本發(fā)明涉及植物學(xué)領(lǐng)域，具體是一種主脈支撐葉片快速徒手切片方法。

背景技術(shù)：

徒手切片技術(shù)，是植物學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中常用的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可以切新鮮材料，觀察到植物組織自然的色澤和活體結(jié)構(gòu)，在植物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科研中應(yīng)用廣泛。此法常用于觀察植物體的結(jié)構(gòu)、鑒定植物細(xì)胞組織的化學(xué)成分，近年來也常用于檢測基因植株中報(bào)告基因的表達(dá)。通常要求材料具有合適的硬度和大小，過硬或過軟的材料，徒手切片相對難度較大，其中，葉片的徒手切片，難度較大，因?yàn)槿~片相對而言比較軟，大多不能直接進(jìn)行徒手切片，目前，文獻(xiàn)報(bào)道的有這樣幾種方法：第一種是用夾持物(如馬鈴薯塊莖的條狀物)夾持，在切夾持物的同時(shí)，也獲取葉片的切片，此法是目前教科書最常用的方法。優(yōu)點(diǎn)是普適性很強(qiáng)，缺點(diǎn)是容易混雜夾持物的材料；第二種是用三個(gè)刀片捆綁，其中中間一片刀片縮進(jìn)幾毫米，利用縮進(jìn)的縫隙，切得葉片薄片，優(yōu)點(diǎn)是避免混雜夾持物材料，缺點(diǎn)是需要用三個(gè)刀片，成本較高，而且多個(gè)刀片捆綁，也增加了安全風(fēng)險(xiǎn)，厚度額定為刀片的厚度，不能根據(jù)需要調(diào)整厚度，因此對材料有一定要求。第三種是利用鑷子夾住材料進(jìn)行徒手切片，此法操作性不強(qiáng)，不太容易切??；第四種是緊貼食指平行切割，是類似于平常切菜的一種方法，通過來回切割，食指的微小退縮，獲取標(biāo)本薄片，優(yōu)點(diǎn)是不需要夾持物；缺點(diǎn)是安全風(fēng)險(xiǎn)大，不易切薄，并且，對材料也有所要求。第五種是乳膠管法，將直徑1～1.5cm的乳膠管剪成3.5cm長的一段，用剪子從中間剖開扣在右手的大拇指上，注意皮套一定要高于拇指，把要切的植物材料，緊貼在皮套的外側(cè)。如果是葉可以把它卷緊，所切的材料不可過長，大約2～2.5cm即可，此時(shí)用食指與中指和拇指一起把材料捏住，幼嫩的材料捏時(shí)不可用力過猛，以免損壞組織細(xì)胞，右手的拇指和食指捏住雙面刀片的一側(cè)，手腕端平，把刀片的前端與要切的材料保持垂直相接狀態(tài)，先切平材料，然后用腕力向內(nèi)連續(xù)切片，刀片只要搭住材料就可以垂直切片，優(yōu)點(diǎn)也是不需要夾持物；缺點(diǎn)是成本高，且操作難度大，不太容易掌握，對材料有所要求。第六種對于革質(zhì)的葉片，可將多片同等大小的葉片疊加一起，捏住，一起切，缺點(diǎn)是容易松散，不容易切?。坏谄叻N對于革質(zhì)的葉片，還可以將葉片卷成筒狀，捏住，一起切，缺點(diǎn)是不太容易切薄，不容易切均勻。第八種是石蠟切片法，雖然獲取的標(biāo)本可以永久保存，但是制片流程長，耗時(shí)久，成本高，獲取率低，且揮發(fā)性有機(jī)試劑利用量大，對人體、環(huán)境均有危害，另外，在制片的過程中用了高毒、強(qiáng)溶劑，很多小結(jié)構(gòu)或成分被溶解，在脫水、透明的過程中容易丟失。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種主脈支撐葉片快速徒手切片方法，該方法能夠避免夾持材料的混雜；耗時(shí)短、成本低、操作簡單，能夠輕松獲取厚薄均勻的切片，便于觀察新鮮葉片標(biāo)本的細(xì)胞變化，而且過程所用溶劑少，危害小。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種主脈支撐葉片快速徒手切片方法，包括以下步驟：

