本發(fā)明涉及膠原蛋白分子測定技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種利用凝膠過濾色譜柱結(jié)合高效液相色譜法測定膠原蛋白分子質(zhì)量的方法。

背景技術(shù)：

膠原蛋白分子是依靠氫鍵等非共價(jià)鍵維持其三股螺旋構(gòu)象，當(dāng)膠原分子從外界吸收足夠多的熱量后，這些非共價(jià)鍵就會(huì)遭到破壞，膠原的三股螺旋構(gòu)象會(huì)隨之改變?yōu)闊o規(guī)卷曲構(gòu)象。膠原在熱變性后會(huì)成為明膠甚至變成相對分子質(zhì)量更小的水解膠原，此時(shí)膠原的低抗原性、生物相容性等優(yōu)良特性都將消失，因而膠原的制備、儲(chǔ)存和應(yīng)用都必須防范膠原受到升溫、光照等物理因素變化的影響，避免熱變性過程的發(fā)生，以確保膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)與生物學(xué)性能不發(fā)生改變。

目前國內(nèi)測定蛋白質(zhì)的方法有考馬斯亮藍(lán)法、凱氏定氮法、雙縮脲法，但這些方法都是對總蛋白質(zhì)含量的測定，而聚丙烯酰氨凝膠電泳法可以對蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的分布特點(diǎn)進(jìn)行定性，但由于每一批樣品染色程度的差異，會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。

凝膠過濾色譜一般用于分離水溶性大分子，一個(gè)含有各種分子量的樣品溶液緩慢流經(jīng)凝膠過濾色譜柱時(shí)，各分子在柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行著兩種不同的運(yùn)動(dòng)：垂直向下的移動(dòng)和無定向的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，只能分布于顆粒之間，所以在洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動(dòng)的過程中，從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，從而達(dá)到分離的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，開發(fā)一種針對膠原蛋白分子質(zhì)量進(jìn)行測量的方法，可以實(shí)現(xiàn)對膠原蛋白分子質(zhì)量的精準(zhǔn)檢測。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種測定膠原蛋白分子質(zhì)量的方法，具體步驟如下：

s1、制備標(biāo)準(zhǔn)樣品：選用若干分子量分布于40～200kda的蛋白作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，所述分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量大于等于5個(gè)；

所述標(biāo)準(zhǔn)樣品優(yōu)選為肌球蛋白(200kda)、β-半乳糖苷酶(116kda)、磷酸酶b(97.2kda)、牛血清蛋白(66.4kda)、卵清蛋白(43kda)作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品；

s2、制備檢測樣品：取待測凍干后的膠原蛋白溶于質(zhì)量濃度為0.01～0.1％的迭氮鈉溶液中，攪拌至充分溶解，4℃靜置24～48h，制得膠原蛋白液；

所述膠原蛋白液中待測膠原蛋白的終濃度為0.2～10mg/ml；

取所述膠原蛋白液，加入等體積的0.02mol/lnah2po4-0.2mol/lna2so4緩沖溶液，所述0.02mol/lnah2po4-0.2mol/lna2so4緩沖溶液中含質(zhì)量濃度為0～1％的十二烷基硫酸鈉及0～6mol/l的尿素，搖床震蕩1～5h，過0.45μm水系膜，得到待測膠原蛋白檢測樣品；

本發(fā)明采用凍干的膠原蛋白可以保證配制成溶液后的濃度。

s3、樣品測定：采用tsk-gelg4000-swxl(7.8mm×30.0cm)凝膠過濾色譜柱測定分別步驟s1制得的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品及步驟s2制得的待測膠原蛋白檢測樣品，得到分子量標(biāo)準(zhǔn)品以及膠原蛋白的保留時(shí)間；

具體檢測條件為：

進(jìn)樣量：20μl；進(jìn)樣濃度：0.1～1mg/ml；檢測波長：220nm；

流動(dòng)相：所述流動(dòng)相組成與步驟s2所述0.02mol/lnah2po4-0.2mol/lna2so4緩沖溶液的組成相同；

洗脫流速：0.2～1ml/min；

s4、根據(jù)步驟s3測得的分子量標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間，以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對數(shù)與保留時(shí)間做線性回歸，得到膠原蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線；

