本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及檢測(cè)人血漿中阿托伐他汀及代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
阿托伐他汀(atorvastatin,at)結(jié)構(gòu)式如圖1、圖2、圖3所示,是羥甲戊二酰輔酶a選擇性抑制劑,可以有效降低血脂水平。at在人體內(nèi)主要由細(xì)胞色素p450酶代謝為鄰羥基阿托伐他汀(ortho-hydroxyatorvastatin,o-oat)和對(duì)羥基阿托伐他汀(para-hydroxyatorvastatin,p-oat)。o-oat和p-oat占總體抑制活性的70%。同其他他汀類化合物一樣,at、o-oat和p-oat結(jié)構(gòu)中含有羥基羧酸結(jié)構(gòu),無(wú)論在體內(nèi)和體外均能脫水關(guān)環(huán)形成內(nèi)酯,并且,該體內(nèi)內(nèi)酯代謝物在體外也易于水解轉(zhuǎn)化為羥基羧酸,因而,羥基羧酸濃度測(cè)定易受影響不準(zhǔn)確。
現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定阿托伐他汀及其代謝物,對(duì)準(zhǔn)確度和靈敏度均有要求。為了減弱上述羥基羧酸結(jié)構(gòu)與內(nèi)酯間相互轉(zhuǎn)化,一般需要在生物分析各個(gè)步驟控制溫度和ph值,且樣品預(yù)處理步驟越少,越有利于防止羥基羧酸型代謝物和內(nèi)酯型代謝物相互轉(zhuǎn)化。由于阿托伐他汀鈣人體常用劑量較低,一般僅10mg。服藥后血漿中阿托伐他汀的濃度很低,藥物達(dá)峰濃度為10ng/ml左右。其活性代謝物p-oat濃度更小,通常低于1ng/ml。因此,為了同時(shí)監(jiān)測(cè)阿托伐他汀及其代謝物濃度,對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度要求很高。
目前,提取血漿中藥物的方法主要有蛋白沉淀法、液-液提取法和固相萃取法。蛋白沉淀預(yù)處理法操作較簡(jiǎn)單,也已有報(bào)道將蛋白沉淀預(yù)處理用于測(cè)定at及其代謝物。但實(shí)際操作過程中,蛋白沉淀提取后的樣品中含有內(nèi)源性基質(zhì),容易造成基質(zhì)效應(yīng)等問題。當(dāng)儀器檢測(cè)的靈敏度無(wú)法達(dá)到研究目的時(shí),常常需要濃縮大量血漿,因?yàn)橥敫嗟幕|(zhì)。為防止基質(zhì)在色譜柱上蓄積,一般采用長(zhǎng)時(shí)間梯度洗脫來避免基質(zhì)蓄積,這無(wú)疑極大地降低了分析通量。鑒于蛋白沉淀法的以上缺點(diǎn),已報(bào)道的測(cè)定阿托伐他汀及其代謝物方法中,樣品預(yù)處理方法多為液-液提取法和固相萃取法。然而兩種方法的預(yù)處理步驟比較繁瑣、費(fèi)時(shí)、溫度和ph不易控制,易導(dǎo)致阿托伐他汀及其代謝物的測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。由于上述不足,出現(xiàn)了鹽析輔助液-液提取方法,該法操作簡(jiǎn)單、成本低、樣品純凈,近年來受到廣泛關(guān)注。鹽析是一種結(jié)晶蛋白的常用方法。基于電解質(zhì)-非電解質(zhì)相互作用理論。當(dāng)電解質(zhì)濃度升高時(shí),非電解質(zhì)在水溶液中的溶解度降低。在水溶液中增加電解質(zhì)的濃度即可降低親脂性物質(zhì)在水中的溶解度,將待測(cè)物提取到有機(jī)試劑層中,與水溶性內(nèi)源基質(zhì)分離。但該法普遍存在靈敏度低和血漿用量大的缺點(diǎn)。
現(xiàn)有血漿藥物濃度的儀器檢測(cè)方法有液相色譜-紫外法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。液相色譜-紫外法是藥物濃度檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),但該檢測(cè)技術(shù)具有選擇性差、靈敏度低等特點(diǎn),限制了該技術(shù)在生物樣品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),兼容了色譜的分離能力與質(zhì)譜的高選擇性,已經(jīng)成為生物分析領(lǐng)域的最重要的工具。盡管液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)極大地增強(qiáng)了定量分析能力,但該技術(shù)也同樣存在一些缺點(diǎn),面臨著一些挑戰(zhàn)。如質(zhì)譜中待測(cè)物離子化的過程常被樣品中的生物基質(zhì)所影響,導(dǎo)致響應(yīng)的波動(dòng),影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。相關(guān)報(bào)道如下:
zhou于2013年建立了液-液提取聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血漿中at、o-oat和p-oat。該方法靈敏度較高,可達(dá)20pg/ml左右,但血漿用量較大,為0.5毫升。液-液提取的方法,步驟復(fù)雜且不能有效控制提取體系的ph值,也沒有對(duì)內(nèi)酯和羥基羧酸之間的相互轉(zhuǎn)化做有效的評(píng)估。色譜運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng),需要約6分鐘,不適合大批量樣品測(cè)試。
liu于2008年建立固相萃取-聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血漿中at、p-oat的分析方法。盡管色譜運(yùn)行短,僅為2.5min。血漿用量少,僅0.1毫升。但分析方法的靈敏度不足,p-oat的定量下限僅為0.2ng/ml,無(wú)法完整的檢測(cè)其藥動(dòng)學(xué)特征,且該分析方法不能檢測(cè)o-oat。同時(shí),固相萃取法步驟復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng),同樣不適合大批量樣品檢測(cè)。
hassan于2014建立了salle聯(lián)合液相色譜法測(cè)定人血漿中at。方法中使用了氯化鎂作為鹽析試劑。該氯化鎂為不揮發(fā)性鹽,不適合質(zhì)譜檢測(cè)。該分析方法使用紫外檢測(cè)器,選擇性差,方法的靈敏度很低為1.00ng/ml,并且提取方法使用了1毫升血漿樣品,血漿消耗量過大。靈敏度低和血漿用量大的特點(diǎn)使該方法不適合現(xiàn)有的臨床研究。
有鑒于上述的缺陷,為滿足臨床大批量樣品分析的需求,需開發(fā)更簡(jiǎn)單、可靠、高通量的樣品預(yù)處理方法及血漿藥物濃度測(cè)定方法,用于測(cè)定阿托伐他汀及其代謝物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明的目的是提供一種解決血漿用量大、提取步驟復(fù)雜、提取條件不可控、靈敏度低、色譜運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng),無(wú)法同時(shí)高靈敏及低樣品量檢測(cè)等問題的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法,用于檢測(cè)阿托伐他汀及兩種代謝物。本發(fā)明技術(shù)方案如下:
檢測(cè)人血漿中阿托伐他汀及代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法,含下述步驟:
預(yù)處理,取血漿,加入阿托伐他汀及代謝物同位素內(nèi)標(biāo)溶液,以6m醋酸銨水溶液和乙腈為鹽析分層試劑沉淀蛋白,渦流及離心后制得血漿樣品;
色譜,將血漿樣品液相色譜分離,采用kinetexxbc18柱,梯度洗脫,流動(dòng)相a:流動(dòng)相b初始體積比為60:40,流速0.8ml/min,柱溫40℃,流動(dòng)相a為水,流動(dòng)相b為乙腈;
質(zhì)譜,電噴霧電離源,正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(+mrm)掃描,噴霧電壓5500v,內(nèi)源氣體1(n2)65psi,氣體2(n2)75psi,氣簾氣體(n2)35psi,離子源溫度500℃,阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子[m+h]+m/z559→m/z440,ce22ev,d5-阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子[m+h]+m/z564→m/z445,ce22ev,鄰羥基阿托伐他汀和對(duì)羥基阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子[m+h]+m/z575→m/z440,ce34ev,d5-鄰羥基阿托伐他汀和d5-對(duì)羥基阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子[m+h]+m/z580→m/z445,ce34ev;
計(jì)算,以阿托伐他汀及代謝物濃度為橫坐標(biāo),阿托伐他汀及代謝物與阿托伐他汀及代謝物內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo),回歸制得相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算阿托伐他汀及代謝物的血藥濃度。