(1)清洗與浸泡：將采集的發(fā)育成熟、沒有病蟲害、健康、完整的葉片放入清水中洗滌，葉柄置入清水中浸泡，待用；

(2)切割與修剪：取出一片葉片，沿著主脈兩側(cè)修剪，沿主脈兩側(cè)分別保留2～6mm寬葉片，整體長度2～6cm，并沿長度的一半處，一分為二，切成兩段；

(3)材料的放置與拿捏：將兩段含有葉片的主脈部分的上表皮面對面放置，左手的食指和拇指捏住材料，食指保持水平，拇指略低于食指，中指在下方稍作固定，起支撐作用，材料垂直于水平面；

(4)切片：右手握雙面刀片，略微翻腕，保持刀片水平狀態(tài)，刀片置于左手食指上方，從左前方向右后方平行拉動(dòng)，即可獲得含有主脈的葉片切片，置于盛有水的培養(yǎng)皿中暫存；

(5)染色、鏡檢：在載玻片的中央滴1滴清水，用沾有0.1％番紅染料的膠頭滴管在水滴中蘸一下(簡稱“淺染”，標(biāo)準(zhǔn)：水滴中呈現(xiàn)粉紅色至淺紅色即可，注意不要太多染料)，水滴呈現(xiàn)粉紅色至淺紅色，用毛筆的尖端挑選漂浮在培養(yǎng)皿水面上、透明的葉片切片，置于載玻片的水滴中；蓋玻片的左側(cè)邊緣接觸到水滴的左側(cè)邊緣，成45°角之后，緩緩放下，排除氣泡，蓋上蓋玻片；擦去載玻片下方的水，將載玻片放置載物臺(tái)上，使葉片切片對準(zhǔn)通光孔，先低倍鏡，后高倍鏡觀察葉片切片的細(xì)胞狀態(tài)和結(jié)構(gòu)層次并拍照。

為簡單說明問題起見，以下對本發(fā)明所述的主脈支撐葉片快速徒手切片方法均簡稱為本方法。

經(jīng)觀察，葉片切片的導(dǎo)管和厚壁組織都被番紅染成淺紅或粉紅，其它生活的細(xì)胞仍然保持綠色生活狀態(tài)，結(jié)構(gòu)層次清楚明了。

所述的原料葉片是主脈顯著、革質(zhì)粗壯的常綠闊葉植物的葉片，這類植物葉片的主脈含有大量的維管組織和機(jī)械組織以及薄壁組織，維管組織和機(jī)械組織束狀排列、細(xì)胞壁較厚，通過“面對面”的放置，后方的主脈為前方的主脈起到強(qiáng)有力的支持作用，同時(shí)，薄壁組織的膨壓也起了很重要的作用，這樣，就可以獲得比傳統(tǒng)徒手切片法更好的實(shí)驗(yàn)效果。同時(shí)，還避免了夾持物帶來的阻力和影響，避免馬鈴薯等夾持物淀粉粒或其他成分影響對葉片本身結(jié)構(gòu)觀察的影響。

經(jīng)典徒手切片法，由于加入了夾持物，阻力較大，不太容易切薄，切片標(biāo)本的獲取率會(huì)受到影響。石蠟切片法的每個(gè)操作環(huán)節(jié)受技術(shù)和多方面的影響，更是淘汰率很高，而本方法利用主脈支撐快速徒手切葉片，整體阻力較小，容易切薄，淘汰率低，幾乎每片都可以達(dá)到裝片的要求。

本方法無論在取材、材料的處理，還是具體操作，耗時(shí)都較少，不需使用夾持物，省去了夾持物的修剪、整理、切割時(shí)間，還能夠避免夾持物的污染；使用的藥品也較少，最大程度地降低實(shí)驗(yàn)成本。

本方法染色層次性好、觀察生活細(xì)胞真實(shí)完整：通過番紅淺染，可以使不同增厚細(xì)胞壁的細(xì)胞染色效果呈現(xiàn)較好的染色層次，同時(shí)，不影響生活的薄壁細(xì)胞(如葉肉組織細(xì)胞)，使之仍然保持綠色狀態(tài)，這樣，既能觀察到生活狀態(tài)的細(xì)胞，又能觀察到不同增厚的死細(xì)胞。而且，涉及藥品較少，比較原生態(tài)地保持整體結(jié)構(gòu)狀態(tài)，避免石蠟切片法中二甲苯的強(qiáng)溶劑的毒性、強(qiáng)溶解能力將很多結(jié)構(gòu)溶解消失、破壞的情況。

