本發(fā)明涉及一種基于疏水離子交換固相萃取的茄科蔬菜中n-亞硝胺的提取及測定方法，屬于化學檢驗技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

煙草植物屬于茄科和煙草屬，煙草中含有煙草特有n-亞硝胺已經(jīng)是不爭的事實。煙草特有n-亞硝胺是胺類化合物在酸性條件下與亞硝化試劑反應(yīng)而生成的，是一類受到廣泛關(guān)注的致癌物質(zhì)，不僅是霍夫曼清單和美國食品藥品監(jiān)督管理局“煙草制品及煙氣中有害及潛在有害物質(zhì)名單”中的重要物質(zhì)，也是國際癌癥研究機構(gòu)“無煙氣煙草制品中28種有害物質(zhì)”名單中的重要成分。已經(jīng)有文獻報道其它茄科植物例如茄子、西紅柿、土豆和辣椒等茄科蔬菜中含有煙堿，然而，這些茄科蔬菜中的煙堿是否會在一定條件下生成煙草特有n-亞硝胺，目前鮮有文獻報道。

申請公開號為cn102012407a的發(fā)明專利公開了一種煙草及煙草制品中煙草特有n-亞硝胺的檢測方法，在該方案中將萃取液流經(jīng)固相萃取小柱，然后采用甲酸水淋洗，最后用氨水/甲醇洗脫，得到待測液。該方案中的固相萃取填料為n-乙烯基吡咯烷酮-苯磺酸共聚物，有機聚合物填料在有機溶劑中會溶脹，會在一定程度上影響填料的富集和凈化效果。另外，該方案中也沒有對影響萃取效果的各種參數(shù)進行優(yōu)化。而且煙草樣品的基質(zhì)與其它茄科植物的基質(zhì)有很大差別，因此該方案中的技術(shù)方案可能不適用于茄子、西紅柿、土豆和辣椒樣品。

因此，開發(fā)一種茄子、西紅柿、土豆和辣椒等茄科蔬菜中n-亞硝胺的提取及測定方法迫在眉睫。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于疏水離子交換固相萃取的茄科蔬菜中n-亞硝胺的提取方法。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種基于疏水離子交換固相萃取的茄科蔬菜中n-亞硝胺的測定方法。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種基于疏水離子交換固相萃取的茄科蔬菜中n-亞硝胺的提取方法，包括以下步驟：

1)將凍干磨成粉的茄科蔬菜加入濃度為5～100mmol/l的乙酸銨溶液進行提取，得粗提取液；

2)將步驟1)所得的粗提取液流過經(jīng)活化處理后的hicaptmcx固相萃取柱，完成上樣；

3)用甲醇水溶液進行淋洗；

4)用丙酮、丙酮氨水混合液、丙酮甲酸混合液中的任意一種進行洗脫，即得n-亞硝胺的提取液；所述丙酮氨水混合液中丙酮、氨水的體積比為97～99:3～1；丙酮甲酸混合液中丙酮、甲酸的體積比為97～99:3～1；所述氨水的質(zhì)量分數(shù)為35％。

上述茄科蔬菜包括茄子、西紅柿、土豆、辣椒。

上述茄科蔬菜中n-亞硝胺包括nnn、nnk、nat和nab。

上述步驟1)中提取操作為：將凍干磨成粉的茄科蔬菜加入濃度為5～100mmol/l的乙酸銨溶液中，進行超聲處理，然后分離不溶物，得粗提取液。

上述每1g凍干研磨成粉的茄科蔬菜所用乙酸銨溶液的用量為10～100ml。

上述超聲處理，超聲功率280～700w，頻率20～40khz，時間≥10min。超聲時間優(yōu)選為10～60min。超聲時間進一步優(yōu)選為30min。

