本發(fā)明屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種熒光/比色雙探針快速檢測食品中亞硝酸鹽的方法。

背景技術(shù)：

在傳統(tǒng)食品工業(yè)如肉制品(如香腸、紅燒肉制品等)加工過程中，亞硝酸鹽常作為常用的發(fā)色劑和風味劑，可獲得理想的色澤和風味，同時具有一定的抗菌防腐能力。但是亞硝酸鹽在酸性環(huán)境中與仲胺、叔胺、酞胺及氨基酸共存時，可形成具有強烈致癌作用的n一亞硝胺(nitrosamines)類化合物。因此，控制食品中亞硝酸胺的前體化合物亞硝酸鹽含量具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

目前國內(nèi)外報道的測定no2^-的方法，大多數(shù)采用分光光度法、催化動力學(xué)法、電化學(xué)分析法、色譜分析法等。但這些方法需要大型儀器設(shè)備，不利于食品的現(xiàn)場檢測。此外，食品中往往存在復(fù)雜的基質(zhì)干擾和分析物濃度低等特點，因此，針對食品樣品中亞硝酸鹽現(xiàn)場快速檢測需求，開發(fā)針對食品樣品中亞硝酸鹽的現(xiàn)場快速檢測方法非常必要。

熒光分析通常具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點，能夠為復(fù)雜的環(huán)境樣品中微量及痕量物質(zhì)的分析提供手段，目前廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和無機化學(xué)等領(lǐng)域。目視比色法是比色標準系列法，將樣品顯色溶液與標準色階的各比色管進行比較，能夠直觀快速分辨出樣品濃度的平均值，其主要優(yōu)點是設(shè)備簡單和操作簡便。熒光/比色法用于水樣中亞硝酸檢測具有操作簡便、靈敏度高、抗干擾能力強和應(yīng)用范圍廣等特點。該方法為建立現(xiàn)場、快速、高選擇性和高靈敏度的分析檢測方法提供了重要的參考價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)在食品方面檢測亞硝酸鹽的不足，本發(fā)明提供了一種熒光/比色雙探針快速檢測食品中亞硝酸鹽的方法；其具有衛(wèi)星式納米結(jié)構(gòu)的金納米棒-偶氮化試劑-金納米球，根據(jù)其熒光強度和顏色變化用于食品中的亞硝酸鹽的現(xiàn)場快速檢測。

本發(fā)明原理主要是利用在酸性條件下納米粒子修飾的對巰基苯胺和1,8-二氨基萘，對巰基苯胺修飾的金納米棒、1,8-二氨基萘修飾的金納米球，與亞硝酸鹽離子反應(yīng)生成偶氮化合物，該化合物的顏色隨亞硝酸鹽的濃度增加而加深，熒光強度隨亞硝酸鹽的濃度增強而降低。通過對顏色強弱和熒光強度對no2^-進行定性和定量分析。

本發(fā)明的技術(shù)方案具體介紹如下。

一種熒光/比色雙探針快速檢測食品中亞硝酸鹽的方法，具體步驟如下：

(1)在酸性水溶液中，將金納米棒表面修飾對巰基苯胺，制備對巰基苯胺修飾的金納米棒；

(2)在乙醇水溶液中，將金納米球表面修飾1,8-二氨基萘，制備1,8-二氨基萘修飾的金納米球；

(3)將步驟(1)和步驟(2)的兩種納米材料按照比例混合后，加入到若干含有已知不同亞硝酸鹽濃度的標準溶液中，形成具有衛(wèi)星式納米結(jié)構(gòu)的金納米棒-偶氮化試劑-金納米球，然后將其滴加到濾紙上，獲取其日光燈和紫外燈下的光學(xué)照片；

(4)將步驟(3)按比例混合的兩種納米材料滴加到待測食品中，通過比色法和熒光法進行同時分析檢測；通過比對步驟(3)中樣品和待測食品在日光燈下顏色和熒光燈下強度，從而實現(xiàn)對食品中亞硝酸鹽的現(xiàn)場快速定性和定量分析。

本發(fā)明中，步驟(1)中，金納米棒的平均粒徑在80～120nm之間；步驟(2)中，金納米球的平均粒徑在1～3nm之間。

本發(fā)明中，步驟(3)和步驟(4)中，所述兩種納米材料的質(zhì)量比為1:1～1:50。

本發(fā)明中，步驟(3)中，已知不同的亞硝酸鹽濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0和10μmol/l。

