本發(fā)明涉及光學(xué)顯微領(lǐng)域，特別是一種分析更為簡(jiǎn)單而精確的、能夠測(cè)量擴(kuò)散系數(shù)的一種研究分子遷移運(yùn)動(dòng)的方法。

背景技術(shù)：

光脫色又稱光漂白，是指在光的照射下熒光物質(zhì)所激發(fā)出來(lái)的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間推移逐步減弱乃至消失的現(xiàn)象。熒光成像的質(zhì)量很大程度上依賴于熒光信號(hào)強(qiáng)度，提高激發(fā)光強(qiáng)度可以提高信號(hào)強(qiáng)度，但當(dāng)激發(fā)光的強(qiáng)度超過(guò)一定限度時(shí)，光吸收就趨于飽和，并不可逆地破壞激發(fā)態(tài)分子，這就是光漂白現(xiàn)象。熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)是使用親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等與蛋白或脂質(zhì)耦聯(lián)，用于檢測(cè)所標(biāo)記分子在活體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)動(dòng)及其遷移速率。熒光漂白后的恢復(fù)技術(shù)的原理是：利用高能激光照射細(xì)胞的某一特定區(qū)域，使該區(qū)域內(nèi)標(biāo)記的熒光分子不可逆的淬滅，這一區(qū)域稱熒光漂白區(qū)。隨后，由于細(xì)胞質(zhì)中的脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)，周圍非漂白區(qū)熒光分子不斷向光漂白區(qū)遷移，結(jié)果使熒光漂白區(qū)的熒光強(qiáng)度逐漸地回復(fù)到原有水平，在此基礎(chǔ)上迫切需要一種具有能夠用于測(cè)量擴(kuò)散系數(shù)的裝置及方法。

傳統(tǒng)的使用光漂白后熒光恢復(fù)的方法來(lái)研究分子遷移擴(kuò)散等運(yùn)動(dòng)的技術(shù)具有的缺陷有：為了達(dá)到實(shí)驗(yàn)中光信號(hào)采集的需求，熒光分子的密度需要很高；光束輪廓的測(cè)量需要非常精確；光漂白過(guò)程的監(jiān)控不容易達(dá)到，從而需要較高的光強(qiáng)進(jìn)行光漂白，這樣有可能會(huì)破壞樣品分子的結(jié)構(gòu)，特別是一些生物樣品分子。所述一種研究分子遷移運(yùn)動(dòng)的方法使用平面的光斑對(duì)樣品進(jìn)行光漂白及隨后的監(jiān)控探測(cè)，解決了上述缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明裝置使得在樣品表面產(chǎn)生明暗相間的條紋狀的光斑區(qū)域，在亮條紋區(qū)域用強(qiáng)光進(jìn)行光漂白后，繼續(xù)保持較低強(qiáng)度光照，來(lái)探測(cè)明暗條紋之間的對(duì)比度隨時(shí)間的變化，并通過(guò)后續(xù)分析來(lái)得到待測(cè)分子的擴(kuò)散系數(shù)等信息，布朗擴(kuò)散系數(shù)可以獨(dú)立地得到，其是整個(gè)光斑圖案區(qū)域的平均值。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

所述一種研究分子遷移運(yùn)動(dòng)的方法，裝置主要包括激光器、起偏器、普克爾盒、檢偏器、分光器、樣品、位移臺(tái)、平面鏡、光纖、濾光片、光電倍增管、鎖相放大器、電纜，所述平面鏡位于所述位移臺(tái)，所述鎖相放大器通過(guò)電纜分別連接所述普克爾盒與所述位移臺(tái)，所述樣品表面的光經(jīng)過(guò)所述光纖以及所述濾光片傳輸?shù)剿龉怆姳对龉苤?。方法步驟為：

