本發(fā)明屬于免疫分析領(lǐng)域，特別是涉及一種高靈敏板式化學發(fā)光法定量檢測血清的乙型肝炎病毒前s1抗原試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(hbv)外膜蛋白包括s、前s2和前s1三種成分。前s1蛋白在病毒侵入肝細胞過程中起重要作用。病毒附著于肝細胞上，最重要的介導部位是前s1蛋白的氨基酸(aa)21-47片段，變異的病毒只要這一區(qū)段完好就有傳染性。含有前s1的蛋白主要存在于dane顆粒和管型顆料上。前s1蛋白在病毒感染、裝配、復制和刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)等方面起有十分重要作用。乙肝病毒前s1抗原酶免測定試劑盒的正式推向臨床以及近兩年在北京、四川、浙江、河南、深圳、海南等近百家醫(yī)院與乙肝"兩對半"檢測的聯(lián)合應(yīng)用，充分顯示了該試劑在病毒性乙型肝炎的臨床診斷，指導治療等方面的重要價值。前s1抗原(pre-s1ag)檢測是對乙肝"兩對半"尤其是e抗原和hbv-dna測定的重要補充和加強。前s1抗原與hbv-dna檢出率兩者符合，前s1抗原僅在hbv-dna陽性血清中檢出。前s1蛋白隨hbeag消失而消失，且與陰轉(zhuǎn)時間呈正相關(guān)，這樣，前s1抗原可作為病毒清除與病毒轉(zhuǎn)陰的指標。前s1抗原陽性的乙型肝炎患者傳播乙型肝炎病毒比前s1抗原陰性和無癥狀hbsag攜帶者的危險性更大，因而說明前s1抗原可反映乙型肝炎病毒復制和傳染性的指標。如果前s1抗原持續(xù)陽性，指示ahb向慢性轉(zhuǎn)變。比較急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、和hbsag陽性的患者血清中前s1蛋白，前s1抗原陰轉(zhuǎn)愈早，ahb患者的療程愈短，預(yù)后也愈好。說明前s1抗原及其抗體的檢測是急性乙型肝炎的臨床診斷，療效觀察和判數(shù)據(jù)預(yù)后的良好指標。前s1抗原主要存在于血清中hbv表面。提示機體內(nèi)含有hbv就有前s1抗原。前s1抗原與hbv-dna，hbeag檢測率高度符合是一項十分重要的病毒復制指標。提示前s1抗原可作為hbeag和hbv-dna檢測的補充和對照?？筯beab(+)慢性乙型肝炎(約占患者的30%左右)和hbv慢性無癥狀攜帶者中，前s1抗原(+)可表示病毒的復制，提示臨床上只檢測"乙肝五項"是不夠的，補充前s1抗原的測定是十分重要的，可彌補因病毒變異和其它原因造成的hbeag(-)的"誤尋"。病毒附著于肝細胞上，最重要的介導部位是前s1蛋白的氨基酸(aa)21-47片段，變異的病毒只要這一區(qū)段完好就有傳染性。為了提高乙肝病毒前s1抗原診斷水平和改善治療效果，從檢測角度上來說，目前臨床上用于測定前s1抗原的方法主要有放射性免疫技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、時間分辨熒光免疫分析方法和化學發(fā)光技術(shù)等。過去以放射性免疫技術(shù)為代表的人乙肝病毒前s1抗原測定試劑盒由于方法學的限制，其靈敏度和抗干擾能力嚴重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場；目前應(yīng)用較多的為酶聯(lián)免疫技術(shù)、時間分辨熒光免疫分析和化學發(fā)光技術(shù)，其中化學發(fā)光技術(shù)興起于上個世紀80年代，是繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放射性免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的新興技術(shù)，由于其高靈敏度、高特異性，同時方法簡便、快速，標記結(jié)合物穩(wěn)定，相對時間分辨熒光免疫分析成本低廉、操作簡便，相對放射性免疫分析技術(shù)無放射性同位素損傷和污染等特點，在近些年得到了飛速發(fā)展。