣壓是否達到1mpa；使用結(jié)束后清理干凈，萃取池要及時晾干(容易生銹)。3結(jié)果3.1色譜圖圖1為齊墩果酸對照品和熊果酸對照品混合液的色譜圖；圖2為采用ase-hplc法測定的樣品中齊墩果酸和熊果酸的色譜圖；圖3為采用藥典方法測定的樣品中齊墩果酸和熊果酸的色譜圖。其中，在圖1-3中齊墩果酸的保留時間為5.424min、熊果酸的保留時間為5.907。3.2重復(fù)性試驗取相同批號的樣品(批號：20150801)0.5g，共6份，精密稱定，按ase提取方法提取供試品溶液，進樣量為3μl，以上述的色譜條件平行試驗，測得樣品中齊墩果酸和熊果酸含量的含量見表1，rsd為2.4％，試驗表明ase提取方法重復(fù)性良好。表13.3樣品含量測定結(jié)果(3批)本發(fā)明分別使用了兩臺快速溶劑萃取儀及藥典方法對馬鞭草樣品進行提取，提取結(jié)果見表2：表2ase1與藥典方法提取樣品中齊墩果酸和熊果酸總含量的數(shù)據(jù)對比結(jié)果見表3：表3批號ase1藥典平均值rad％150628010.3680.3160.3427.6015071030.4140.3550.3857.67201508010.4000.3430.3727.67ase2與藥典方法提取樣品中齊墩果酸和熊果酸總含量的數(shù)據(jù)對比結(jié)果見表4：表4批號ase2藥典平均值rad％150628010.3850.3160.3519.8415071030.4010.3550.3786.08201508010.3820.3430.3635.38兩臺ase儀器間的數(shù)據(jù)對比見表5：表5批號ase1ase2平均值rad％150628010.3680.3850.3772.2615071030.4140.4010.4081.60201508010.4000.3820.3912.304討論4.1ase提取溶劑的選擇：試驗中，曾對快速溶劑萃取使用的溶劑進行考察，有論文提到使用70％乙醇提取齊墩果酸和熊果酸相對含量較高，故對使用甲醇和70％乙醇和無水乙醇進行了溶劑考察，結(jié)果顯示甲醇、70％乙醇和無水乙醇提取齊墩果酸和熊果酸含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用甲醇作為提取溶劑。4.2ase提取條件的優(yōu)化在上述實驗基礎(chǔ)上，本實驗主要考察萃取次數(shù)對其影響，實驗中取樣品對其進行萃取1次、2次、3次，分析其結(jié)果，結(jié)果表明萃取一次幾乎完全。故實驗采用萃取一次的方法。當(dāng)前第1頁12