本發(fā)明中，步驟(3)中，兩種納米材料混合后滴加到濾紙上，獲取其日光燈和紫外燈下光學(xué)照片；步驟(4)中，將步驟(3)按比例混合的兩種納米材料滴加到待測含亞硝酸鹽的溶液中，通過比對步驟(3)中濾紙上和待測溶液的顏色和熒光強度，從而實現(xiàn)對待測溶液中亞硝酸鹽的現(xiàn)場快速定性和定量分析。

與現(xiàn)有檢測方法相比，本發(fā)明的有益效果在于：

1、通過對巰基苯胺修飾的金納米棒與1,8-二氨基萘修飾的金納米球混合制備亞硝酸鹽的偶合試劑，在檢測亞硝酸鹽時可形成基于氮氮雙鍵的衛(wèi)星式納米結(jié)構(gòu)，該納米材料可實現(xiàn)亞硝酸鹽的濃縮和富集，而且具有制備簡單，方便推廣使用等特點。

2、采用日光和熒光雙分子探針肉眼檢測食品中亞硝酸鹽，檢測范圍很寬(0～10μm)，更加直觀，具有操作簡便、分析快速和現(xiàn)場檢測等特點，可滿足食品市場中亞硝酸鹽的檢測需求；目視比色法根據(jù)樣品顏色與標準色階相比較，能夠直觀快速判斷出樣品濃度。本發(fā)明制備的淡橙色偶合試劑，利用亞硝酸鹽存在時，變成深紫色顏色，可以實現(xiàn)高濃度的亞硝酸鹽檢測，具有檢測范圍寬、快速等優(yōu)點。

3、本發(fā)明的偶合試劑具有熒光性，可以檢測復(fù)雜環(huán)境樣品中痕量物質(zhì)。在亞硝酸鹽存在時，利用1,8-二氨基萘的熒光猝滅，實現(xiàn)低濃度的亞硝酸鹽檢測，具有檢測限低、背景干擾小等優(yōu)點。

附圖說明

圖1a是本發(fā)明實施例1的日光燈下對巰基苯胺修飾的金納米棒、圖1b是1,8-二氨基萘修飾的金納米球、圖1c是偶合試劑(對巰基苯胺修飾的金納米棒+1,8-二氨基萘修飾的金納米球)加入亞硝酸鹽的光學(xué)圖片。

圖2a是本發(fā)明實施例1的紫外燈照射下對巰基苯胺修飾的金納米棒、圖2b是1,8-二氨基萘修飾的金納米球、圖2c是偶合試劑(對巰基苯胺修飾的金納米棒+1,8-二氨基萘修飾的金納米球)加入亞硝酸鹽的熒光圖片。

圖3是本發(fā)明實施例1的偶合試劑(對巰基苯胺修飾的金納米棒+1,8-二氨基萘修飾的金納米球)與亞硝酸鹽反應(yīng)形成的衛(wèi)星式結(jié)構(gòu)納米傳感器。

圖4是本發(fā)明實施例1中偶合試劑與不同濃度(0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0和10μmol/l)亞硝酸鹽顯色所得光學(xué)圖片和紫外燈下圖片。

圖5是本發(fā)明應(yīng)用例1的火腿腸的日光下光學(xué)圖片，a、b和c分別為添加0、1.0和5.0μmol/l亞硝酸鹽的樣品。

圖6是本發(fā)明應(yīng)用例1的火腿腸的紫外燈下熒光圖片，a、b和c分別為添加0、1.0和5.0μmol/l亞硝酸鹽的樣品。

圖7是本發(fā)明應(yīng)用例2的紅燒肉的日光下光學(xué)圖片，a、b和c分別為添加0、1.0和5.0μmol/l亞硝酸鹽的樣品。

圖8是本發(fā)明應(yīng)用例2的紅燒肉的紫外燈下熒光圖片，a、b和c分別為添加0、1.0和5.0μmol/l亞硝酸鹽的樣品。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細闡述。

實施例1

(1)晶種法制備金納米棒

制備金納米種子溶液：室溫條件下(25-28℃)，配制9.75ml0.1mol/l十六烷基溴化銨水溶液，均勻攪拌至透明，滴加0.25ml0.01mol/l四氯金酸水溶液，待其在溶液中均勻分散后，快速加入新鮮配制的0℃的0.01mol/lnabh4溶液0.6ml，溶液由淺黃色變成棕黃色，均勻攪拌3min，室溫靜置2h后備用。此時金濃度0.25mmol。