一.所述激光器發(fā)射的激光束經(jīng)過(guò)所述起偏器、普克爾盒、檢偏器后，由所述分光器分為兩束激光，一束激光經(jīng)過(guò)距離l直接照射于所述樣品表面，另一束激光經(jīng)過(guò)距離a后到達(dá)所述平面鏡，經(jīng)過(guò)所述平面鏡反射后照射于所述樣品表面，上述照射于所述樣品表面的兩束激光呈θ角，從而在所述樣品表面處產(chǎn)生光的干涉圖案；

二.通過(guò)調(diào)節(jié)所述距離a和l的長(zhǎng)度，能夠改變所述角θ的值，從而改變所述樣品表面干涉條紋間距i；

三.通過(guò)所述普克爾盒使激光產(chǎn)生一個(gè)小于1秒的極短的滿強(qiáng)度的脈沖，對(duì)亮條紋處的熒光標(biāo)記的相應(yīng)種類的分子進(jìn)行光脫色，在光脫色過(guò)程結(jié)束后，所述激光器連續(xù)發(fā)射光強(qiáng)為i(r，t)的激光以探測(cè)所述樣品表面的熒光變化；

四.通過(guò)所述位移臺(tái)對(duì)所述平面鏡進(jìn)行位置調(diào)制，使得所述平面鏡沿其法向方向以頻率800hz進(jìn)行正弦振動(dòng)，從而改變所述樣品表面處干涉條紋位置；

五.所述光電倍增管收集光漂白后由于分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)而新出現(xiàn)的熒光信號(hào)，然后通過(guò)所述鎖相放大器進(jìn)行分析，從而得到所述樣品表面亮條紋部分與暗條紋部分的熒光強(qiáng)度之比，即平均對(duì)比度c(t)，所述光電倍增管測(cè)得的熒光信號(hào)f(t)與被熒光標(biāo)記的分子的濃度cm(r，t)和探測(cè)光強(qiáng)i(r，t)相關(guān)其中和是cm(r，t)和i(r，t)的空間傅里葉變換，f(t)可以分解為調(diào)制頻率的諧波級(jí)數(shù)，實(shí)驗(yàn)中，一階和二階的諧波分量f1(t)和f2(t)可以通過(guò)所述鎖相放大器同時(shí)得到；

六.最終的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)給出暗條紋與亮條紋之間的平均對(duì)比度上式用一個(gè)指數(shù)衰減來(lái)表征布朗擴(kuò)散行為；

七.由能夠求出弛豫時(shí)間τq，由弛豫時(shí)間τq與擴(kuò)散系數(shù)d的關(guān)系q為條紋圖案的空間周期，能夠求出擴(kuò)散系數(shù)d。

所述樣品表面具有一圓形開口的光掩膜、且其測(cè)量區(qū)域位于所述開口內(nèi)，光掩膜的材料對(duì)光的反射率很小，以能減小由于激光光斑造成的所述樣品表面非測(cè)量區(qū)域的雜散光對(duì)實(shí)驗(yàn)信噪比的影響；可以使用不同的激光波長(zhǎng)488nm、532nm、633nm等來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并綜合比較各激光波長(zhǎng)條件實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，以能夠更準(zhǔn)確地反映分子的遷移運(yùn)動(dòng)；對(duì)生物大分子樣品，光漂白時(shí)激光光強(qiáng)小于250w/cm²，且脈沖時(shí)間小于400ms。

普克爾盒是一種電光器件，它包含一個(gè)由光通過(guò)的電光晶體，基于普克耳斯效應(yīng)，能夠通過(guò)施加到晶體上的電壓來(lái)調(diào)控光的偏振方向以及改變光通過(guò)晶體后的位相延遲。

