本發(fā)明涉及一種精確熒光定量檢測(cè)方法，特別涉及一種利用熒光融合蛋白的精確定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

至上世紀(jì)70年代，發(fā)明酶標(biāo)檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)以來(lái)，免疫診斷行業(yè)已發(fā)生了翻天覆地的變化，使免疫檢測(cè)領(lǐng)域得到了快速成長(zhǎng)。但由于酶標(biāo)檢測(cè)體系檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，中間過(guò)程操作煩瑣，試劑檢測(cè)范圍窄，靈敏度低等缺點(diǎn)，因此該系統(tǒng)也慢慢的退出了臨床檢測(cè)的歷史舞臺(tái)。隨之而來(lái)的相繼又發(fā)明了膠體金標(biāo)技術(shù)平臺(tái)，化學(xué)發(fā)光，時(shí)間分辨熒光檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)以及免疫芯片技術(shù)平臺(tái)等。

免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)是近年發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)展起來(lái)的一種快速免疫分析技術(shù)。其原理是樣本液在毛細(xì)遷移作用下在硝酸纖維素膜上遷移，其中的待測(cè)物與膜上一定區(qū)域的抗體(抗原)結(jié)合，通過(guò)有色標(biāo)記物，十幾分鐘甚至幾分鐘內(nèi)即可得到肉眼可見的直觀結(jié)果。免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)不需將游離的抗體(抗原)和形成復(fù)合物的抗體(抗原)進(jìn)行分離，省去了繁瑣洗滌步驟，因而操作便捷，出報(bào)告時(shí)間短，在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)、急診、現(xiàn)場(chǎng)、家庭自檢等場(chǎng)所得到了廣泛的應(yīng)用。常用的標(biāo)記物為膠體金顆粒、酶、熒光蛋白以及微球等。

其中，熒光標(biāo)記技術(shù)具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，已被廣泛用于生物檢測(cè)領(lǐng)域。如dna測(cè)序、蛋白表達(dá)分析、細(xì)胞成像、活體成像、臨床診斷等。熒光微球技術(shù)是將聚苯乙烯羧基微球、熒光染料標(biāo)記系統(tǒng)、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)及微球?qū)Ｓ昧魇郊?xì)胞儀等有機(jī)整合在一起的一項(xiàng)新技術(shù)，通過(guò)熒光微球信號(hào)來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集和分析，具有快速分析多重生物反應(yīng)的特點(diǎn)及高靈敏度和特異性，可用于抗原抗體、核酸探針檢測(cè)等領(lǐng)域的研究。

熒光檢測(cè)生物體液中疾病標(biāo)志蛋白的有干式免疫方法采用熒光微球偶聯(lián)抗體，結(jié)合疾病標(biāo)志蛋白，然后用激發(fā)光激發(fā)熒光物質(zhì)，光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換光信號(hào)為電信號(hào)，通過(guò)計(jì)算機(jī)計(jì)算電信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)測(cè)定疾病標(biāo)志蛋白含量。例如，實(shí)用新型cn205679621u涉及一種心衰疾病檢測(cè)系統(tǒng)，具體涉及一種用于心腦血管疾病檢測(cè)的免疫熒光檢測(cè)儀，包括橫向免疫熒光層析試劑卡和微型數(shù)字化檢測(cè)儀，微型數(shù)字化檢測(cè)儀包括冷光源熒光檢測(cè)組件、光電強(qiáng)度數(shù)字轉(zhuǎn)換計(jì)算組件和顯示器，橫向免疫熒光層析試劑卡活動(dòng)插接在冷光源熒光檢測(cè)組件內(nèi)，冷光源熒光檢測(cè)組件獲取橫向免疫熒光層析試劑卡的熒光信號(hào)并將其傳輸至光電強(qiáng)度數(shù)字轉(zhuǎn)換計(jì)算組件，所述光電強(qiáng)度數(shù)字轉(zhuǎn)換計(jì)算組件將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)并輸送至顯示器。所述的檢測(cè)儀，使檢測(cè)者在家就能進(jìn)行心腦血管疾病檢查，并直接獲取數(shù)據(jù)結(jié)果，可實(shí)現(xiàn)快速定量的獲取橫向免疫熒光層析試劑卡的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

