本發(fā)明屬于分析檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種功能性成分的活性檢測(cè)方法，具體來(lái)說(shuō)是一種用于免疫活性肽免疫活性檢測(cè)的熒光偏振方法。

背景技術(shù)：

免疫活性肽通常是指外源性基因重組或人工化學(xué)合成的耐受原表位肽或變構(gòu)肽。作為一種短肽，免疫活性肽具有來(lái)源廣、活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，在功能性食品、保健品及醫(yī)療藥品等領(lǐng)域中有著廣大的應(yīng)用前景。目前，免疫活性肽絕大部分來(lái)源于天然產(chǎn)物，在這些免疫活性肽的篩選過(guò)程中，淋巴細(xì)胞增殖法是常用的免疫活性檢測(cè)方法。該法操作過(guò)程繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低，檢測(cè)結(jié)果受到淋巴細(xì)胞來(lái)源、操作人員專業(yè)水平及操作環(huán)境等諸多因素的干擾，因而迫切需要發(fā)展一種更加簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確的。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，免疫活性肽存在不同的抗原表位，當(dāng)免疫活性肽被抗原提呈細(xì)胞(apc)識(shí)別時(shí)，這些表位能與apc表面的mhc類分子發(fā)生特異性結(jié)合，形成mhc類分子-免疫活性肽復(fù)合物，該復(fù)合物與t細(xì)胞表面受體(tcr)分子發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而激活自身反應(yīng)性t淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，使其活化、增殖。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于免疫活性肽免疫活性檢測(cè)的熒光偏振方法，所述的這種用于免疫活性肽免疫活性檢測(cè)的熒光偏振方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)免疫活性肽免疫活性的方法操作過(guò)程繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低的技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明提供了一種用于免疫活性肽免疫活性檢測(cè)的熒光偏振方法，其特征在于包括如下步驟：

1)一個(gè)確定流感病毒熒光標(biāo)記物工作濃度的步驟，用100mmol/l、ph5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按5倍比例稀釋流感病毒熒光標(biāo)記物，取200μl于96孔板中，37℃孵育72h，用spectramaxm5酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)為492nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm下檢測(cè)熒光偏振光強(qiáng)度，以達(dá)到穩(wěn)定偏振值所對(duì)應(yīng)的最小濃度作為流感病毒熒光標(biāo)記物的工作濃度；

2)一個(gè)確定hla-drb4復(fù)合蛋白工作濃度的步驟，用100mmol/l、ph5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按1:2、1:4、1:8、1:80和1:800的比例稀釋hla-drb4復(fù)合蛋白溶液；取100μlhla-drb4復(fù)合蛋白溶液于96孔板，然后加入流感病毒熒光標(biāo)記物和100mmol/l、ph5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，使流感病毒熒光標(biāo)記物終濃度為步驟(1)確定的工作濃度，同時(shí)使得96孔板中的體積為200ul；將反應(yīng)溶液混勻后于37℃孵育72min，用spectramaxm5酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)為492nm、發(fā)射波長(zhǎng)為520nm的條件下檢測(cè)熒光偏振光強(qiáng)度，以最大偏振值60％對(duì)應(yīng)的hla-drb4復(fù)合蛋白濃度作為其最佳工作濃度；

3)一個(gè)建立免疫活性肽的結(jié)合率曲線的步驟，以流感病毒素濃度為橫坐標(biāo)，結(jié)合率為縱坐標(biāo)建立免疫活性肽的結(jié)合率曲線，結(jié)合率的計(jì)算公式如下：

式中：fp樣品為待檢測(cè)樣品的熒光偏振值，fp標(biāo)記肽為流感病毒熒光標(biāo)記物標(biāo)記肽對(duì)應(yīng)的熒光偏振值，fp無(wú)競(jìng)爭(zhēng)為流感病毒熒光標(biāo)記物熒光標(biāo)記肽和hla-drb4復(fù)合蛋白的熒光偏振值；

4)一個(gè)制備免疫活性肽樣品的步驟，稱取200mgii型膠原蛋白，加雙蒸水配置成1mg/ml的溶液，置于溫度為50℃的酶反應(yīng)器中，按加酶量為80u/ml加入中性蛋白酶酶解3h，蛋白酶的酶活為10000u/g，收集酶解液，將酶解液于40℃、100rpm的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮；使其終濃度為4mg/ml；

5)一個(gè)檢測(cè)免疫活性肽免疫活性的步驟，將濃度為4mg/ml的免疫活性肽樣品用雙蒸水按100倍稀釋倍數(shù)稀釋成系列濃度，取總體積為200μl的溶液，該溶液中含有50μl的流感病毒熒光標(biāo)記物、50μl的hla-drb4復(fù)合蛋白溶液以及100μl的免疫活性肽溶液，所述的流感病毒熒光標(biāo)記物的濃度符合步驟1)的結(jié)果，所述的hla-drb4復(fù)合蛋白溶液的濃度符合步驟2)的結(jié)果，將該溶液置于96孔板中，混勻后37℃孵育72min，再用spectramaxm5酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)為492nm、發(fā)射波長(zhǎng)為520nm下檢測(cè)其熒光偏振光強(qiáng)度，然后計(jì)算免疫活性肽ic50值，其中，ic50值定義為在競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中結(jié)合率為50％時(shí)的免疫活性肽的濃度。