由于分子的擴(kuò)散作用，所述對(duì)比度c(t)隨時(shí)間減小，使用同一個(gè)條紋圖案來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行光脫色以及探測(cè)并收集信號(hào)保證了它們由同樣的波長(zhǎng)來(lái)表征。所述鎖相放大器中探測(cè)的熒光強(qiáng)度的基頻的成分隨時(shí)間改變，并滿足單模的擴(kuò)散方程，且對(duì)比度c(t)按照簡(jiǎn)單的指數(shù)衰減其中弛豫時(shí)間τq與擴(kuò)散系數(shù)d有關(guān)q為條紋圖案的空間周期，這樣，通過(guò)改變q，能夠檢驗(yàn)布朗擴(kuò)散法則并精確地決定運(yùn)動(dòng)分子的擴(kuò)散系數(shù)。常數(shù)c0、c1與運(yùn)動(dòng)分子和不運(yùn)動(dòng)分子之間的相對(duì)分?jǐn)?shù)和有關(guān)。

在含有n種不同運(yùn)動(dòng)種群的復(fù)雜樣品的情況，可以推廣為

第k種種群的擴(kuò)散系數(shù)和分?jǐn)?shù)分別為

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明分析更為簡(jiǎn)單且精確，更易于探測(cè)擴(kuò)散系數(shù)的較小變化，或是鑒別不同種群之間的區(qū)別；對(duì)樣品進(jìn)行光脫色以及探測(cè)并收集信號(hào)中使用的周期性正弦圖案可以用于探測(cè)一個(gè)單模的擴(kuò)散方程，光脫色的圖案可以是一個(gè)更為復(fù)雜的圖形，通常為高斯光斑；另外，本發(fā)明裝置可以更容易地更改干涉條紋的參數(shù)，以在倒易空間直接檢驗(yàn)擴(kuò)散法則的真實(shí)性，該裝置讀取及光脫色同樣的圖案，能夠應(yīng)用于聚合物在界面的擴(kuò)散的研究、dna擴(kuò)散以及電泳等領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合本發(fā)明的圖形進(jìn)一步說(shuō)明：

圖1是本發(fā)明裝置示意圖。

圖中，1.激光器，2.起偏器，3.普克爾盒，4.檢偏器，5.分光器，6.樣品，7.位移臺(tái)，8.平面鏡，9.光纖，10.濾光片，11.光電倍增管，12.鎖相放大器，13.電纜。

具體實(shí)施方式

如圖1是本發(fā)明裝置示意圖，主要包括激光器1、起偏器2、普克爾盒3、檢偏器4、分光器5、樣品6、位移臺(tái)7、平面鏡8、光纖9、濾光片10、光電倍增管11、鎖相放大器12、電纜13，所述平面鏡8位于所述位移臺(tái)7，所述鎖相放大器12通過(guò)電纜13分別連接所述普克爾盒3與所述位移臺(tái)7，所述樣品6表面的光經(jīng)過(guò)所述光纖9以及所述濾光片10傳輸?shù)剿龉怆姳对龉?1中。

所述一種研究分子遷移運(yùn)動(dòng)的方法，步驟為：

一.所述激光器1發(fā)射的激光束經(jīng)過(guò)所述起偏器2、普克爾盒3、檢偏器4后，由所述分光器5分為兩束激光，一束激光經(jīng)過(guò)距離l直接照射于所述樣品6表面，另一束激光經(jīng)過(guò)距離a后到達(dá)所述平面鏡8，經(jīng)過(guò)所述平面鏡8反射后照射于所述樣品6表面，上述照射于所述樣品6表面的兩束激光呈θ角，從而在所述樣品6表面處產(chǎn)生光的干涉圖案；

二.通過(guò)調(diào)節(jié)所述距離a和l的長(zhǎng)度，能夠改變所述角θ的值，從而改變所述樣品6表面干涉條紋間距i；

三.通過(guò)所述普克爾盒3使激光產(chǎn)生一個(gè)小于1秒的極短的滿強(qiáng)度的脈沖，對(duì)亮條紋處的熒光標(biāo)記的相應(yīng)種類的分子進(jìn)行光脫色，在光脫色過(guò)程結(jié)束后，所述激光器1連續(xù)發(fā)射光強(qiáng)為i(r，t)的激光以探測(cè)所述樣品6表面的熒光變化；