然而，通常的熒光微球多為表面偶聯(lián)抗體，即將抗體分子通過(guò)特定的官能團(tuán)偶聯(lián)到微球表面制得，由于熒光微球大小不一致，表面修飾的反應(yīng)基團(tuán)量非恒定，熒光均一性較差等不足，采用熒光微球檢測(cè)抗體時(shí)通常存在以下缺陷，例如：1)不能定量偶聯(lián)抗體，熒光值與抗體結(jié)合比不固定；2)固定過(guò)程中ph，鹽濃度變化等對(duì)抗體活性造成影響，一般批量生產(chǎn)后需要對(duì)檢測(cè)試劑，工藝復(fù)雜；3)熒光微球偶聯(lián)抗體會(huì)導(dǎo)致空間位阻，影響與抗原結(jié)合，定量不準(zhǔn)確；4)熒光微球?yàn)?0-100um直徑，在橫向免疫中擴(kuò)散速度較慢一般需要15分鐘左右時(shí)間。因此，如今迫切需要一種新的檢測(cè)方法，即可以快速檢測(cè)、又可以精確定量，并且還便于攜帶，隨時(shí)隨地都可以使用。

抗體結(jié)合蛋白a(proteina)來(lái)源于金黃色葡萄球菌的一個(gè)株系，它含有5個(gè)可以和抗體igg分子的fc段特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。蛋白a作為親和配基被偶聯(lián)到瓊脂糖基質(zhì)上，可以特異性的和樣品中的抗體分子結(jié)合，而使其他雜蛋白流穿，具有極高的選擇性，一步親和層析就可達(dá)到超過(guò)95％的純度。1個(gè)蛋白a分子至少可以結(jié)合2個(gè)igg。蛋白a也可以結(jié)合另一些免疫球蛋白，如用于某些種屬的iga、igm的純化。

抗體結(jié)合蛋白g是一種源自鏈球菌g族的細(xì)胞表面蛋白，為三型fc受體。其通過(guò)類似于蛋白a的非免疫機(jī)制與抗體的fc段結(jié)合。像蛋白a樣，蛋白g可以與igg的fc區(qū)域特異性結(jié)合，不同的是，proteing瓊脂糖凝膠可以廣泛、更強(qiáng)地結(jié)合更多類型的igg，多克隆igg及人igg，同時(shí)血清蛋白結(jié)合水平更低，純度更高，配基脫落也相對(duì)更低。此外，蛋白g還可以和某些抗體的fab和f(ab’)2段結(jié)合。

因此可以看出，抗體結(jié)合蛋白如(proteina/g)是不同來(lái)源抗體純化首選介質(zhì)，約70-80％的抗體純化使用proteina、proteing親和層析。因此，在本領(lǐng)域的廣泛認(rèn)知中，蛋白g和蛋白a在抗體領(lǐng)域一般都是用于抗體純化，本領(lǐng)域中還未見利用在熒光檢測(cè)中使用抗體結(jié)合蛋白如(proteina/g)進(jìn)行定量標(biāo)記抗體的報(bào)道。

當(dāng)前，心血管疾病如急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，ami)在世界范圍內(nèi)已成為成年人最大的潛在殺手，近年來(lái)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)心血管病的死亡率在人口死亡中占40％，已高于歐美國(guó)家，屬心血管病高發(fā)國(guó)。因此，只有做到早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)及早救治，才能最大限度的防止致殘、致死后果，最大限度的改善心血管患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。20世紀(jì)90年代以來(lái)，臨床化學(xué)家們逐漸將診斷ami的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到心肌蛋白標(biāo)志物上。其中心肌肌鈣蛋白(cardiactroponin，ctn)是唯一存在于心肌中的收縮蛋白，對(duì)心肌壞死具有高度的敏感性和特異性。