本發(fā)明方法進(jìn)一步地,所述預(yù)處理步驟,采用冰凍醋酸銨水溶液和乙腈。
本發(fā)明方法進(jìn)一步地,所述預(yù)處理步驟,內(nèi)標(biāo)溶液配制:稱取d5-阿托伐他汀、d5-鄰羥基阿托伐他汀和d5-對(duì)羥基阿托伐他汀,以甲醇溶解并定容制得1.00mg/ml的內(nèi)標(biāo)貯備液,吸取各內(nèi)標(biāo)貯備液適量,加入稀釋液得濃度10.0ng/ml的d5-阿托伐他汀、d5-鄰羥基阿托伐他汀和d5-對(duì)羥基阿托伐他汀的內(nèi)標(biāo)溶液,所述稀釋液為甲醇和水混合液,甲醇:水的體積比為50:50。
本發(fā)明方法進(jìn)一步地,所述預(yù)處理步驟,取100μl血漿,分別加入20.0μl內(nèi)標(biāo)溶液、100μl6m醋酸銨水溶液和400μl乙腈,渦流及離心后取上清液于氮?dú)饬鞔蹈蓾饪s,殘留物以乙腈和水溶解且渦流混勻得血漿樣品,乙腈:水的體積比為40:60。
本發(fā)明方法更進(jìn)一步地,經(jīng)所述渦流提取血漿樣品的時(shí)間控不超過1min。
本發(fā)明方法更進(jìn)一步地,所述渦流及離心條件為渦流1min,14000rpm離心1min。
本發(fā)明方法進(jìn)一步地,所述色譜步驟,流動(dòng)相a含0.1%甲酸
本發(fā)明方法進(jìn)一步地,所述色譜步驟,將血漿樣品置于自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi),進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析,進(jìn)樣體積為2.0μl。
本發(fā)明方法進(jìn)一步地,所述色譜步驟,所述色譜步驟,kinetexxbc18柱為核殼色譜柱,其長(zhǎng)度50mm、直徑2.1mm、填料粒徑2.6μm。
本發(fā)明目的之二,提供檢測(cè)人血漿中阿托伐他汀及代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法在評(píng)價(jià)阿托伐他汀生物等效性的應(yīng)用,是以d5-阿托伐他汀為分析檢測(cè)阿托伐他汀的內(nèi)標(biāo)物。
借由上述方案,本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn):
①對(duì)樣品預(yù)處理、色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè),建立經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的阿托伐他汀及代謝物檢測(cè)方法,采用本發(fā)明條件的鹽析輔助液-液提取預(yù)處理方法,獲得高回收率且有效降低內(nèi)源性雜質(zhì)峰的干擾,既避免傳統(tǒng)蛋白沉降法通過濃縮大量血漿提高檢測(cè)靈敏度造成的基質(zhì)效應(yīng)擴(kuò)大的缺點(diǎn),也避免傳統(tǒng)液-液提取法和固相萃取預(yù)處理方法的繁瑣和條件不易受控,滿足方法學(xué)的各項(xiàng)考證指標(biāo);
③本發(fā)明以氘代阿托伐他汀及代謝物做內(nèi)標(biāo)物,測(cè)定血液中阿托伐他汀及代謝物濃度的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性均較好;
④專一性選擇性強(qiáng),kinetexxbc18柱,分離度好,色譜僅在2min內(nèi)完成測(cè)定,本發(fā)明條件下的分離過程,內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物兩者的測(cè)定;
⑤靈敏度高,血漿樣品中阿托伐他汀的最低限量可低至0.02ng/ml,阿托伐他汀代謝物的最低限量可低至0.01ng/ml;
⑥檢測(cè)快速,2min左右完成血漿樣品的一次測(cè)定,滿足高通量大批量生物樣品的檢測(cè);
⑦用量小,每次血漿樣品測(cè)試僅需12μl即可準(zhǔn)確測(cè)定出阿托伐他汀及其代謝物的濃度;
⑧本發(fā)明系統(tǒng)的評(píng)估了阿托伐他汀及其內(nèi)酯代謝物之間的相互轉(zhuǎn)化情況,保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性;
⑨采用本發(fā)明建立的lc-ms/ms方法測(cè)定阿托伐他汀血藥濃度,得到阿托伐他汀及其代謝物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù),可用于評(píng)價(jià)阿托伐他汀及其代謝物各劑型的生物等效性。
上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述,為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段,并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施,以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。