上述分離不溶物采用過濾或離心的方式。

上述過濾采用水相濾膜。

上述水相濾膜的孔徑為0.20～0.50μm。優(yōu)選為0.22μm或0.45μm。

上述水相濾膜為聚醚砜膜。

上述離心，是將超聲處理后的混合液靜置，然后進行離心，最后取上層清液。

上述靜置時間為3～10min。優(yōu)選為5min。

上述離心轉(zhuǎn)速5000～10000rpm，時間為3～10min。離心時間優(yōu)選為5min。

上述步驟2)中hicaptmcx固相萃取柱為疏水/離子交換混合保留機理固相萃取柱。上述hicaptmcx固相萃取柱購自于維泰克科技(武漢)有限公司。

上述步驟2)中hicaptmcx固相萃取柱具有疏水和強離子交換作用。

上述步驟2)中所用hicaptmcx固相萃取柱中的填料的用量為：每將6ml粗提取液完成上樣時，相應(yīng)使用50～1000mg的hicaptmcx固相萃取柱中的填料。優(yōu)選地，6ml粗提取液對應(yīng)使用500mghicaptmcx固相萃取柱中的填料。

上述粗提取液在上樣前調(diào)ph值至3.0～11。優(yōu)選為調(diào)ph值至4～6。

上述調(diào)節(jié)ph值的調(diào)節(jié)劑為乙酸或氨水。當選用乙酸調(diào)節(jié)ph時，優(yōu)選質(zhì)量分數(shù)為10％的乙酸溶液。

上述活化處理操作為：依次用丙酮、甲醇水溶液、水流經(jīng)hicaptmcx固相萃取柱。

上述活化為依次用丙酮、甲醇體積分數(shù)為5％的甲醇水溶液、水流經(jīng)hicaptmcx固相萃取柱。所述丙酮、甲醇水溶液、水的體積比為1:2:2。

上述步驟3)中甲醇水溶液中甲醇的體積分數(shù)為5～20％。步驟3)中甲醇水溶液的用量選擇時，每將6ml粗提取液上樣，淋洗時甲醇水溶液的用量為≥0.5ml。優(yōu)選為1ml。

上述步驟3)中淋洗后在真空泵的負壓作用下抽干淋洗液。

上述步驟4)丙酮氨水混合液中丙酮與氨水的體積比優(yōu)選為99:1。

上述步驟4)丙酮甲酸混合液中丙酮與甲酸的體積比優(yōu)選為99:1。

步驟4)中洗脫，洗脫液的用量為：每將6ml粗提取液上樣，淋洗，干燥后使用的洗脫液體積≥0.5ml。優(yōu)選為1～2ml。進一步優(yōu)選為1ml。

一種基于疏水離子交換固相萃取的茄科蔬菜中n-亞硝胺的測定方法，包括以下步驟：

1.n-亞硝胺提取液的制備

1.1在凍干磨成粉的茄科蔬菜中依次加入內(nèi)標和濃度為5～100mmol/l的乙酸銨溶液進行提取，得粗提取液；

1.2將步驟1.1所得的混合液流過經(jīng)活化處理后的hicaptmcx固相萃取柱，完成上樣；

1.3用甲醇水溶液進行淋洗；

1.4用丙酮、丙酮氨水混合液、丙酮甲酸混合液中的任意一種進行洗脫，即得n-亞硝胺的提取液；所述丙酮氨水混合液中丙酮、氨水的體積比為97～99:3～1；丙酮甲酸混合液中丙酮、甲酸的體積比為97～99:3～1；

2.n-亞硝胺的測定

將步驟1.4中所得的提取液吹干，再用復溶溶液進行復溶得待測液，然后對待測液進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定；所述復溶溶液由甲酸銨溶液和甲酸乙腈溶液配制而成。