心肌肌鈣蛋白是由ctni、ctnc以及ctnt組成的復(fù)合物，在肌肉收縮和舒張過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。其中，ctnc沒(méi)有心肌特異性，較少用于心肌損傷的檢查。在正常狀態(tài)下，ctni和ctnt均不能透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入血液循環(huán)，故健康人血內(nèi)不含或含極低量的ctni、ctnt；當(dāng)心肌細(xì)胞受損后，ctni及ctnt彌散進(jìn)人細(xì)胞間質(zhì)，較早的出現(xiàn)在外周血中。通常，心肌肌鈣蛋白在發(fā)病后3h～5h即可升高，15h～24h達(dá)高峰，持續(xù)時(shí)間久，5d～10d后降至正常。但ctnt在心臟中具有四個(gè)亞型，特異性低于ctni，且在腎衰竭、橫紋肌溶解病、肺炎和敗血癥等疾病中，血液中ctnt通常也可增高，故在檢測(cè)中會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。與此相反，ctni在心肌中無(wú)其它亞型，特異性高于ctnt，此外其分子量亦小于ctnt，在ami發(fā)病時(shí)，更早被釋放于血液中，因此，ctni可謂目前診斷ami最好的心肌損傷標(biāo)志物之一。

現(xiàn)有技術(shù)中多用放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法及膠體金免疫層析法等測(cè)定ctni。但放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法操作復(fù)雜，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)；化學(xué)發(fā)光法對(duì)技術(shù)要求高，不易在臨床實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行常規(guī)開展。膠體金免疫層析法雖然具有標(biāo)本用量少，簡(jiǎn)便快速，便宜的優(yōu)勢(shì)，然而當(dāng)遇到某些樣品中抗原或抗體含量極低時(shí)，膠體金的顏色將很淺，很難用肉眼來(lái)判斷結(jié)果，容易出現(xiàn)誤判，靈敏度較低。而普通的熒光免疫層析方法又存在無(wú)法定量偶聯(lián)抗體、對(duì)抗體活性有影響等缺陷。因此基于上述，本發(fā)明的發(fā)明人還將本發(fā)明所述熒光融合蛋白應(yīng)用到ctni診斷中，從而實(shí)現(xiàn)ctni精確定量檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在閱讀了優(yōu)選實(shí)施方案和所附權(quán)利要求的詳細(xì)描述后，本發(fā)明的這些和其他目的、優(yōu)點(diǎn)和用途將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯示出來(lái)。本發(fā)明旨在提供一種精確熒光定量檢測(cè)方法，特別涉及一種利用熒光融合蛋白的精確定量檢測(cè)方法，還涉及一種熒光融合蛋白，以及一種精確熒光定量檢測(cè)試劑條、試劑盒及其制備方法。

申請(qǐng)人出人意料的發(fā)現(xiàn)，利用抗體結(jié)合蛋白如(proteina/g)在抗體fc段結(jié)合2個(gè)抗體分子，能定量、定向固定抗體；同時(shí)抗體結(jié)合蛋白如(proteina/g)上預(yù)先通過(guò)基因工程技術(shù)融合紅色熒光蛋白。該方法能定量標(biāo)記抗體，且在一般緩沖液中反應(yīng)；紅色熒光在血液自發(fā)光中背景低；由于蛋白分子小，在橫向免疫擴(kuò)散中穿透速度快，反應(yīng)時(shí)間一般5-8分鐘就可以結(jié)束，減少長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間中抗原在結(jié)合墊中沉積效應(yīng)。

因此，本發(fā)明提供了一種精確熒光定量檢測(cè)方法，所述方法包括以下步驟：

a)取血液，混入磷酸鹽緩沖液后加到試紙條的加樣墊上，所述試紙條包含有ctni單克隆抗體熒光蛋白復(fù)合物，所述熒光融合蛋白為熒光蛋白-proteing融合蛋白或熒光蛋白-proteina融合蛋白，所述的復(fù)合物為熒光融合蛋白和抗體按1:2摩爾比制備而成；

b)將試紙條放入免疫熒光定量分析儀中，定量得出被測(cè)物質(zhì)的濃度；

c)依據(jù)參考值判定陰陽(yáng)性。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述的精確熒光定量檢測(cè)方法包括以下步驟：

a)用采血管10ul血液，混入90ul磷酸鹽緩沖液后加到試紙條的加樣墊上，所述試紙條包含有ctni單克隆抗體熒光蛋白復(fù)合物，所述熒光融合蛋白為熒光蛋白-proteing融合蛋白或熒光蛋白-proteina融合蛋白，所述的復(fù)合物為熒光融合蛋白和抗體按1:2摩爾比制備而成；