下面以表格形式列舉本方法與傳統(tǒng)的徒手切片法和石蠟切片法的效果對比，如表1所示：

表1本方法與傳統(tǒng)的徒手切片法和石蠟切片法對比結(jié)果

附圖說明

圖1是實(shí)施例1制作的夾竹桃葉片切片的主脈結(jié)構(gòu)。

圖2是用馬鈴薯作夾持物的傳統(tǒng)徒手切片法制作的夾竹桃葉片切片的主脈結(jié)構(gòu)。

圖3是傳統(tǒng)的石蠟切片法制作的夾竹桃葉片永久制片的主脈結(jié)構(gòu)。

圖4是實(shí)施例2制作的珊瑚冬青葉片切片的葉肉結(jié)構(gòu)。

圖5是實(shí)施例2制作的珊瑚冬青葉片切片的主脈結(jié)構(gòu)。

圖6是實(shí)施例3制作的女貞葉片切片的葉肉結(jié)構(gòu)。

圖7是實(shí)施例3制作的女貞葉片切片的主脈結(jié)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1夾竹桃葉片快速徒手切片方法：

(1)清洗與浸泡：將采集的發(fā)育成熟、沒有病蟲害、健康、完整的夾竹桃葉片(葉位在2～6)放入清水中洗滌，葉柄置入清水中浸泡，待用；

(2)切割與修剪：取出一片夾竹桃葉片，沿著主脈兩側(cè)修剪，沿主脈兩側(cè)分別保留2～6mm寬葉片，整體長度2～6cm，并沿長度的一半處，一分為二，切成兩段；

(3)材料的放置與拿捏：將兩段含有葉片的主脈部分的上表皮面對面放置，左手的食指和拇指捏住材料，食指保持水平，拇指略低于食指，中指在下方稍作固定，起支撐作用，材料垂直于水平面；

(4)切片：右手握雙面刀片，略微翻腕，保持刀片水平狀態(tài)，刀片置于左手食指上方，從左前方向右后方平行拉動(dòng)，即可獲得含有主脈的夾竹桃葉片切片，置于盛有水的培養(yǎng)皿中，每切一刀均可獲取兩片夾竹桃葉片切片，并且不受其他材料的污染；

(5)染色、鏡檢：在潔凈的載玻片的中央滴1滴清水，用沾有0.1％番紅染料的膠頭滴管在水滴中蘸一下，水滴呈現(xiàn)粉紅色至淺紅色，用毛筆的尖端挑選漂浮在培養(yǎng)皿水面上、透明的夾竹桃葉片切片，置于載玻片的水滴中；蓋玻片的左側(cè)邊緣接觸到水滴的左側(cè)邊緣，成45°角之后，緩緩放下，排除氣泡，蓋上蓋玻片，吸水紙吸去多余水分；擦去載玻片下方的水，將載玻片放置載物臺(tái)上，使夾竹桃葉片切片對準(zhǔn)通光孔，先低倍鏡，后高倍鏡觀察葉片切片的細(xì)胞狀態(tài)和結(jié)構(gòu)層次并拍照。

鏡檢結(jié)果：夾竹桃葉片切片的導(dǎo)管、厚壁組織都被番紅染成淺紅或粉紅，其他生活的細(xì)胞仍然保持綠色生活狀態(tài)，結(jié)構(gòu)層次清楚明了。

為了對比本實(shí)施例的快速徒手切片方法與用馬鈴薯作夾持物的傳統(tǒng)的徒手切片法效果的不同，分別觀察了本實(shí)施例制作的夾竹桃葉片切片和用馬鈴薯作夾持物的傳統(tǒng)徒手切片法制作的夾竹桃葉片切片的主脈結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1和圖2所示，從圖2中可以看出，用馬鈴薯作夾持物的傳統(tǒng)徒手切片法制作的葉片切片中混入了淀粉粒的干擾(圖2中箭頭所指表示馬鈴薯淀粉粒)。

為了對比本實(shí)施例的快速徒手切片方法與傳統(tǒng)的石蠟切片法的優(yōu)劣，觀察了傳統(tǒng)石蠟切片法制作的夾竹桃葉片永久制片的主脈結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示，從圖3可以看出，氣孔窩和主脈下表皮的表皮毛丟失得比較多，主要因?yàn)槭炃衅ㄓ玫降膹?qiáng)溶劑二甲苯的強(qiáng)溶解力，致使一些小細(xì)胞和成分被強(qiáng)溶劑溶解丟失，影響后續(xù)觀察結(jié)果。