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種板式化學發(fā)光法檢測血清乙肝病毒前s1抗原的試劑盒及其制備方法，研發(fā)和優(yōu)化了與血清學免疫反應(yīng)原理相關(guān)的各種關(guān)鍵技術(shù)，從而提高了針對臨床患者體內(nèi)的乙肝病毒前s1抗原檢測靈敏度和準確性，開發(fā)出靈敏度高、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)便捷、操作方便的板式化學發(fā)光診斷試劑盒。本發(fā)明的主要設(shè)計思路是在化學發(fā)光免疫分析基礎(chǔ)上，通過引入具有抗生物素抗體-生物素體系，穩(wěn)定試劑盒檢測特異性的同時，大幅增加了檢測靈敏度。本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案為：一種乙型肝炎病毒前s1抗原的板式化學發(fā)光法檢測試劑盒，包括的試劑：生物素標記的乙肝病毒前s1抗體溶液、抗生物素抗體包被的酶標板、辣根過氧化物酶標記的乙肝病毒前s1抗體溶液、乙肝病毒前s1陰性對照、乙肝病毒前s1陽性對照、濃縮洗液、底物液a、底物液b。上述生物素標記的乙肝病毒前s1抗體溶液的濃度為0.01～5.0μg/ml，所述抗生物素抗體包被的酶標板的抗生物素抗體的包被濃度為0.1～5.0μg/ml，所述辣根過氧化物酶標記的乙肝病毒前s1抗體溶液的濃度為0.03～5.0μg/ml。上述乙肝病毒前s1陰性對照的未包含乙肝病毒前s1，所述乙肝病毒前s1陽性對照是乙肝病毒前s1陽性血清以ph值為7.4的tris-hcl緩沖液配制得到的，稀釋體積比為1：5000。上述生物素標記的乙肝病毒前s1抗體溶液的制備過程為：生物素標記的乙肝病毒前s1抗體加入到ph值為7.4的緩沖液中，調(diào)節(jié)到適宜倍數(shù)，混勻得到。上述抗生物素抗體包被的酶標板的制備過程為：所述抗生物素抗體包被板采用高溫振蕩式包被，包被溫度為39±1℃，包被時間為1～3小時，采用低速振蕩包被形式，選用的振蕩儀為艾本森科學儀器有限公司微孔板振蕩器，振蕩幅度與方式：3mm，采用水平回轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為200~500rpm，封閉和干燥溫度為37±1℃，封閉時間為1.5～3小時，干燥時間為2～4小時；采用高溫振蕩式包被工藝，包被板制備時間可控制在5～7小時。跟室溫包被普遍的3～4天制備時間相比，具備明顯的效率優(yōu)勢，同時提高了反應(yīng)的靈敏度，降低抗體/抗原使用量的同時，簡化了試劑生產(chǎn)流程，縮短了生產(chǎn)時間。國內(nèi)包被板技術(shù)采用鏈霉親和素包被較多，采用抗生物素抗體尚未見專利文獻報告。另外，低速振蕩包被法相比常規(guī)的室溫包被法明顯縮短了包被板的生產(chǎn)時間，提高了試劑生產(chǎn)效率。上述辣根過氧化物酶標記的乙肝病毒前s1抗體溶液的制備過程為：辣根過氧化物酶標記的乙肝病毒前s1抗體溶液加入到ph值為7.4的緩沖液中，調(diào)節(jié)到適宜倍數(shù)，混勻得到。上述抗生物素抗體包被的酶標板所用包被液為0.01m的碳酸緩沖液，ph9.6±0.1，所用封閉液的含0.3wt%bsa、0.1%proclin300(v/v)、1wt%羊血清、1wt%魚皮明膠、2wt%海藻糖和10wt%蔗糖的0.1mph7.4tbs緩沖液。