b)將試紙條放入免疫熒光定量分析儀中，免疫熒光定量分析儀對(duì)光學(xué)信號(hào)進(jìn)行測(cè)量和分析處理，5-8分鐘后讀取數(shù)據(jù)，定量得出被測(cè)物質(zhì)的濃度；

c)據(jù)已知熒光蛋白數(shù)量的光學(xué)信號(hào)值計(jì)算血液中抗體結(jié)合的抗原量。

優(yōu)選的，所述熒光融合蛋白為熒光蛋白-proteing融合蛋白或熒光蛋白-proteina融合蛋白。進(jìn)一步地，所述熒光融合蛋白為氨基酸序列如seqidno：1所示的蛋白。優(yōu)選的，所述熒光蛋白為紅色熒光蛋白或過(guò)渡金屬(如eu²⁺標(biāo)記)的時(shí)間分辨熒光蛋白。

本發(fā)明還涉及一種熒光融合蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqidno：1所示。進(jìn)一步地涉及編碼所述熒光融合蛋白的dna、載體以及重組菌。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還涉及一種精確熒光定量檢測(cè)試劑條，以及包含所述試劑條的或試劑盒。所述試劑條包含硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板、吸水墊、樣品墊、熒光結(jié)合墊，所述結(jié)合墊中包含抗體-熒光融合蛋白復(fù)合物。所述熒光融合蛋白為熒光蛋白-proteing融合蛋白或熒光蛋白-proteina融合蛋白。進(jìn)一步地，所述熒光融合蛋白的氨基酸序列如seqidno：1所示。優(yōu)選的，所述熒光蛋白為紅色熒光蛋白或過(guò)渡金屬(如eu²+標(biāo)記)的時(shí)間分辨熒光蛋白。

優(yōu)選地，所述熒光融合蛋白和抗體按固定摩爾比，優(yōu)選為按照1：2摩爾比混合后，通過(guò)分子篩純化形成抗體-熒光蛋白復(fù)合物。

優(yōu)選地，所述硝酸纖維素膜為切成y型細(xì)條。

進(jìn)一步地，所述熒光標(biāo)記物還可以是熒光微球，熒光分子，過(guò)渡元素等。

此外，本申請(qǐng)還涉及一種含熒光融合蛋白的試紙條的制備方法，具體方法如下：

1)硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板的制備：將硝酸纖維素膜切成y型細(xì)條，貼在pvc底板上，將鼠抗人單抗在硝酸纖維素膜上劃線得到檢測(cè)線；將兔抗鼠在硝酸纖維素膜上劃線得到質(zhì)控線，然后將硝酸纖維素膜-pvc底板置于干燥箱干燥；

2)將熒光融合蛋白和抗體1：2摩爾比混合后，通過(guò)分子篩純化得到抗體-熒光蛋白復(fù)合物，保存?zhèn)溆茫?/p>

3)結(jié)合墊的制備：將結(jié)合墊切成細(xì)條，將鼠抗人ctni單克隆抗體熒光蛋白復(fù)合物按照2：1混合，均勻鋪在結(jié)合墊上，放入烘箱烤干；

4)樣品墊的制備：將玻璃纖維膜切成細(xì)條；

5)吸收墊的制備：將吸水紙切成細(xì)條；

6)組裝：將上述吸水墊、樣品墊、熒光結(jié)合墊依次貼在pvc底板上，切成合適形狀的試劑條。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的含熒光融合蛋白的試紙條的制備方法，具體方法如下：

1)硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板的制備：將硝酸纖維素膜切成y型細(xì)條(40-60)mm×(2-4)mm，貼在pvc底板上。將鼠抗人單抗在硝酸纖維素膜上劃線得到檢測(cè)線；將兔抗鼠在硝酸纖維素膜上劃線得到質(zhì)控線。然后將硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板置于干燥箱干燥；

2)將熒光融合蛋白和抗體1：2摩爾比混合后，通過(guò)分子篩純化得到抗體-熒光蛋白復(fù)合物。保存?zhèn)溆茫?/p>

3)結(jié)合墊的制備：將結(jié)合墊切成(40-60)mm×(6-12)mm細(xì)條，將鼠抗人ctni單克隆抗體-熒光蛋白復(fù)合物按照2：1混合，均勻鋪在結(jié)合墊上，放入烘箱烤干；