附圖說明
圖1是阿托伐他汀(上)、鄰羥基阿托伐他汀(中)、對(duì)羥基阿托伐他汀(下)化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖;
圖2是阿托伐他汀產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖;
圖3是d5-阿托伐他汀產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖;
圖4是鄰羥基阿托伐他汀產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖;
圖5是d5-鄰羥基阿托伐他汀產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖;
圖6是對(duì)羥基阿托伐他汀產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖;
圖7是d5-對(duì)羥基阿托伐他汀產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖;
圖8是阿托伐他汀(上)、鄰羥基阿托伐他汀(中)、對(duì)羥基阿托伐他汀(下)離子反應(yīng)推測(cè)的斷裂方式示意圖;
圖9是空白樣品(左)、lloq樣品(右)阿托伐他汀mrm色譜圖
圖10是空白樣品(左)、lloq樣品(右)d5-阿托伐他汀mrm色譜圖;
圖11是空白樣品(左)、lloq樣品(右)對(duì)羥基阿托伐他汀與鄰羥基阿托伐他汀mrm色譜圖;
圖12是空白樣品(左)、lloq樣品(右)d5-對(duì)羥基阿托伐他汀與d5-鄰羥基阿托伐他汀mrm色譜圖;
圖13是空白含內(nèi)標(biāo)樣品(左)、受試者口服阿托伐他汀鈣片樣品(右)阿托伐他汀mrm色譜圖;
圖14是空白含內(nèi)標(biāo)樣品(左)、受試者口服阿托伐他汀鈣片樣品(右)d5-阿托伐他汀mrm色譜圖;
圖15是空白含內(nèi)標(biāo)樣品(左)、受試者口服阿托伐他汀鈣片樣品(右)對(duì)羥基阿托伐他汀與鄰羥基阿托伐他汀mrm色譜圖;
圖16是空白含內(nèi)標(biāo)樣品(左)、受試者口服阿托伐他汀鈣片樣品(右)d5-對(duì)羥基阿托伐他汀與d5-鄰羥基阿托伐他汀mrm色譜圖;
圖17是24名健康受試者單次口服20mg受試制劑或參比制劑平均藥物濃度-時(shí)間曲線圖。
具體實(shí)施方式
結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖,對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明,本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中,并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等,除以下專門提及的內(nèi)容之外,均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí),本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)血漿中藥物濃度的方法開發(fā)通??煞譃槿齻€(gè)部分,即提取方法(即預(yù)處理方法)、液相色譜方法和質(zhì)譜方法。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn),從以上這三個(gè)方面著手建立檢測(cè)方法。
【預(yù)處理】
取血漿,加入阿托伐他汀及代謝物同位素內(nèi)標(biāo)溶液,以6m醋酸銨水溶液和乙腈為鹽析分層試劑沉淀蛋白,渦流及離心后制得血漿樣品。
本發(fā)明采用上述提取方法,較現(xiàn)有分析方法操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短、適合高通量樣品預(yù)處理。通過使用冰凍乙腈和6m醋酸銨溶液實(shí)現(xiàn)了對(duì)溫度和ph兩個(gè)參數(shù)的控制,防止內(nèi)酯(lactone,lac)和羥基羧酸(carboxylate,car)型相互轉(zhuǎn)化。預(yù)處理步驟制得血漿樣品的時(shí)間控不超過1min,降低了預(yù)處理過程中發(fā)生相互轉(zhuǎn)化的概率,確保測(cè)定準(zhǔn)確性。與傳統(tǒng)蛋白沉淀相比,固相萃取和液-液提取法去除血中蛋白、鹽類、磷脂類等內(nèi)源性物質(zhì)能力強(qiáng),可以獲得比較潔凈的提取物。然而由于操作步驟復(fù)雜、樣品預(yù)處理時(shí)間冗長(zhǎng),car型化合物和lac型化合物容易發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。即使采取低溫或控制ph的方法可以有效降低相互轉(zhuǎn)化,但是在樣品預(yù)處理過程中的每一步都嚴(yán)格控制這些參數(shù)十分困難。因此需要建立步驟簡(jiǎn)單的預(yù)處理方法。