實(shí)施例2珊瑚冬青葉片快速徒手切片方法：

(1)清洗與浸泡：將采集的發(fā)育成熟、沒有病蟲害、健康、完整的珊瑚冬青葉片(葉位在2～6)放入清水中洗滌，葉柄置入清水中浸泡，待用；

(2)切割與修剪：取出一片珊瑚冬青葉片，沿著主脈兩側(cè)修剪，沿主脈兩側(cè)分別保留2～6mm寬葉片，整體長度2～6cm，并沿長度的一半處，一分為二，切成兩段；

(3)材料的放置與拿捏：將兩段含有葉片的主脈部分的上表皮面對面放置，左手的食指和拇指捏住材料，食指保持水平，拇指略低于食指，中指在下方稍作固定，起支撐作用，材料垂直于水平面；

(4)切片：右手握雙面刀片，略微翻腕，保持刀片水平狀態(tài)，刀片置于左手食指上方，從左前方向右后方平行拉動(dòng)，即可獲得含有主脈的珊瑚冬青葉片切片，置于盛有水的培養(yǎng)皿中，每切一刀均可獲取兩片珊瑚冬青葉片切片，并且不受其他材料的污染；

(5)染色、鏡檢：在潔凈的載玻片的中央滴1滴清水，用沾有0.1％番紅染料的膠頭滴管在水滴中蘸一下，水滴呈現(xiàn)粉紅色至淺紅色，用毛筆的尖端挑選漂浮在培養(yǎng)皿水面上、透明的珊瑚冬青葉片切片，置于載玻片的水滴中；蓋玻片的左側(cè)邊緣接觸到水滴的左側(cè)邊緣，成45°角之后，緩緩放下，排除氣泡，蓋上蓋玻片，吸水紙吸去多余水分；擦去載玻片下方的水，將載玻片放置載物臺(tái)上，使葉片切片對準(zhǔn)通光孔，先低倍鏡，后高倍鏡觀察葉片切片的細(xì)胞狀態(tài)和結(jié)構(gòu)層次并拍照。

鏡檢結(jié)果：夾竹桃葉片切片的導(dǎo)管、厚壁組織都被番紅染成淺紅或粉紅，其他生活的細(xì)胞仍然保持綠色生活狀態(tài)，結(jié)構(gòu)層次清楚明了，如圖4、圖5所示。

實(shí)施例3女貞葉片快速徒手切片方法：

(1)清洗與浸泡：將采集的發(fā)育成熟、沒有病蟲害、健康、完整的女貞葉片(葉位在2～6)放入清水中洗滌，葉柄置入清水中浸泡，待用；

(2)切割與修剪：取出一片女貞葉片，沿著主脈兩側(cè)修剪，沿主脈兩側(cè)分別保留2～6mm寬葉片，整體長度2～6cm，并沿長度的一半處，一分為二，切成兩段；

(3)材料的放置與拿捏：將兩段含有葉片的主脈部分的上表皮面對面放置，左手的食指和拇指捏住材料，食指保持水平，拇指略低于食指，中指在下方稍作固定，起支撐作用，材料垂直于水平面；

(4)切片：右手握雙面刀片，略微翻腕，保持刀片水平狀態(tài)，刀片置于左手食指上方，從左前方向右后方平行拉動(dòng)，即可獲得含有主脈的女貞葉片切片，置于盛有水的培養(yǎng)皿中，每切一刀均可獲取兩片女貞葉片切片，并且不受其他材料的污染；

(5)染色、鏡檢：在潔凈的載玻片的中央滴1滴清水，用沾有0.1％番紅染料的膠頭滴管在水滴中蘸一下，水滴呈現(xiàn)粉紅色至淺紅色，用毛筆的尖端挑選漂浮在培養(yǎng)皿水面上、透明的女貞葉片切片，置于載玻片的水滴中；蓋玻片的左側(cè)邊緣接觸到水滴的左側(cè)邊緣，成45°角之后，緩緩放下，排除氣泡，蓋上蓋玻片，吸水紙吸去多余水分；擦去載玻片下方的水，將載玻片放置載物臺(tái)上，使葉片切片對準(zhǔn)通光孔，先低倍鏡，后高倍鏡觀察葉片切片的細(xì)胞狀態(tài)和結(jié)構(gòu)層次并拍照。

鏡檢結(jié)果：夾竹桃葉片切片的導(dǎo)管、厚壁組織都被番紅染成淺紅或粉紅，其他生活的細(xì)胞仍然保持綠色生活狀態(tài)，結(jié)構(gòu)層次清楚明了，如圖6、圖7所示。

以上所述的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干變型和改進(jìn)，這些也應(yīng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。