4)樣品墊的制備：將玻璃纖維膜切成(6-12)mm×(6-12)mm細(xì)條；

5)吸收墊的制備：將吸水紙切成(3-6)mm×(6-12)mm細(xì)條；

6)組裝：將上述吸水墊、樣品墊、熒光結(jié)合墊依次貼在pvc底板上，將貼好的中間物，用激光切割機(jī)切成合適形狀的試劑條。

基于上述，本發(fā)明利用熒光蛋白融合抗體結(jié)合蛋白，能定量標(biāo)記抗體，且不影響抗體結(jié)合的空間位阻，增加了檢測(cè)靈敏度，減少反應(yīng)時(shí)間，減少成本。此外，本發(fā)明的試劑條采用y型結(jié)構(gòu)，加快流速，減少反應(yīng)時(shí)間，采集熒光利用cmos疊加和mppc單光子技術(shù)，增加靈敏度。

附圖說(shuō)明

圖1表示本發(fā)明熒光定量檢測(cè)試劑條俯視圖，其中1為樣品墊，2為吸收墊，3為結(jié)合墊。

圖2表示本發(fā)明熒光定量檢測(cè)試劑條側(cè)視圖，其中1為樣品墊，2為吸收墊，3為結(jié)合墊。

圖3表示本發(fā)明的熒光檢測(cè)方法與普通熒光檢測(cè)方法曲線比較。

圖4表示本發(fā)明的熒光檢測(cè)方法與普通熒光檢測(cè)方法曲線極限值比較。

具體實(shí)施方式

需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例1熒光融合蛋白的制備

1)通過(guò)載體序列擴(kuò)增紅色熒光蛋白基因，同時(shí)擴(kuò)增抗體結(jié)合蛋白基因，擴(kuò)增序列通過(guò)平末端連接，然后用pcr擴(kuò)增融合蛋白基因，引物序列、反應(yīng)體系以及擴(kuò)增體系分別見表1和表2。

表1引物序列

表2反應(yīng)體系以及擴(kuò)增程序

2)通過(guò)基因工程手段，把seqidno：1裝入表達(dá)載體，表達(dá)熒光蛋白-proteing融合蛋白。把基因序列裝入pet-28a表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)化入bl21(de3)菌，用iptg誘導(dǎo)表達(dá)，具體步驟如下：

插入pgem-teasy載體，連接體系：pcr產(chǎn)物與pgem-teasy連接：pcr產(chǎn)物15μl，pgem-teasy0.5μl，t4連接酶2μl，連接緩沖液2μl，4℃連接24-48小時(shí)。

連接產(chǎn)物取出10μl，加入100μl感受態(tài)細(xì)胞，靜置30-60分鐘，放入42℃水浴中45-90秒后立刻置冰上2分鐘，然后加入800μllb培養(yǎng)基，37℃搖動(dòng)1-2小時(shí)。取出100μl涂于含有80μg/mlx-gal和100μg/ml氨芐青霉素的lb瓊脂糖培養(yǎng)平板。

挑取白斑后在1ml含有100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中37℃搖動(dòng)4-12小時(shí)，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證插入片段序列。選取完全一致序列的克隆，然后在5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中37℃搖動(dòng)24小時(shí)。

通過(guò)康為抽提質(zhì)粒試劑盒抽提質(zhì)粒，獲得5μg質(zhì)粒后進(jìn)行酶切。用內(nèi)切酶bamhi2μl、xhoi2μl、smartcutbuffer5μl、質(zhì)粒和水40μl、37℃水浴4-12小時(shí)。通過(guò)瓊脂糖電泳后切取目的條帶，通過(guò)膠回收試劑盒提取目的dna片段。

連接pet28a質(zhì)粒：預(yù)切pet28a質(zhì)粒1μl，融合蛋白dna15μl，t4連接酶2μl連接緩沖液2μl，4℃連接24-48小時(shí)。

連接產(chǎn)物取出10μl，加入100μl感受態(tài)細(xì)胞，靜置30-60分鐘，放入42℃水浴中45-90秒后立刻置冰上2分鐘，然后加入800μllb培養(yǎng)基，37℃搖動(dòng)1-4小時(shí)。取出100μl涂于含有卡那霉素的lb瓊脂糖培養(yǎng)平板。