本發(fā)明預(yù)處理方法,提取物潔凈度可以與液-液提取和固相萃取效果相當(dāng),并具有操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。本研究選用乙腈和6m醋酸銨溶液,與質(zhì)譜兼容性好。預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化時(shí),考察了不同濃度的醋酸銨的分層效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)醋酸銨濃度大于6m時(shí),與乙腈的分層清晰可見?,F(xiàn)有技術(shù)中,at的lac與car型相互轉(zhuǎn)化受ph影響較大,酸性條件下易于環(huán)合為lac,堿性條件下水解開環(huán)。本發(fā)明使用的6m醋酸銨溶液ph為6,可以有效抑制相互轉(zhuǎn)化的發(fā)生。并且,采用冰凍醋酸銨水溶液和乙腈,即乙腈和6m醋酸銨溶液在使用前置于冰浴中,可以降低提取過程溫度。為了降低提取時(shí)間,提高樣品預(yù)處理通量,對(duì)渦流提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取回收率在1min內(nèi)達(dá)到峰值,回收率大于80%。
【色譜】
將血漿樣品液相色譜分離,采用kinetexxbc18柱,梯度洗脫,流動(dòng)相a:流動(dòng)相b初始體積比為60:40,流速0.8ml/min,柱溫40℃,流動(dòng)相a為水,流動(dòng)相b為乙腈。
o-oat和p-oat是同分異構(gòu)體,并且有相同的質(zhì)譜裂解方式。因此,為了避免相互干擾,需要將兩種物質(zhì)色譜分離。o-oat結(jié)構(gòu)中鄰羥基和胺基之間可形成分子內(nèi)氫鍵,因此極性較p-oat低,易于色譜分離?,F(xiàn)有技術(shù)常采用c18為鍵合相的色譜柱進(jìn)行分離,色譜運(yùn)行時(shí)間在2.5到20分鐘之間。
本發(fā)明采kinetexxbc18熔融核色譜柱,具有高柱效、高通量、低背景壓力的特點(diǎn)。在方法開發(fā)過程中出現(xiàn)嚴(yán)重的色譜峰拖尾現(xiàn)象,通過在水相中添加1%甲酸的方法可以減輕拖尾,從而提高峰高和峰對(duì)稱性。使用了高流速,如0.8ml/min的快速洗脫程序,總的色譜運(yùn)行時(shí)間僅為2.2min,快速分離,尤其適合高通量樣品處理,試驗(yàn)證明,本發(fā)明o-oat和p-oat獲得基線分離。
本發(fā)明渦流及離心條件優(yōu)選為渦流1min,14000rpm離心1min。優(yōu)選流動(dòng)相a含0.1%甲酸。將血漿樣品置于自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi),進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析時(shí),進(jìn)樣體積僅為2.0μl即可。本發(fā)明采用的kinetexxbc18柱為核殼色譜柱,其長(zhǎng)度50mm、直徑2.1mm、填料2.6μm。
【質(zhì)譜】
電噴霧電離源,正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(+mrm)掃描,噴霧電壓5500v,內(nèi)源氣體1(n2)65psi,氣體2(n2)75psi,氣簾氣體(n2)35psi,離子源溫度500℃,阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子[m+h]+m/z559→m/z440,ce22ev,d5-阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子[m+h]+m/z564→m/z445,ce22ev。圖2至圖7為定量分析at和d5-at時(shí)監(jiān)測(cè)的離子。如圖2所示為阿托伐他汀正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(+mrm)掃描質(zhì)譜圖,圖3所示為d5-阿托伐他汀正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(+mrm)掃描質(zhì)譜圖,圖4所示為鄰羥基阿托伐他汀正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(+mrm)掃描質(zhì)譜圖,圖5所示為d5-鄰羥基阿托伐他汀正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(+mrm)掃描質(zhì)譜圖,圖6所示為對(duì)羥基阿托伐他汀正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(+mrm)掃描質(zhì)譜圖,圖7所示為d5-對(duì)羥基阿托伐他汀正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(+mrm)掃描質(zhì)譜圖。