針對本發(fā)明的抗生物素抗體包被體系，采用0.01m的碳酸緩沖液，并在封閉液中以少量bsa屏蔽了酶標板大部分未結(jié)合位點，在緩沖體系的協(xié)同作用下，以動物血清消除非特異性結(jié)合位點，保證了包被板的精密度和低本底，以蔗糖、海藻糖和魚皮明膠作為穩(wěn)定體系，強化了包被板對高溫、干燥的抗性，保證了抗生物素抗體包被板的性能。本發(fā)明試劑盒的檢測方法是，將樣品和生物素標記的乙型肝炎病毒前s1抗體加入到抗生物素抗體包被的酶標板中，樣品中的pres1ag和該抗體結(jié)合形成免疫復合物，同時，該免疫復合物通過抗生物素抗體和生物素之間的結(jié)合作用被固定到酶標板上。使用洗液清洗酶標板，去除未結(jié)合的游離成分。加入辣根過氧化物酶標記的乙型肝炎病毒表面抗體（anti-hbs），該酶標抗體通過免疫反應(yīng)與被固定的免疫復合物結(jié)合。再次清洗微孔板后，加入底物液激發(fā)化學發(fā)光，測定相對光強度rlu。在一定濃度范圍內(nèi)，rlu值隨樣品中pres1ag含量的升高而線性升高。與陰性對照比較，即可檢測人血清樣品中是否存在pres1ag，與陽性對照比較可預(yù)測pres1ag含量。本發(fā)明的乙型肝炎病毒前s1抗原的板式化學發(fā)光法檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟一、濃縮洗液的配制，步驟如下：1、稱取kcl60g、nacl300g于1l容器中；2、稱取20.0gtween-20于100ml容器中加50ml水使其完全溶解后，倒入上述1l容器中；3、用移液器將proclin-300量取2ml，倒入上述1l容器中；4、用量筒量取適量純化水于上述1l容器中，充分攪拌直至完全溶解；5、調(diào)ph，控制其范圍在7.35～7.45之間；6、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.2μm濾器過濾即得；二、底物液的配制（一）底物液a的配制步驟1、稱取硼砂11.44g、硼酸4.948g、魯米諾2.0g和對碘苯酚0.2mg于1l燒杯中；2、用量筒量取純化水于1l燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調(diào)ph，控制其范圍在7.95-8.05之間；3、用0.2μm濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得；（二）底物溶液b的配制1、稱取硼砂11.44g、硼酸4.948g、過氧化脲0.2g和pc300500μl于1l燒杯中；2、用量筒量取純化水于1l燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調(diào)ph控制其范圍在7.95-8.05之間；3、用0.2μm濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得；三、對照品稀釋液的配制，步驟如下：1、稱取tris12.11g和hcl7ml于1l的容器中，調(diào)節(jié)溶液ph,控制其范圍在7.35-7.45之間,定容至1000ml；2、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，作為校準品稀釋液備用；四、陰性對照、陽性對照的配制陰性對照的配制：取對照稀釋液，分裝到適宜規(guī)格。