挑取白斑后在1ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中37℃搖動(dòng)4-12小時(shí)，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證插入片段序列。選取完全一致序列的克隆，然后在5ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中37℃搖動(dòng)24-48小時(shí)。

通過(guò)康為抽提質(zhì)粒試劑盒抽提質(zhì)粒，獲得5ng-1μg質(zhì)粒后加入100μlde3感受態(tài)細(xì)胞，靜置30分鐘，放入42℃水浴中45-90秒后立刻置冰上2分鐘，然后加入800μllb培養(yǎng)基，37℃搖動(dòng)1-4小時(shí)。取出100μl涂于含有50μg/ml卡那霉素的lb瓊脂糖培養(yǎng)平板。

挑取白斑后在1ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中37℃搖動(dòng)4-12小時(shí)。然后加入500ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基，待菌液濃度達(dá)到od600＝0.8時(shí)，加入iptg試劑誘導(dǎo)。37℃搖動(dòng)8-12小時(shí)。離心收獲菌體。

涉及的裂解緩沖液、清洗液、洗脫液見表3

表3裂解緩沖液、清洗液、洗脫液

3)用gehealthcareni²⁺sepharose4b純化，隨后用sephacryls-200純化43kd融合蛋白，蛋白為深紅色，其純度可達(dá)95％以上。具體步驟如下：

5g濕菌體中加入50ml的裂解緩沖液，冰浴并用超聲破碎，4℃12,000g離心30分鐘，收集上清，然后使用gehealthcare的蛋白純化填料ni-sepharose瓊脂純化融合蛋白，4℃過(guò)柱平衡過(guò)夜，用清洗液洗ni-sepharose瓊脂，清洗20ml后加入洗脫液洗脫蛋白。

所獲純化蛋白用半透膜透析，然后用peg8000稀釋濃縮樣品(10倍濃縮)。融合蛋白和抗體按固定比例混合，4℃混勻過(guò)夜。然后樣品用分子篩分離，取最先流出組份。測(cè)量濃度后備用。

實(shí)施例2熒光定量檢測(cè)試劑條或試劑盒的制備

1)硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板的制備：將硝酸纖維素膜切成y型細(xì)條52mm×3mm，貼在pvc底板上。將鼠抗人單抗在硝酸纖維素膜上劃線得到檢測(cè)線；將兔抗鼠在硝酸纖維素膜上劃線得到質(zhì)控線。然后將硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板置于干燥箱干燥。

2)將熒光融合蛋白和抗體1：2摩爾比混合后，通過(guò)分子篩純化得到抗體-熒光蛋白復(fù)合物，保存?zhèn)溆谩?/p>

3)結(jié)合墊的制備：將結(jié)合墊切成52mm×10mm細(xì)條，將鼠抗人ctni單克隆抗體-熒光蛋白復(fù)合物、按照2：1比例混合后的純化液，均勻鋪在結(jié)合墊上，放入烘箱烤干。

4)樣品墊：將玻璃纖維膜切成10mm×10mm細(xì)條。

5)吸收墊：將吸水紙切成5mm×10mm細(xì)條。

6)組裝：將上述吸水墊、樣品墊、熒光結(jié)合墊依次貼在pvc底板上，將貼好的中間物，用激光切割機(jī)切成合適形狀的試劑條，如圖1和圖2所示，1為樣品墊，2為吸收墊，3為結(jié)合墊。

實(shí)施例3試紙條或試劑盒的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及檢測(cè)效果評(píng)價(jià)

3.1標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

將購(gòu)買的ctni熒光蛋白-proteing融合蛋白用50％的小牛血清緩沖液配制0，0.5，2.5，5，10，25，50，100ng/ml八個(gè)濃度。在測(cè)試區(qū)加入100μl樣品后，等待5分鐘，用儀器讀取熒光值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝f(x)。y：樣品濃度；x：熒光信號(hào)值。每批的每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試5次記錄其相應(yīng)的熒光信號(hào)值。熒光值由機(jī)器讀出。待測(cè)樣品濃度通過(guò)y’＝(mctni/m融合蛋白)*δ*y計(jì)算得到。m表示分子量；δ為熒光融合蛋白和抗體的稀釋比例。