鄰羥基阿托伐他汀和對(duì)羥基阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子[m+h]+m/z575→m/z440,ce34ev,d5-鄰羥基阿托伐他汀和d5-對(duì)羥基阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子[m+h]+m/z580→m/z445,ce34ev,圖8是at(上)、o-oat(中)、p-oat(下)離子反應(yīng)推測(cè)的斷裂方式示意圖,反映at、o-oat、p-oat以及同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜斷裂方式,“*”號(hào)為氘代位點(diǎn)。
實(shí)施例:
【縮寫說明】
1材料
1.1儀器
色譜儀:lc-30ad快速液相色譜系統(tǒng),日本島津公司。
質(zhì)譜儀:6500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧電離源(turboionspray),加拿大sciex公司。
數(shù)據(jù)處理采用軟件:analyst(version1.6.2),加拿大sciex公司。
離心機(jī):ct15re型離心機(jī),日本hitachi公司。
分析天平:cd225d型分析天平,北京賽多利斯儀器有限公司。
1.2對(duì)照品和試劑
阿托伐他汀鈣(純度,96%)和d5-阿托伐他汀鈣鹽(純度,98%)購(gòu)自加拿大torontoresearchchemicals公司。
鄰羥基化阿托伐他汀(純度,98.5%)、對(duì)羥基化阿托伐他汀(純度,98%)、d5-鄰羥基化阿托伐他汀(純度,99.2%)和d5-對(duì)羥基化阿托伐他汀(純度,99.2%)購(gòu)自加拿大tlc公司。
甲醇、乙腈、醋酸銨(hplc級(jí))購(gòu)自美國(guó)sigma公司。
去離子水(18.2mω,toc≤50ppb)由法國(guó)milli-q超純水系統(tǒng)制備。
2方法
2.1溶液及樣品的配制
【標(biāo)準(zhǔn)系列樣品】精密稱取各對(duì)照品適量,以甲醇分別溶解并定容,配制成at、o-oat和p-oat濃度約為1.00mg/ml的貯備液。精密吸取各自貯備液適量,以人空白血漿逐級(jí)稀釋得到混合標(biāo)準(zhǔn)系列樣品,at、o-oat和p-oat濃度范圍分別為0.0200~15.0、0.0200~15.0和0.0100~2.00ng/ml。
【質(zhì)控樣品】采用與標(biāo)準(zhǔn)系列樣品相似方法配制at、o-oat和p-oat四個(gè)濃度水平混合質(zhì)控樣品。lloq濃度為0.0200/0.0200/0.0100ng/ml,lqc濃度為0.0500/0.0500/0.0200ng/ml,mqc濃度為1.00/1.00/0.200ng/ml,mqc濃度為12.0/12.0/1.60ng/ml。
【內(nèi)標(biāo)溶液】精密稱取各內(nèi)標(biāo)對(duì)照品,即d5-at、d5-o-oat和d5-p-oat。以甲醇溶解并定容,配制成d5-at、d5-o-oat和d5-p-oat濃度均約為1.00mg/ml的內(nèi)標(biāo)貯備液。精密吸取上述各內(nèi)標(biāo)貯備液適量,加甲醇:水(50:50,v/v)稀釋,獲得d5-at、d5-o-oat和d5-p-oat濃度均為10.0ng/ml的混合內(nèi)標(biāo)溶液。
2.2血漿樣品處理
取100μl血漿,分別加入20.0μl內(nèi)標(biāo)溶液、100μl6m醋酸銨水溶液和400μl乙腈。渦流1min,離心1min(14000g),全取上清液于氮?dú)饬鞔蹈蓾饪s。殘留物以乙腈:水(40:60,v/v)溶解,渦流混勻,置于自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi),進(jìn)行l(wèi)c-ms-ms分析,進(jìn)樣體積為12.0μl。
2.3色譜及質(zhì)譜條件
【色譜條件】
色譜柱:kinetexxbc18(50mm×2.1mmi.d,2.6μm)。
流動(dòng)相a:水,含1%甲酸。
流動(dòng)相b:乙腈。
梯度程序洗脫:
柱溫:40℃。
流速:0.8ml·min-1。
【質(zhì)譜條件】
電噴霧電離源(turboionspray)。