陽性對照的配制：按1：5000（1:500～1:10000）在對照稀釋液中加入商品化的pre-s1（北京新銳銀通）；五、抗生物素抗體包被的酶標板1配制0.01m的碳酸緩沖液，調(diào)節(jié)ph至ph9.6±0.1，備用；2在上述0.01m的碳酸緩沖液中加入抗生物素抗體溶液至終濃度為0.1～5μg/ml攪拌30分鐘至混合均勻；3將上述混勻后的溶液按包被量為100μl每孔加入酶標板中，采用高溫振蕩式包被，包被溫度為39±1℃，包被時間為1～3小時，采用低速振蕩包被形式；4配制0.1m，ph7.4tbs緩沖液，含0.3wt%bsa，1wt%羊血清，0.1%proclin300(v/v)，1wt%魚皮明膠，2wt%海藻糖和10wt%蔗糖，作為封閉液加入到清洗后的包被板中，封閉量為150μl每孔，封閉溫度為37±1℃，封閉時間為2～5小時；5吸掉封閉液，放置在干燥箱中，干燥溫度控制在37±1℃，干燥時間為2～4小時，再以鋁箔袋真空包裝，貼簽備用；六、辣根過氧化物酶標記的乙肝病毒前s1抗體溶液的制備（一）酶反應(yīng)物稀釋液的配制1、取tris4.846g、hcl2900μl于燒杯中，然后在燒瓶中加入純化水，充分攪拌使試劑完全溶解；2、調(diào)ph，控制ph在7.35-7.45；3、稱取bsa4g倒入上述燒杯中；4、最后燒杯定容至400ml，用0.2um濾器過濾即得；（二）辣根過氧化物酶（hrp）與抗pre-s1抗體的偶聯(lián)1、取乙肝病毒前s1抗體1mg放置于1ml玻璃管中；2、取200μldmso溶解抗體使抗體的終濃度到達5mg/ml，然后充分混勻；3、按照1mol抗體加入10mol的辛二酸二琥珀酰亞胺酯的摩爾比例加辛二酸二琥珀酰亞胺酯到上述2溶液中，37℃恒溫箱中反應(yīng)1.5小時；4、按照3mol抗體加入1molhrp的摩爾比往上述3的溶液中添加hrp，然后加入1ml的ph為7.4濃度為0.1m的pb緩沖液，置于37℃恒溫箱中反應(yīng)3小時；5、將上述4配制的溶液用pd-10柱純化，收集純化液，按照1:3000的體積添加自制的酶反應(yīng)物稀釋液，控制最終使用濃度在0.03-5.0μg/ml，混合均勻即得酶反應(yīng)物；七：生物素標記的乙肝病毒前s1抗體溶液的制備（一）生物素反應(yīng)物稀釋液的配制1、取tris4.846g、hcl2847μl于燒瓶中，然后在燒瓶中加入純化水，充分攪拌使試劑完全溶解；2、調(diào)ph，控制ph在7.35-7.45；3、稱取bsa4g倒入上述燒杯中；4、最后燒杯定容至400ml，用0.2μm濾器過濾即得；（二）取生物素化抗體，以生物素反應(yīng)物稀釋液稀釋，控制最終使用濃度在0.01～5.0μg/ml，混勻，即可得到生物素結(jié)合物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的板式化學發(fā)光法檢測血清ca242抗原的試劑盒及其制備方法，在化學發(fā)光免疫分析基礎(chǔ)上，通過引入具有抗生物素抗體包被的酶標板，并改進了高溫振蕩式抗生物素抗體包被工藝，通過抗生物素抗體-生物素方法體系，提高反應(yīng)的靈敏度，節(jié)省生產(chǎn)成本，在降低抗體/抗原使用量的同時，也簡化了試劑生產(chǎn)流程，縮短了生產(chǎn)時間，簡化了檢測步驟，可為市場提供質(zhì)優(yōu)價廉、穩(wěn)定可靠、重復性好、批間差小、準確度高新一代檢測試。具體實施方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行說明，所舉的實施例僅是對本發(fā)明產(chǎn)品或方法作概括性例示，有助于更好地理解本發(fā)明，但并不會限制本發(fā)明范圍。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。本實施例的糖類抗原242的板式化學發(fā)光法檢測試劑盒主要試劑包括：生物素標記的乙肝病毒前s1抗體溶液、抗生物素抗體包被的酶標板、辣根過氧化物酶標記的乙肝病毒前s1抗體溶液、乙肝病毒前s1陰性對照、乙肝病毒前s1陽性對照、濃縮洗液、底物液a、底物液b。。