本發(fā)明根據(jù)mhc類分子能與免疫活性肽特異性結(jié)合的原理，提出了一種用于免疫活性肽免疫活性檢測(cè)的熒光偏振免疫分析法。熒光偏振免疫分析法(fluorescencepolarizationimmunoassay，fpia)是一種定量免疫分析技術(shù)，其基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍(lán)偏振光(485nm)照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復(fù)至基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光。

本發(fā)明利用流行感冒病毒偶聯(lián)fitc熒光素合成熒光標(biāo)記物，并以該熒光標(biāo)記物為競(jìng)爭(zhēng)物，使其與待測(cè)免疫活性肽競(jìng)爭(zhēng)性地與hla-drb4復(fù)合蛋白結(jié)合，通過(guò)對(duì)結(jié)合率的計(jì)算建立了免疫活性肽活性的的熒光偏振定量檢測(cè)方法。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明建立的免疫活性肽免疫活性的熒光偏振免疫分析方法，為免疫活性肽的高效篩選及制備的提供了一種可靠的分析手段。該法對(duì)免疫活性肽免疫活性檢測(cè)的ic50為98.32ng/ml，線形范圍為9.82～9985.43ng/ml(ic20-ic80)，具有較高的靈敏度。本發(fā)明的方法具有快速、簡(jiǎn)便、高效及可靠的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的方法只需要加樣，無(wú)需分離和洗滌操作。國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于采用熒光偏振免疫分析法檢測(cè)免疫活性肽免疫活性的方法。

附圖說(shuō)明

圖1是用熒光偏振法建立的流感病毒素的結(jié)合率曲線。

圖2是用熒光偏振法建立的免疫活性肽結(jié)合率曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。另外，本發(fā)明采用的原料均為市場(chǎng)上可以購(gòu)買(mǎi)的物質(zhì)。

實(shí)施例1

流感病毒熒光標(biāo)記物工作濃度的確定，具體步驟為：

用100mmol/l、ph5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按5倍比例稀釋流感病毒熒光標(biāo)記物(購(gòu)自于南京肽業(yè)生物科技有限公司)，取200μl于96孔板中，37℃孵育72h，用spectramaxm5酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)為492nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm下檢測(cè)其熒光偏振光強(qiáng)度。當(dāng)偏振值達(dá)到穩(wěn)定后，所對(duì)應(yīng)的流感病毒熒光標(biāo)記物的最小濃度為5μm，以此作為流感病毒熒光標(biāo)記物的工作濃度。

實(shí)施例2

mhc工作濃度的確定，具體步驟為：

用100mmol/l、ph5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按1:2、1:4、1:8、1:80和1:800的比例稀釋hla-drb4復(fù)合蛋白溶液(購(gòu)自于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；取100μlhla-drb4復(fù)合蛋白溶液于96孔板，再加入同等體積的流感病毒熒光標(biāo)記物，使流感病毒熒光標(biāo)記物終濃度為步驟(1)確定的工作濃度；將反應(yīng)溶液混勻后于37℃孵育72min，用spectramaxm5酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)為492nm、發(fā)射波長(zhǎng)為520nm的條件下檢測(cè)其熒光偏振光強(qiáng)度。當(dāng)熒光偏振光強(qiáng)度達(dá)到最大偏振值的60％時(shí)，對(duì)應(yīng)的hla-drb4復(fù)合蛋白濃度為125nm，此即為hla-drb4復(fù)合蛋白的最佳工作濃度。見(jiàn)附圖1。

實(shí)施例3

建立免疫活性肽的結(jié)合率曲線：以流感病毒素濃度為橫坐標(biāo)，結(jié)合率為縱坐標(biāo)建立免疫活性肽的結(jié)合率曲線。結(jié)合率的計(jì)算公式如下：

式中：fp樣品為待檢測(cè)樣品的熒光偏振值，fp標(biāo)記肽為流感病毒熒光標(biāo)記物標(biāo)記肽對(duì)應(yīng)的熒光偏振值，fp無(wú)競(jìng)爭(zhēng)為流感病毒熒光標(biāo)記物熒光標(biāo)記肽和hla-drb4復(fù)合蛋白的熒光偏振值。

實(shí)施例4

免疫活性肽樣品的制備：稱取200mgii型膠原蛋白，加雙蒸水配置成1mg/ml的溶液，置于溫度為50℃的酶反應(yīng)器中。按加酶量為80u/ml加入中性蛋白酶(購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，酶活為10000u/g)酶解3h，收集酶解液。將酶解液于40℃、100rpm的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮。

實(shí)施例5

免疫活性肽免疫活性的檢測(cè)，具體步驟如下：

將濃度為4mg/ml的免疫活性肽用雙蒸水按100倍稀釋倍數(shù)稀釋成系列濃度。取總體積為200μl的溶液，該溶液中含有50μl濃度為5μm的流感病毒熒光標(biāo)記物、50μl濃度為125nm的hla-drb4復(fù)合蛋白溶液以及100μl的免疫活性肽溶液。將該溶液置于96孔板中，混勻后37℃孵育72min，再用spectramaxm5酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)為492nm、發(fā)射波長(zhǎng)為520nm下檢測(cè)其熒光偏振光強(qiáng)度。以雙蒸水作為空白對(duì)照。計(jì)算ic50值，ic50值定義為在競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中結(jié)合率為50％時(shí)的免疫活性肽的濃度。結(jié)果表明免疫活性肽的ic50＝64.36ng/ml。見(jiàn)附圖2。