將步驟s3得到的待測膠原蛋白的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對，即可得到膠原蛋白的分子質(zhì)量。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明依據(jù)凝膠色譜柱對不同尺寸的分子進(jìn)行分離，從而進(jìn)行測定。本發(fā)明方法操作簡便，分離效果好，利用保留時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)樣品的相對分子質(zhì)量對數(shù)即可對蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量進(jìn)行分析。對不同分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行柱分離分析，由于蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小的不同，分子會(huì)自大而小依次流出色譜柱，得到峰面積各不相同的色譜峰，因此依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間與相對分子質(zhì)量對數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)樣品分子質(zhì)量的測定方法對膠原蛋白的分子質(zhì)量進(jìn)行測定，將測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對，可以得到不同溫度貯存過程中膠原蛋白分子質(zhì)量的變化情況。

2、本發(fā)明采用凝膠過濾色譜-高效液相色譜法對膠原蛋白的分子質(zhì)量進(jìn)行測定，可以快速得到膠原蛋白在不同處理?xiàng)l件下的分子質(zhì)量變化情況，能夠直觀地反應(yīng)膠原蛋白的降解情況，為膠原蛋白的分析提供了一種更加簡便的方法。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1得到的保留時(shí)間-相對分子質(zhì)量對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖2是實(shí)施例2經(jīng)37℃處理0h未經(jīng)處理的膠原蛋白的凝膠色譜圖。

圖3是實(shí)施例2經(jīng)37℃處理8h后的膠原蛋白的凝膠色譜圖。

圖4是實(shí)施例2經(jīng)37℃處理24h后的膠原蛋白的凝膠色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)樣品制備：選用若干分子量分布于40～200kda的蛋白作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，所述分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量大于等于5個(gè)；分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品分別選用肌球蛋白(200kda)、β-半乳糖苷酶(116kda)、磷酸酶b(97.2kda)、牛血清蛋白(66.4kda)、卵清蛋白(43kda)，采用高效液相色譜(hplc)確定上述蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。

hplc結(jié)合tsk-gelg4000-swxl(7.8mm×30.0cm)凝膠過濾色譜柱測定條件：進(jìn)樣量：20μl；進(jìn)樣濃度：0.6mg/ml；檢測波長：220nm；流動(dòng)相：0.01mol/lnah2po4-0.1mol/lna2so4緩沖溶液(含0.1％十二烷基硫酸鈉，0.01％尿素)；洗脫流速：0.7ml/min。根據(jù)保留時(shí)間與相對分子質(zhì)量對數(shù)確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，為y＝-0.1017x+6.1764(r²＝0.9166)，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。

實(shí)施例2：檢測待測樣品

標(biāo)準(zhǔn)樣品制備：選用若干分子量分布于40～200kda的蛋白作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，所述分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量大于等于5個(gè)；分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品分別選用肌球蛋白(200kda)、β-半乳糖苷酶(116kda)、磷酸酶b(97.2kda)、牛血清蛋白(66.4kda)、卵清蛋白(43kda)，采用高效液相色譜(hplc)確定上述蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。

稱取凍干后的海蜇傘部酶促溶性膠原蛋白(psc)溶于0.05％迭氮鈉溶液中，終濃度為2mg/ml，攪拌使其充分溶解，37℃分別靜置0、8、24h。將配置樣品加入等體積的0.02mol/lnah2po4-0.2mol/lna2so4緩沖溶液(含0.2％十二烷基硫酸鈉)，搖床震蕩1h，過0.45μm水系膜。采用高效液相色譜(hplc)確定海蜇傘部psc的分子質(zhì)量。

hplc結(jié)合tsk-gelg4000-swxl(7.8mm×30.0cm)凝膠過濾色譜柱測定條件：進(jìn)樣量：20μl；進(jìn)樣濃度：0.6mg/ml；檢測波長：220nm；流動(dòng)相：0.01mol/lnah2po4-0.1mol/lna2so4緩沖溶液(含0.2％十二烷基硫酸鈉)；洗脫流速：0.7ml/min。

根據(jù)保留時(shí)間與相對分子質(zhì)量對數(shù)確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，為y＝-0.1017x+6.1764(r²＝0.9166)。

37℃分別靜置0、8、24h的膠原蛋白凝膠色譜圖見圖2、3、4，psc在37℃條件下貯存8h后，大分子的分子質(zhì)量分別為84.23kda、125.72kda以及161.52kda，熱處理后，大分子量的吸收峰值明顯下降，降解率為20％；低于60kda的吸收峰值明顯增加，部分大分子質(zhì)量物質(zhì)被熱降解為小分子質(zhì)量物質(zhì)。24h后，分子量較大的海蜇傘部psc已完全受熱降解，符合膠原蛋白的降解率隨貯存時(shí)間的增長而增大的規(guī)律。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。