本發(fā)明屬于化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是一種ASE-HPLC法測(cè)定蓖麻子中蓖麻堿含量的方法。

背景技術(shù)：

《中國(guó)藥典》2015年版一部制備供試品方法：取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約2.5g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)適量，加熱回流提取4小時(shí)，棄去石油醚液，藥渣揮去溶劑，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，稱定重量，加熱回流2小時(shí)，放冷，再稱定重量，用50％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

該方法耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)技術(shù)人員的專業(yè)水平要求較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述不足，本發(fā)明旨在提供一種ASE-HPLC法測(cè)定蓖麻子中蓖麻堿含量的方法，該方法萃取時(shí)間短、檢測(cè)精度高。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)效果，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ASE-HPLC法測(cè)定蓖麻子中蓖麻堿含量的方法，其特征在于，依次包括下述步驟：

步驟1：采用ASE法萃取蓖麻子粉末，并收集甲醇萃取液；

步驟2：采用HPLC法測(cè)定甲醇萃取液中的蓖麻堿的含量。

優(yōu)選地，所述的步驟1依次包括下述子步驟：

步驟S1：將蓖麻子樣品粉碎，過(guò)二號(hào)篩，取1g與1g硅藻土混合；

步驟S2：將步驟S1所得的混合物裝于放有濾膜的ASE萃取池中，加硅藻土至與池口平行；

步驟S3：用正己烷萃取除雜，再用50％甲醇萃取，結(jié)束后，用甲醇將其定容至25ml。

優(yōu)選地，步驟S3所述的除雜參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為80℃，時(shí)間為5min，次數(shù)為3次，沖洗體積為80％，吹掃時(shí)間為100s。

優(yōu)選地，步驟S3所述的提取參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為110℃，時(shí)間為5min，次數(shù)為1次，沖洗體積為80％，吹掃時(shí)間為100s。

優(yōu)選地，步驟2所述的HPLC法的檢測(cè)參數(shù)如下：色譜柱為Thermo Syncronis Dim.AQ；柱溫為40℃；流速為0.3mL/min；流動(dòng)相為水-乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)為307nm。

優(yōu)選地，所述的色譜柱的規(guī)格為1.7μm，50×2.1mm。

優(yōu)選地，所述的流動(dòng)相為體積比等于90：10的水-乙腈。

優(yōu)選地，所述的ASE萃取池的體積為10ml。

本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明曾對(duì)快速溶劑萃取使用的溶劑進(jìn)行考察，《中國(guó)藥典》使用石油醚加熱回流1h除酯后，采用50％甲醇加熱回流1h，雜質(zhì)較少。而石油醚易揮發(fā)，易燃，故采用極性相對(duì)較接近的正己烷作為除雜溶劑，甲醇、50％甲醇作為提取溶劑進(jìn)行了溶劑考察，結(jié)果顯示正己烷除雜，50％甲醇提取后蓖麻堿含量與2015年版《中國(guó)藥典》含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用與藥典一致的提取溶劑。

2、在除雜過(guò)程中，藥典方法加入石油醚加熱回流4h，時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，石油醚易揮發(fā)，易燃，我們采用了多次萃取除雜的方式，發(fā)現(xiàn)80℃，提取5min，3次即可達(dá)到除去大部分雜質(zhì)，再多的提取時(shí)間和次數(shù)已經(jīng)無(wú)明顯影響，而相對(duì)高的溫度對(duì)提取效果影響不大，故最終確定最佳除雜工藝組合為提取溫度80℃，提取時(shí)間5min，提取次數(shù)3次。提取過(guò)程中采用110℃。提取5min，提取2次即可達(dá)到與藥典含量接近，更多的提取時(shí)間、溫度、次數(shù)對(duì)結(jié)果已經(jīng)無(wú)明顯影響。最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度110℃，提取時(shí)間5min，提取次數(shù)1次。

附圖說(shuō)明

圖1為以蓖麻子對(duì)照品的濃度(mg/ml)-峰面積進(jìn)行線性回歸圖；

圖2為蓖麻子對(duì)照品的色譜圖；

圖3為采用ASE法萃取所得的供試品溶液的色譜圖；

圖4為采用藥典方法提取所得的供試品溶液的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)所做的有限次修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

1、儀器設(shè)備及試劑

1.1儀器：

電子分析天平(XA205DU)、ASE350快速溶劑萃取儀(美國(guó)DIONEX公司)、Thermo U3000UHPLC液相色譜儀

1.2水：符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

2、方法

2.1對(duì)照品溶液的制備：取蓖麻堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含柚皮苷0.17mg的溶液，即得。

2.2供試品溶液的制備

2.2.1《中國(guó)藥典》2015年版一部制備供試品方法：

取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約2.5g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)適量，加熱回流提取4小時(shí)，棄去石油醚液，藥渣揮去溶劑，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，稱定重量，加熱回流2小時(shí)，放冷，再稱定重量，用50％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2快速溶劑萃取法(ASE)制備供試品方法：

樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)二號(hào)篩，取1.0g，精密稱定，與約1g硅藻土混合均勻，待用，移入到預(yù)先放好纖維濾膜的ASE 10ml萃取池中再加入適量硅藻土，輕輕振搖使之與池口在同一水平線上，擰緊萃取池上蓋，放入快速萃取儀中進(jìn)行萃取。萃取結(jié)束后，把萃取液轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用少量甲醇清洗萃取瓶3次合并至容量瓶中，使用甲醇定容至刻度，即得。

2.3ASE萃取條件

除雜參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為80℃，時(shí)間為5min，次數(shù)為3次，沖洗體積為80％，吹掃時(shí)間為100s。

提取參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為110℃，時(shí)間為5min，次數(shù)為1次，沖洗體積為80％，吹掃時(shí)間為100s。

2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

a)儀器：Thermo雙三元液相(U-3000)；

b)色譜柱：Thermo Syncronis Dim.(mm)AQ，1.7μm，50×2.1mm；

c)柱溫：40℃；

d)流速：0.3mL/min；

e)流動(dòng)相：水：乙腈(90：10)；

f)檢測(cè)波長(zhǎng)：307nm；

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.5測(cè)定法

照高效液相色譜法(通則0512)測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.6標(biāo)準(zhǔn)限值要求

本品按干燥品計(jì)算，含蓖麻堿不得過(guò)0.32％。

2.7計(jì)算(外標(biāo)法)

式中CR—對(duì)照品溶液濃度，單位為微克每升(mg/L)；

AX—供試品的峰面積；

AR—對(duì)照品峰面積。

注意：

使用前萃取池底部應(yīng)拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；

萃取池底部的濾紙應(yīng)在密封圈內(nèi)，否則引起滲漏；

萃取池裝樣時(shí)松緊適中，太松容易導(dǎo)致提取液過(guò)多；

開(kāi)機(jī)前檢查氣瓶氣壓是否達(dá)到1Mpa；

使用結(jié)束后清理干凈，萃取池要及時(shí)晾干(容易生銹)。

3、結(jié)果

3.1線性關(guān)系

取蓖麻堿對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每1ml約含0.7mg的溶液，即得，然后分別精密吸取該溶液0.1μl、0.3μl、0.5μl、1.0μl、1.2μl、1.5μl進(jìn)入LC測(cè)定，并依照上述方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

以濃度(mg/ml)-峰面積進(jìn)行線性回歸，詳見(jiàn)圖1，求得回歸方程：柚皮苷y＝7708.7x-28.51，R²＝1,蓖麻堿在0.015～0.233mg/ml圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取相同批號(hào)的樣品(批號(hào)：蓖麻子2)1.0g，共4份，精密稱定，按上述ASE提取方法提取供試品溶液，進(jìn)樣量為1μL，以上述的色譜條件平行試驗(yàn)，測(cè)得樣品中蓖麻堿的含量見(jiàn)表2，RSD為0.01％，試驗(yàn)表明ASE提取方法重復(fù)性良好。

表2重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取蓖麻堿對(duì)照品溶液(0.1553mg/ml)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，見(jiàn)圖2，峰面積RSD為0.30％，表明儀器精密度良好。

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0，2，4，8，10h依法測(cè)定。結(jié)果蓖麻堿峰面積的RSD為0.32％，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

其中，采用ASE萃取的樣品色譜圖見(jiàn)圖3，采用藥典方法提取的樣品色譜圖見(jiàn)圖4。

3.4樣品不同儀器提取結(jié)果及與藥典方法結(jié)果比較(2批)

表3不同ASE儀的提取含量結(jié)果

表4ASE與藥典方法提取的樣品含量結(jié)果

4、討論

4.1ASE提取溶劑的選擇：

試驗(yàn)中曾對(duì)快速溶劑萃取使用的溶劑進(jìn)行考察，《中國(guó)藥典》使用石油醚加熱回流1h除酯后，采用70％甲醇加熱回流1h，雜質(zhì)較少。而石油醚易揮發(fā)，易燃，故采用極性相對(duì)較接近的正己烷作為除雜溶劑，甲醇、70％甲醇作為提取溶劑進(jìn)行了溶劑考察，結(jié)果顯示正己烷除雜，70％甲醇提取后金絲桃苷含量與2015年版《中國(guó)藥典》含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用與藥典一致的提取溶劑。

4.2ASE提取條件的優(yōu)化

在除雜過(guò)程中，藥典方法加入石油醚加熱回流4h，時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，石油醚易揮發(fā)，易燃，我們采用了多次萃取除雜的方式，發(fā)現(xiàn)80℃，提取5min，3次即可達(dá)到除去大部分雜質(zhì)，再多的提取時(shí)間和次數(shù)已經(jīng)無(wú)明顯影響，而相對(duì)高的溫度對(duì)提取效果影響不大，故最終確定最佳除雜工藝組合為提取溫度80℃，提取時(shí)間5min，提取次數(shù)3次。提取過(guò)程中采用110℃。提取5min，提取2次即可達(dá)到與藥典含量接近，更多的提取時(shí)間、溫度、次數(shù)對(duì)結(jié)果已經(jīng)無(wú)明顯影響。最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度110℃，提取時(shí)間5min，提取次數(shù)1次。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。