上述同位素內(nèi)標包括nnn-d4、nnk-d4、nat-d4、nab-d4。

上述同位素內(nèi)標的加入量為：每加入1ml乙酸銨溶液對應(yīng)加入每種同位素內(nèi)標的質(zhì)量均為10ng。

上述步驟1.1中所得粗提取液在上樣前調(diào)ph至3.0～11.0。

上述步驟1.4中丙酮與氨水體積比優(yōu)選為99:1。丙酮與甲酸的體積比優(yōu)選為99:1。

上述洗脫，洗脫液的用量為：每將6ml混合液上樣，淋洗，干燥后使用的洗脫液體積≥0.5ml。優(yōu)選為1～2ml。進一步優(yōu)選為1ml。

上述復溶溶液由0.01mol/l的甲酸銨溶液與甲酸體積分數(shù)為0.1％的甲酸乙腈溶液按照1～2:1～2的體積比配制而成。

上述復溶溶液的用量為：每將6ml粗提取液上樣，最終測定前需使用復溶溶液體積≥0.1ml。優(yōu)選為0.1～1ml。進一步優(yōu)選為0.2ml。

上述步驟2中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定包括系列濃度的混合標準溶液的配制，配制步驟為：

以四種n-亞硝胺的同位素內(nèi)標(nnn-d4、nnk-d4、nat-d4和nab-d4)為溶質(zhì)，甲醇為溶劑，配制內(nèi)標溶液；以四種煙草特有n-亞硝胺(nnn、nnk、nat和nab)為溶質(zhì)，甲醇為溶劑，配制系列濃度的混合標準溶液。

本發(fā)明基于疏水離子交換固相萃取的茄科蔬菜中n-亞硝胺的測定方法中標準曲線的制作步驟為：

以四種n-亞硝胺的同位素內(nèi)標(nnn-d4、nnk-d4、nat-d4和nab-d4)為溶質(zhì)，甲醇為溶劑，配制內(nèi)標溶液；以四種煙草特有n-亞硝胺(nnn、nnk、nat和nab)為溶質(zhì)，甲醇為溶劑，配制系列濃度的混合標準溶液，將系列濃度的混合標準溶液進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，以目標分析物峰面積和相應(yīng)同位素峰面積之比對目標分析濃度做回歸分析，即得各目標分析物的標準曲線。

上述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析的條件為：色譜柱：poroshell120ec-c18；柱溫：40℃；進樣量：5μl；流動相a：0.01mol/l甲酸銨溶液，流動相b：0.1％甲酸乙腈溶液；流速：0.4ml/min；流動相梯度程序：t＝0min，10％b，t＝2.0min，40％b，t＝4.0min，60％b，t＝6.0min，90％b，t＝9.0min，90％b，t＝9.5min，10％b，t＝15.0min，10％b；質(zhì)譜條件：電噴霧電壓5000v；霧化氣壓力50psi；輔助霧化氣壓力50psi；氣簾氣壓力35psi；離子源溫度450℃；進口電壓8v；出口電壓10v；去簇電壓40v；駐留時間40ms；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測。

上述多反應(yīng)監(jiān)測中nnn、nnk、nat和nab的定量離子對依次為178.1>148.2、208.1>122.1、190.1>160.1和192.1>162.2，相應(yīng)的碰撞電壓依次為15、16、15和17ev；nnn、nnk、nat和nab的定性離子對依次為178.1>120.1、208.1>106.1、190.1>106.1和192.1>133.1，相應(yīng)的碰撞電壓依次為15、16、15和17ev；nnn-d4、nnk-d4、nat-d4和nab-d4的定量離子對依次為182.1>152.2、212.1>126.1、194.1>164.1和196.1>166.2，相應(yīng)的碰撞電壓依次為15、16、15和17ev。

上述色譜柱：poroshell120ec-c183.0mm×100mm，2.7μm。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明基于疏水離子交換固相萃取的茄科蔬菜中n-亞硝胺的提取方法中采用了hicaptmcx固相萃取柱，hicaptmcx固相萃取填料對樣品提取液具有良好的凈化效果，能有效去除雜質(zhì)及干擾物，提高測定方法的準確度和精密度。