試劑盒的制備方法一、濃縮洗液的配制，步驟如下：1、稱取kcl60g、nacl300g于1l容器中；2、稱取20.0gtween-20于100ml容器中加50ml水使其完全溶解后，倒入上述1l容器中；3、用移液器將proclin-300量取2ml，倒入上述1l容器中；4、用量筒量取適量純化水于上述1l容器中，充分攪拌直至完全溶解；5、調(diào)ph，控制其范圍在7.35～7.45之間；6、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.2μm濾器過濾即得；二、底物液的配制（一）底物液a的配制步驟1、稱取硼砂11.44g、硼酸4.948g、魯米諾2.0g和對碘苯酚0.2mg于1l燒杯中；2、用量筒量取純化水于1l燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調(diào)ph，控制其范圍在7.95-8.05之間；3、用0.2μm濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得；（二）底物溶液b的配制1、稱取硼砂11.44g、硼酸4.948g、過氧化脲0.2g和pc300500μl于1l燒杯中；2、用量筒量取純化水于1l燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調(diào)ph控制其范圍在7.95-8.05之間；3、用0.2μm濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得；三、對照品稀釋液的配制，步驟如下：1、稱取tris12.11g和hcl7ml于1l的容器中，調(diào)節(jié)溶液ph,控制其范圍在7.35-7.45之間,定容至1000ml；2、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，作為校準品稀釋液備用；四、陰性對照、陽性對照的配制陰性對照的配制：取對照稀釋液，分裝到適宜規(guī)格。陽性對照的配制：按1：5000（1:500～1:10000）在對照稀釋液中加入商品化的pre-s1（北京新銳銀通）；五、抗生物素抗體包被的酶標板1配制0.01m的碳酸緩沖液，調(diào)節(jié)ph至ph9.6±0.1，備用；2在上述0.01m的碳酸緩沖液中加入抗生物素抗體溶液至終濃度為0.3μg/ml攪拌30分鐘至混合均勻；3將上述混勻后的溶液按包被量為100μl每孔加入酶標板中，采用高溫振蕩式包被，包被溫度為39±1℃，包被時間為1～3小時，采用低速振蕩包被形式；4配制0.1m，ph7.4tbs緩沖液，含0.3wt%bsa，1wt%羊血清，0.1%proclin300(v/v)，1wt%魚皮明膠，2wt%海藻糖和10wt%蔗糖，作為封閉液加入到清洗后的包被板中，封閉量為150μl每孔，封閉溫度為37±1℃，封閉時間為2～5小時；5吸掉封閉液，放置在干燥箱中，干燥溫度控制在37±1℃，干燥時間為2～4小時，再以鋁箔袋真空包裝，貼簽備用；六、辣根過氧化物酶標記的乙肝病毒前s1抗體溶液的制備（一）酶反應(yīng)物稀釋液的配制1、取tris4.846g、hcl2900μl于燒杯中，然后在燒瓶中加入純化水，充分攪拌使試劑完全溶解；2、調(diào)ph，控制ph在7.35-7.45；3、稱取bsa4g倒入上述燒杯中；4、最后燒杯定容至400ml，用0.2um濾器過濾即得；（二）辣根過氧化物酶（hrp）與抗pre-s1抗體的偶聯(lián)1、取乙肝病毒前s1抗體1mg放置于1ml玻璃管中；2、取200μldmso溶解抗體使抗體的終濃度到達5mg/ml，然后充分混勻；3、按照1mol抗體加入10mol的辛二酸二琥珀酰亞胺酯的摩爾比例加辛二酸二琥珀酰亞胺酯到上述2溶液中，37℃恒溫箱中反應(yīng)1.5小時；4、按照3mol抗體加入1molhrp的摩爾比往上述3的溶液中添加hrp，然后加入1ml的ph為7.4濃度為0.1m的pb緩沖液，置于37℃恒溫箱中反應(yīng)3小時；5、將上述4配制的溶液用