制備金納米棒溶液：室溫條件下，配制10ml0.1mol/l的十六烷基三甲基溴化銨水溶液，再加入0.5ml0.01mol/l四氯金酸水溶液，混合均勻后再加入0.1ml0.01mol/lagno3，0.2ml1mhcl，充分攪拌，加入80μl0.1mol/l抗壞血酸，溶液由深黃色變?yōu)闊o色，加入12μl已制備好的金種子溶液，均勻攪拌3分鐘，室溫靜置6h。

純化金納米棒溶液：制備好的金納米棒溶液通過8000r離心5min，去除溶液中多余的溶質(zhì)，富集溶膠，用純水洗滌，溫度降到10℃，除去結(jié)晶的ctab。

(2)制備有機相金納米球

稱取1.5g四辛基溴化銨溶于80ml甲苯中，劇烈均勻攪拌后快速加入42ml10mg/ml氯金酸水溶液，氯金酸由黃色變成橙棕色，分離出有機相，再加入118μl十二硫醇，室溫攪拌10min，然后在劇烈的攪拌下，10s加完nabh4(0.38g溶于25ml水)，溶液變成黑色，繼續(xù)攪拌30min，再在室溫下靜置3h。有機相進行旋蒸除去多余甲苯，再用30ml乙醇超聲分散，通過濾膜抽濾，用80ml乙醇，150ml丙酮洗滌，最后空氣干燥。

(3)對巰基苯胺修飾的金納米棒

在容量瓶中配對巰基苯胺(8mg/ml)，同時包含5％hcl，用乙醇溶解，加入少量水定容。移取5ml對巰基苯胺和5ml的金納米棒溶液(吸光度在1左右)，在室溫時振蕩孵育1h，6000r離心，去除多余的金納米棒，同時超聲30min，使其溶液充分分布均勻，所得對巰基苯胺修飾的金納米棒的光學(xué)圖片如圖1a所示。熒光圖片如圖2a所示，由圖可見，對巰基苯胺修飾的金納米棒顏色為褐色且無熒光。

(4)1,8-二氨基萘修飾的金納米球

在容量瓶中配1,8二氨基萘(4mg/ml)，用乙醇溶解，加入少量水定容。移取5ml1,8-二氨基萘和5ml金種子溶液，在室溫時振蕩孵育1h，8000r離心，去除多余的金種子顆粒，同時超聲30min，使其溶液充分分布均勻如圖1b，所示所得1,8-二氨基萘修飾的金納米球的光學(xué)圖片如圖1b中所示，熒光圖片如圖2b中所示，由圖可見，1,8-二氨基萘修飾的金納米球顏色為淺紅色且有較強熒光。

(5)對巰基苯胺修飾的金納米棒與1,8-二氨基萘修飾的金納米球，混合制備偶合試劑及其應(yīng)用于亞硝酸鹽的檢測。

將上述對巰基苯胺修飾的金納米棒溶液與1,8-二氨基萘修飾的金種子溶液各取5ml，以便檢測食品中亞硝酸鹽。同時配制一定量亞硝酸鹽溶液，加入偶合試劑中，形狀深紫色偶氮化合物如圖1c所示，熒光圖片如圖2c中所示，由圖可見，偶氮化合物顏色為紫黑色且有較弱熒光。通過電鏡可以看出該含有亞硝酸鹽的偶合試劑呈現(xiàn)出衛(wèi)星式納米結(jié)構(gòu)(圖3)。

(6)基于亞硝酸偶合試劑的比色試紙用于亞硝酸鹽的紫外和熒光雙模式檢測

首先將whatmann濾紙裁剪為1×2cm的矩形，再分別準備移取100μl上述亞硝酸鹽的偶合試劑(等體積的對巰基苯胺修飾的金納米棒和1,8-二氨基萘修飾的金種子納米球)，均勻涂敷于濾紙上，然后使其在陰涼通風處干燥15min，收集包裹偶合試劑的濾紙，密封保存。

配制一系列不同濃度(0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0和10μmol/l)的亞硝酸鹽標準溶液，準確移取10μl上述標準溶液涂敷于包裹偶合試劑的濾紙上，室溫反應(yīng)5min，可觀測不同濃度亞硝酸具有不同顏色和熒光變化，如圖4所示。比色法的檢測范圍為0～10μmol/l，熒光法的檢測范圍為0～5.0μmol/l，此外，當亞硝酸鹽濃度較低時(0～1.0μmol/l)，熒光信號較強，當亞硝酸鹽濃度較高時(1.0～10μmol/l)，反應(yīng)所得產(chǎn)物的紫色明顯，兩者均可通過肉眼直接觀測，因此，該法可實現(xiàn)不同濃度范圍的同時分析檢測。