本發(fā)明基于疏水離子交換固相萃取的茄科蔬菜中n-亞硝胺的測定方法，通過采用hicaptmcx固相萃取柱對目標分析物進行提取，對目標分析物進行疏水和陽離子交換，達到對目標分析物的純化作用，然后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性、定量分析茄科蔬菜中n-亞硝胺，本發(fā)明的測定方法具有樣品前處理操作簡單、快捷，雜質(zhì)及干擾物的去除效率高，處理時間短的優(yōu)點。

附圖說明

圖1為混合標準溶液3的色譜圖；

圖2為粗提取液ph值的優(yōu)化結(jié)果圖；

圖3為洗脫液種類的優(yōu)化結(jié)果圖；

圖4為洗脫液體積的優(yōu)化結(jié)果圖；

圖5為淋洗液中甲醇含量的優(yōu)化結(jié)果圖；

圖6為hicaptmcx固相萃取柱中填料質(zhì)量的優(yōu)化結(jié)果圖。

具體實施方式

下述實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

實施例1

本實施例基于疏水離子交換固相萃取的茄科蔬菜中n-亞硝胺的提取方法，包括以下步驟：

1)稱取1.0g凍干研磨成粉的茄子(精確至0.1mg)，置入30ml具塞離心管中，準確加入30ml濃度10mmol/l的乙酸銨水溶液，置于超聲波發(fā)生器(購自昆山市超聲儀器有限公司，型號：kq-700db)上進行超聲處理，超聲提取30min，超聲功率700w，頻率40khz，靜置5min后，置于離心機上離心5min，離心轉(zhuǎn)速10000rpm，取上層清液，即得粗提取液；粗提取液在上樣前的ph值調(diào)至4，作為上樣溶液；

2)準確稱取500mghicaptmcx固相萃取填料于帶有篩板的固相萃取空柱管中，不斷敲打使填料填充均勻，上端蓋上篩板壓緊，待用；上樣前，依次用1.0ml丙酮、2.0ml甲醇體積分數(shù)為5％的甲醇水溶液、2ml水清洗活化固相萃取小柱；之后在重力作用下將6ml步驟1)中所得的上樣溶液自然流過固相萃取小柱以完成上樣過程；

3)上樣結(jié)束后用1ml甲醇體積分數(shù)為10％的甲醇水溶液進行淋洗，待淋洗液完全流過萃取柱后，在真空泵的負壓作用下抽干淋洗液；

4)最后用2ml丙酮(含1％體積分數(shù)的濃氨水)洗脫目標分析物，收集，即得。

本實施例基于疏水離子交換固相萃取的茄科蔬菜中n-亞硝胺的測定方法，包括以下步驟：

1.n-亞硝胺提取液的制備

1.1分別稱取1.0g凍干研磨成粉的茄子(精確至0.1mg)，置入30ml具塞離心管中，加入同位素內(nèi)標后，準確加入30ml濃度10mmol/l的乙酸銨水溶液，置于超聲波發(fā)生器(購自昆山市超聲儀器有限公司，型號：kq-700db)上進行超聲處理，超聲提取30min，超聲功率700w，頻率40khz，靜置5min后，置于離心機上離心5min，離心轉(zhuǎn)速10000rpm，取上層清液，即得粗提取液；粗提取液在上樣前的ph值調(diào)至4，作為上樣溶液；

1.2準確稱取500mghicaptmcx固相萃取填料于帶有篩板的固相萃取空柱管中，不斷敲打使填料填充均勻，上端蓋上篩板壓緊，待用。上樣前，依次用1.0ml丙酮、2.0ml甲醇體積分數(shù)為5％的甲醇水溶液、2ml水清洗活化固相萃取小柱。之后在重力作用下將步驟1.1中所得的6ml上樣溶液自然流過固相萃取小柱以完成上樣過程；