pd-10柱純化，收集純化液，按照1:3000的體積添加自制的酶反應(yīng)物稀釋液，控制最終使用濃度在0.5μg/ml，混合均勻即得酶反應(yīng)物；七：生物素標記的乙肝病毒前s1抗體溶液的制備（一）生物素反應(yīng)物稀釋液的配制1、取tris4.846g、hcl2847μl于燒瓶中，然后在燒瓶中加入純化水，充分攪拌使試劑完全溶解；2、調(diào)ph，控制ph在7.35-7.45；3、稱取bsa4g倒入上述燒杯中；4、最后燒杯定容至400ml，用0.2μm濾器過濾即得；（二）取生物素化抗體，以生物素反應(yīng)物稀釋液稀釋，控制最終使用濃度在0.5μg/ml，混勻，即可得到生物素結(jié)合物。八、優(yōu)化與驗證主要性能指標均符合發(fā)光檢測試劑技術(shù)評審規(guī)范。1、陰性符合率檢測260例雅培化學發(fā)光試劑檢測的臨床血樣，陰性符合率（-/-）為260/260，符合率100%。2、陽性符合率檢測215份雅培化學發(fā)光試劑檢測的臨床血樣，陽性符合率（+/+）為212/215，符合率為98.6%。3、重復性用經(jīng)國家參考品標化的企業(yè)精密度參考品重復檢測10次，其變異系數(shù)cv在1.60~2.75%之間，符合不大于10.0%的行業(yè)規(guī)范（全自動儀器操作）。4、批間差用經(jīng)國家參考品標化的企業(yè)精密度質(zhì)控品檢測三個批號試劑盒，其批間變異系數(shù)（cv）在2.50~4.24%之間，符合行標小于15%的要求（全自動儀器操作）。分析結(jié)果如下：精密性質(zhì)控品平均值標準差cv%l9384.5253.22.70%m1072354252.53.97%h82330514060.31.71%5、穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性：試劑盒在37℃放置7天后進行檢測，檢測信號與對照相比，變化幅度不超過15%。實施例中試劑盒的一種半自動儀器檢測方法，檢測步驟包括（1）取出試劑盒置于室溫，使試劑盒的溫度平衡至室溫（18～25℃）。（2）樣本應(yīng)混合均勻，若樣本為凍融樣本，平衡至室溫（18～25℃）后再進行檢測。（3）按照濃縮洗液:蒸餾水=1:39的比例配制洗液，混合均勻后，轉(zhuǎn)入洗液瓶中。（4）取出檢測乙型肝炎病毒前s1抗原板板條，設(shè)好校準品孔、待檢樣品孔。將其余板條放回鋁箔袋中，封存。（5）按表1順序，進行半自動加樣與反應(yīng)操作。表1加樣和操作對照表底物液a和b也可在用前等體積混勻后每孔加100μl，如果底物液a和b混勻使用，則混合液應(yīng)在30分鐘內(nèi)被使用。實施例中試劑盒的一種半全自動儀器檢測方法，采用全自動化學發(fā)光免疫分析儀adcclia200/300/400/500/600以及smart3000/smart300/smart3000s進行檢測，檢測步驟包括（1）在使用全自動化學發(fā)光免疫分析儀（以下簡稱“儀器”）時，請務(wù)必仔細閱讀儀器的操作手冊，務(wù)必按照相應(yīng)的操作說明對儀器進行設(shè)置、檢查和維護，以實現(xiàn)最佳檢測性能。（2）按照儀器的操作手冊說明配置試劑信息，并在“微板布局設(shè)置”中設(shè)置對照品孔和樣本孔的位置。特別地，請在儀器的“方法編輯”界面按照表2所示參數(shù)進行檢測方法配置。（3）按照表2全自動儀器參數(shù)設(shè)置表，進行參數(shù)設(shè)置與數(shù)據(jù)表2全自動化學發(fā)光免疫分析儀參數(shù)表除上述實施例外，本發(fā)明還包括有其他實施方式，凡采用等同變換或者等效替換方式形成的技術(shù)方案，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12