3.2試劑條檢測(cè)速度評(píng)價(jià)

稀釋ctni標(biāo)準(zhǔn)品(芬蘭hytest公司)，用不含有ctni的標(biāo)準(zhǔn)血清(芬蘭hytest公司)，制成0.5ng/l的樣品。取十個(gè)試劑條加入測(cè)試樣品0.5ng/ml后在3分鐘，5分鐘，10分鐘和其他他商業(yè)化試劑條15分鐘后通過(guò)熒光值判定數(shù)值，結(jié)果見表4。

表4試紙條檢測(cè)速度驗(yàn)證

結(jié)果表明在5分鐘時(shí)就可以得到陽(yáng)性數(shù)據(jù)，9分鐘達(dá)到穩(wěn)定，比普通商業(yè)化試劑的15分鐘要節(jié)省40％的時(shí)間。

3.3試劑條檢測(cè)靈敏度

每批的每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試20次記錄其相應(yīng)的熒光信號(hào)值。

取標(biāo)準(zhǔn)ctni樣品(芬蘭hytest公司)試劑0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0ng/ml點(diǎn)樣，然后讀取熒光值，同時(shí)比較普通熒光檢測(cè)試劑條，結(jié)果見圖3，從圖中可以看出融合蛋白熒光曲線高于普通熒光微球，顯示較高的靈敏度。通過(guò)對(duì)極限值判讀，見圖4，可以在0.01ng/ml讀出陽(yáng)性。靈敏度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在0.01ng/ml的ctni即可檢測(cè)到，上述靈敏度對(duì)心衰或心肌梗塞診斷有典型的臨床意義(圖3)。

實(shí)施例4試紙條或試劑盒的使用方法以及臨床評(píng)估

1、用采血管吸取10ul血液，混入90ul磷酸緩沖液后加到試紙條的加樣墊上；

2、將試紙條放入免疫熒光定量分析儀中，8分鐘后讀取數(shù)據(jù)；

3、采用免疫熒光定量分析儀對(duì)光學(xué)信號(hào)進(jìn)行測(cè)量和分析處理，定量得出被測(cè)物質(zhì)的濃度；

4、依據(jù)參考值判定陰陽(yáng)性。

熒光采集方法：用395nm激光通過(guò)光纖在膜表面形成均勻光斑，再成像組件cmos相機(jī)用600nm濾鏡過(guò)濾，每隔20ms采集一次，每次曝光后圖像疊加優(yōu)化。共疊加20次?；蛴霉庾佑?jì)數(shù)器mppc直接讀取數(shù)值。

本發(fā)明的融合熒光蛋白方法檢測(cè)心?；颊哧?yáng)性率與一般熒光微球法檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行比較，結(jié)果見下表5?？梢姡景l(fā)明的融合熒光蛋白方法陽(yáng)性檢出率高于一般熒光微球法檢測(cè)陽(yáng)性率，能夠很好地取代一般熒光微球法檢測(cè)方法以及試劑條。

表5本發(fā)明的融合熒光蛋白方法與熒光微球方法比較

基于上述原理，制備其他疾病標(biāo)志蛋白的熒光蛋白-proteing/proteina融合蛋白試劑條或試劑盒，檢測(cè)結(jié)果如準(zhǔn)確度、靈敏度均優(yōu)于所采用的現(xiàn)有市售酶聯(lián)免疫或熒光檢測(cè)試劑盒，因此，利用本發(fā)明提供的熒光融合蛋白檢測(cè)試劑盒能夠提供更為準(zhǔn)確有效的檢測(cè)相關(guān)信息。

雖然本發(fā)明已作了詳細(xì)描述，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的修改將是顯而易見的。此外，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明記載的各方面、不同具體實(shí)施方式的各部分、和列舉的各種特征可被組合或全部或部分互換。在上述的各個(gè)具體實(shí)施方式中，那些參考另一個(gè)具體實(shí)施方式的實(shí)施方式可適當(dāng)?shù)嘏c其它實(shí)施方式組合，這是將由本領(lǐng)域技術(shù)人員所能理解的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，前面的描述僅是示例的方式，并不旨在限制本發(fā)明。

sequencelisting

<110>程秋萍、王云志

<120>一種精確熒光定量檢測(cè)方法

<130>2017

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