1.3上樣結(jié)束后用1ml甲醇體積分數(shù)為10％的甲醇水溶液進行淋洗，待淋洗液完全流過萃取柱后，在真空泵的負壓作用下抽干淋洗液；

1.4用2ml丙酮(含1％體積分數(shù)氨水)洗脫目標分析物，收集，即得。

2.n-亞硝胺的測定

將步驟1.4中所得提取液在35℃下氮氣吹干，再用0.2ml復溶溶液進行復溶。復溶溶液由0.01mol/l的甲酸銨溶液和甲酸體積分數(shù)為0.1％的甲酸乙腈混合溶液按照1:1的體積比配制而成。

混合標準溶液的配制：以四種n-亞硝胺的同位素內(nèi)標(nnn-d4、nnk-d4、nat-d4和nab-d4)為溶質(zhì)，甲醇為溶劑，配制內(nèi)標溶液；以四種煙草特有n-亞硝胺(nnn、nnk、nat和nab)為溶質(zhì)，甲醇為溶劑，配制系列濃度的混合標準溶液，具體見下表1。其中內(nèi)標的濃度均為10ng/ml。將混合標準溶液進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

表1混合標準溶液的濃度表

標準曲線的制作：取混合標準溶液進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，分析條件為：色譜柱：poroshell120ec-c18(3.0mm×100mm，2.7μm)；柱溫：40℃；進樣量：5μl；流動相為0.01mol/l甲酸銨(a)-0.1％甲酸乙腈(b)；流速：0.4ml/min；流動相梯度程序：t＝0min,10％b，t＝2.0min,40％b，t＝4.0min,60％b，t＝6.0min,90％b，t＝9.0min,90％b，t＝9.5min,10％b，t＝15.0min,10％b；質(zhì)譜條件：電噴霧電壓5000v；霧化氣(gas1)壓力50psi；輔助霧化氣(gas2)壓力50psi；氣簾氣(gas1)壓力35psi；離子源溫度450℃；進口電壓8v；出口電壓10v；去簇電壓40v；駐留時間40ms；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測。

所述多反應(yīng)監(jiān)測中nnn、nnk、nat和nab的定量離子對依次為178.1>148.2、208.1>122.1、190.1>160.1和192.1>162.2，相應(yīng)的碰撞電壓依次為15、16、15和17ev；nnn、nnk、nat和nab的定性離子對依次為178.1>120.1、208.1>106.1、190.1>106.1和192.1>133.1，相應(yīng)的碰撞電壓依次為15、16、15和17ev；nnn-d4、nnk-d4、nat-d4和nab-d4的定量離子對依次為182.1>152.2、212.1>126.1、194.1>164.1和196.1>166.2，相應(yīng)的碰撞電壓依次為15、16、15和17ev。程序運行結(jié)束，以目標分析物峰面積和相應(yīng)同位素峰面積之比對目標分析物濃度作回歸分析，即得各目標分析物的標準曲線，參數(shù)見下表2，混合標準溶液3的色譜圖見圖1。

表2各目標分析物對應(yīng)的標準曲線、定量限和檢測限

注：檢測限和定量限是信噪比(s/n)3和10時對應(yīng)的濃度

樣品中煙草特有n-亞硝胺的測定：取上述待測溶液進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，分析條件同上，將測得的各物質(zhì)峰面積代入下式1中，經(jīng)計算得到樣品中目標分析物的含量。

式1：

式中，m為樣品中目標分析物的含量，ng/g；x為目標分析物與同位素內(nèi)標的峰面積之比；a為標準曲線的斜率，b為標準曲線的截距；v為樣品提取液的體積，ml；n為樣品質(zhì)量，g。