應(yīng)用例1

將實施例1中制備的偶合試劑(對巰基苯胺修飾的金納米棒和1,8-二氨基萘修飾的金種子納米球)，用于亞硝酸鹽的檢測試劑，用于測定火腿腸中亞硝酸鹽的含量。

選取市場不同的火腿腸，簡單處理成片狀，將火腿腸樣品分別置于0、1.0和5.0μmol/l的亞硝酸鹽標準溶液中浸泡24h，再取出樣品置于陰涼通風處干燥10min，最后滴加所制備的亞硝酸鹽偶合試劑(對巰基苯胺修飾的金納米棒與1,8-二氨基萘修飾的金納米球)，通過圖5顏色對比可以觀測到，當亞硝酸鹽為0μmol/l時，溶液為輕微透明，如圖5a所示；當亞硝酸鹽為1.0μmol/l時，生成的偶氮化合物的顏色加深，如圖5b所示；當亞硝酸鹽的濃度為5.0μm時，偶氮化合物顏色變成深紫色，如圖5c所示。在365nm紫外燈的照射下，如圖6所示，隨著亞硝酸鹽的濃度增加時，偶氮化合物的熒光逐漸減弱。為了對熒光/比色法的分析結(jié)果進行對比，采用離子色譜儀對待測火腿腸中亞硝酸鹽進行定量分析，在樣品預(yù)處理過程中，選擇了合適的煮沸時間和冷凍時間，有效地去除了蛋白質(zhì)和脂肪等有機物，過濾后可以直接進樣。選擇了合適的淋洗液及其濃度、流量，獲得了較好的分離效果，通過與標準樣品的分析結(jié)果進行對比，換算出樣品中亞硝酸鹽濃度。表1是本發(fā)明應(yīng)用例1的火腿腸采用不同分析方法分析的結(jié)果。通過表1看出紫外/熒光法與加標值結(jié)果相近，而且離子色譜測定火腿腸中亞硝酸鹽含量與比色試紙法測定出來誤差較小，說明本法的準確度高，因此通過肉眼比色和熒光法可用于現(xiàn)場快速檢測火腿腸中亞硝酸鹽含量。

表1

應(yīng)用例2

將實施例1中制備的偶合試劑(對巰基苯胺修飾的金納米棒和1,8-二氨基萘修飾的金種子納米球)用于亞硝酸鹽的檢測試劑，用于測定紅燒肉中亞硝酸鹽的含量。

紅燒肉是主要的腌制品，對于亞硝酸鹽的發(fā)色劑與防腐劑尤為重要。購買市場不同顏色的紅燒肉，通過對紅燒肉表面簡單處理成塊狀，將紅燒肉樣品分別置于0、1.0和5.0μm的亞硝酸鹽標準溶液中浸泡24h，再取出樣品置于陰涼通風處干燥10min，最后滴加所制備的亞硝酸鹽偶合試劑(對巰基苯胺修飾的金納米棒與1,8-二氨基萘修飾的金納米球)，通過圖7顏色對比可以觀測到，隨著亞硝酸鹽濃度增加，生成的偶氮化合物顏色加深，紅燒肉表面顯現(xiàn)出淺紫色和深紫色。此外，在365nm紫外燈的照射下，當亞硝酸鹽為0μm時，溶液熒光強度非常強，如圖8a所示；當亞硝酸鹽為1.0μm時，生成的偶氮化合物讓其熒光猝滅，熒光減弱，如圖8b所示；當亞硝酸鹽的濃度為5.0μm時，顯示偶氮產(chǎn)物的熒光非常弱，如圖8c所示；為了對熒光/比色法的分析結(jié)果進行對比，采用離子色譜法對待測紅燒肉中亞硝酸鹽進行定量分析，選擇是適當?shù)奶幚矸椒?，合適的淋洗液及其濃度、流量，獲得了較好的分離效果，通過與標準樣品的分析結(jié)果進行對比，換算出樣品中亞硝酸鹽濃度。表2是本發(fā)明應(yīng)用例2的紅燒肉采用不同分析方法分析的結(jié)果。

表2

通過表2看出熒光/比色法與加標值結(jié)果相近，而且離子色譜測定紅燒肉中亞硝酸鹽含量與比色試紙法測定出來誤差較小，說明此方法準確度高，因此通過肉眼比色和熒光法可用于現(xiàn)場快速檢測紅燒肉中亞硝酸鹽的含量。