四.通過(guò)所述位移臺(tái)7對(duì)所述平面鏡8進(jìn)行位置調(diào)制，使得所述平面鏡8沿其法向方向以頻率800hz進(jìn)行正弦振動(dòng)，從而改變所述樣品6表面處干涉條紋位置；

五.所述光電倍增管11收集光漂白后由于分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)而新出現(xiàn)的熒光信號(hào)，然后通過(guò)所述鎖相放大器12進(jìn)行分析，從而得到所述樣品6表面亮條紋部分與暗條紋部分的熒光強(qiáng)度之比，即平均對(duì)比度c(t)，所述光電倍增管11測(cè)得的熒光信號(hào)f(t)與被熒光標(biāo)記的分子的濃度cm(r，t)和探測(cè)光強(qiáng)i(r，t)相關(guān)其中和是cm(r，t)和i(r，t)的空間傅里葉變換，f(t)可以分解為調(diào)制頻率的諧波級(jí)數(shù)，實(shí)驗(yàn)中，一階和二階的諧波分量f1(t)和f2(t)可以通過(guò)所述鎖相放大器12同時(shí)得到；

六.最終的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)給出暗條紋與亮條紋之間的平均對(duì)比度上式用一個(gè)指數(shù)衰減來(lái)表征布朗擴(kuò)散行為；

七.由能夠求出弛豫時(shí)間τq，由弛豫時(shí)間τq與擴(kuò)散系數(shù)d的關(guān)系q為條紋圖案的空間周期，能夠求出擴(kuò)散系數(shù)d。

所述樣品6表面具有一圓形開口的光掩膜、且其測(cè)量區(qū)域位于所述開口內(nèi)，光掩膜的材料對(duì)光的反射率很小，以能減小由于激光光斑造成的所述樣品6表面非測(cè)量區(qū)域的雜散光對(duì)實(shí)驗(yàn)信噪比的影響；可以使用不同的激光波長(zhǎng)488nm、532nm、633nm等來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并綜合比較各激光波長(zhǎng)條件實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，以能夠更準(zhǔn)確地反映分子的遷移運(yùn)動(dòng)；對(duì)生物大分子樣品，光漂白時(shí)激光光強(qiáng)小于250w/cm²，且脈沖時(shí)間小于400ms。

所述普克爾盒3是一種電光器件，它包含一個(gè)由光通過(guò)的電光晶體，基于普克耳斯效應(yīng)，能夠通過(guò)施加到晶體上的電壓來(lái)調(diào)控光的偏振方向以及改變光通過(guò)晶體后的位相延遲。

由于分子的擴(kuò)散作用，所述對(duì)比度c(t)隨時(shí)間減小，使用同一個(gè)條紋圖案來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行光脫色以及探測(cè)并收集信號(hào)保證了它們由同樣的波長(zhǎng)來(lái)表征。所述鎖相放大器12中探測(cè)的熒光強(qiáng)度的基頻的成分隨時(shí)間改變，并滿足單模的擴(kuò)散方程，且對(duì)比度c(t)按照簡(jiǎn)單的指數(shù)衰減其中弛豫時(shí)間τq與擴(kuò)散系數(shù)d有關(guān)q為條紋圖案的空間周期，這樣，通過(guò)改變q，能夠檢驗(yàn)布朗擴(kuò)散法則并精確地決定運(yùn)動(dòng)分子的擴(kuò)散系數(shù)。常數(shù)c0、c1與運(yùn)動(dòng)分子和不運(yùn)動(dòng)分子之間的相對(duì)分?jǐn)?shù)和有關(guān)。

在含有n種不同運(yùn)動(dòng)種群的復(fù)雜樣品的情況，可以推廣為

第k種種群的擴(kuò)散系數(shù)和分?jǐn)?shù)分別為。