實施例2

將實施例1中的茄子替換為西紅柿，其它同實施例1。

實施例3

將實施例1中的茄子替換為土豆，其它同實施例1。

實施例4

將實施例1中的茄子替換為辣椒，其它同實施例1。

實施例5

按實施例1-4所述的測定方法，選取另外幾種茄子、西紅柿、土豆和辣椒，測定其中n-亞硝胺的含量，均沒有測到相應(yīng)的n-亞硝胺。

本發(fā)明中的其他實施例中，粗提取液的ph可以調(diào)至3.4-11.0，進一步的本發(fā)明中的其他實施例中粗提取液的ph可以選擇為3.4、6、10.5或11，其它同實施例1。由于固相萃取填料對目標分析物的萃取主要是靠疏水和陽離子交換作用，ph在4.0-6.0時大部分目標分析物分子以質(zhì)子化形式存在，而填料中的陽離子基團以負離子形式存在，此時填料和目標分析物之間的疏水作用和陽離子交換作用力較強，因此具有最佳的萃取效果。如圖2所示，在所考察的ph值范圍(3.4-11.0)內(nèi)，在ph為4.0時，所有被分析物具有較好的萃取效果。

本發(fā)明中的其他實施例中，步驟4)及1.4中洗脫液可選用丙酮、丙酮氨水混合液、丙酮甲酸混合液中的任意一種。進一步的，還可以為含3％體積分數(shù)氨水的丙酮混合液、含1％或3％體積分數(shù)甲酸的丙酮混合液或丙酮，其它同實施例1。如圖3洗脫液種類、圖4洗脫液體積優(yōu)化結(jié)果圖所示，在丙酮中添加一定比例的氨水，能夠提高目標分析物的解吸效率，這是因為堿性條件下能夠破壞填料和目標分析物之間的陽離子交換作用。

本發(fā)明中的其他實施例中，步驟3)及1.3中淋洗液的甲醇含量可以為5～20％。進一步地，甲醇水溶液中甲醇的體積分數(shù)還可以為5％、8％、10％、12％、15％或20％，其它同實施例1。如圖5淋洗液中甲醇含量的優(yōu)化結(jié)果圖所示，當甲醇含量為10％時，目標分析物具有較好的萃取效率。

本發(fā)明中的其他實施例中，hicaptmcx固相萃取填料的質(zhì)量可以在50-1000mg范圍內(nèi)。進一步地，hicaptmcx固相萃取填料的用量還可以為50mg、100mg、200mg、300mg或1000mg，其它同實施例1。如圖6所示，填料的質(zhì)量在50-1000mg范圍內(nèi)，隨著填料質(zhì)量不斷提高，目標分析物的峰面積均顯著提高，當填料的質(zhì)量達到500mg時，繼續(xù)增加填料質(zhì)量，目標分析物的峰面積提高不明顯，綜合考慮所有目標分析物的萃取效果，優(yōu)選填料的質(zhì)量為500mg。

在本發(fā)明其它的實施例中，超聲提取、漩渦振蕩的條件均可適當調(diào)整。

試驗例

精密度及加標回收測試

為考察上述測定方法的抗干擾性，在實施例1的加入乙酸銨溶液前的樣品中加入一定量的混合標準溶液，配制成低、中、高三種濃度的樣品(低、中、高濃度對應(yīng)的值分別為各目標分析物線性范圍最低值的2、10和40倍)。在優(yōu)化的分析條件下，目標分析物與干擾物分離良好，干擾物不影響目標分析物的定量。

以一天內(nèi)配制的5個樣品進行測定，計算不同濃度下的日內(nèi)相對標準偏差；以連續(xù)3天配制的樣品進行測定，計算不同濃度下的日間相對標準偏差；將分析所得的峰面積之比代入標準曲線中，計算得到待測溶液中目標分析物的含量，并與實際添加量相比得到相對回收率，結(jié)果見下表3。從表3可以看出，目標分析物在不同濃度下的日內(nèi)及日間精密度分別小于4.6％和4.2％，說明該方法具有較好的重現(xiàn)性。同時，不同濃度下目標分析物的相對回收率介于92.2％～108.9％之間。

表3精密度及加標回收測試結(jié)果