電壓為5500v。
離子源溫度為500℃;
內(nèi)源氣體1(n2)65psi,氣體2(n2)75psi,氣簾氣體(n2)35psi。
掃描模式為正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(+mrm)掃描。
監(jiān)測(cè)離子反應(yīng)分別為:
at,m/z559→m/z440,碰撞能量(collisionenergy,ce)22ev;
d5-at,m/z564→m/z445,ce22ev;
o/p-oat,m/z575→m/z440,ce34ev;
d5-o/p-oat,m/z580→m/z445,ce34ev。
2.4方法學(xué)驗(yàn)證
按照美國(guó)fda指導(dǎo)原則對(duì)本方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,內(nèi)容包括穩(wěn)定性、選擇性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、回收率基質(zhì)效應(yīng)。
【選擇性】
取六個(gè)來源不同的空白血漿及各自配制的lloq樣品處理后進(jìn)樣分析。色譜共流出干擾物的峰面積須小于lloq待測(cè)物峰面積的1/5,小于內(nèi)標(biāo)峰面積的1/20。
【標(biāo)準(zhǔn)曲線】
以待測(cè)物理論濃度為橫坐標(biāo)(x),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)(y),進(jìn)行回歸分析計(jì)算的直線回歸方程(權(quán)重因子w=1/x2)。方法驗(yàn)證每一分析批對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品雙樣本分析。
【準(zhǔn)確度和精密度】
方法驗(yàn)證每一分析批測(cè)定四濃度質(zhì)控樣本各六樣本。lloq日內(nèi)、日間精密度以rsd計(jì)算小于20%方可接受。準(zhǔn)確度以re在20%~20%之間方可接受。其余各濃度水平的qc樣品各成分日內(nèi)、日間精密度需小于15%方可接受,準(zhǔn)確度在15%~15%之間方可接受。
【穩(wěn)定性】
考察各待測(cè)物在血漿樣品中的穩(wěn)定性時(shí),將lqc和hqc置于不同溫度及環(huán)境中,放置結(jié)束后進(jìn)行三樣本分析。共考察四種放置條件,分別為:冰水浴放置6h,提取后進(jìn)樣器內(nèi)放置24h,經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)(從75±10℃到冰水浴),75±5℃放置97天。
【回收率】
取空白血漿100μl(n=9),提取后(不加內(nèi)標(biāo)溶液)取全部乙腈層液體分別加入和lqc、mqc和hqc相同濃度的待測(cè)物溶液和內(nèi)標(biāo)溶液,渦流混合后測(cè)定。另提取lqc、mqc和hqc各6份,進(jìn)樣測(cè)定。以2種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。
【基質(zhì)效應(yīng)】
取不同來源空白血漿(n=6),提取后(不加內(nèi)標(biāo)溶液),取全部乙腈層液體加入和lqc和hqc相同濃度的待測(cè)物溶液和內(nèi)標(biāo)溶液,渦流混合后測(cè)定。另取去離子水代替血漿,按上述方法處理。以兩種方法獲得的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)因子,通過基質(zhì)因子的rsd評(píng)估基質(zhì)效應(yīng),基質(zhì)因子小于15%方可接受。
2.5阿托伐他汀內(nèi)酯(lac)和羥基羧酸(car)型結(jié)構(gòu)相互轉(zhuǎn)化評(píng)估
樣品吹干濃縮過程中以及提取后樣品放置過程中,可能存在lac和car型相互轉(zhuǎn)化,影響濃度測(cè)定準(zhǔn)確性。由于沒有待測(cè)物lac結(jié)構(gòu)的對(duì)照品,采用受試者的混合血漿樣品,評(píng)估這一影響。合并同一時(shí)間點(diǎn)三名受試者血漿樣品,編碼為1到16。
【吹干的影響】
使用本發(fā)明預(yù)處理方法提取以上樣品。將100μl上層乙腈置于96孔板內(nèi)吹干濃縮,殘留物以250μl乙腈:水(40:60,v/v)溶解,編號(hào)為set(a)。另取100μl上層乙腈,加入150μl去離子水,編號(hào)為set(b)。將兩套樣品進(jìn)樣分析,評(píng)估吹干對(duì)濃度測(cè)定的影響。
【預(yù)處理后放置過程的影響】
采用預(yù)處理后放置24h再分析的方法評(píng)估放置過程對(duì)濃度測(cè)定的影響。將1-16號(hào)樣品按照“2.2血漿樣品處理”方法提取后分析。該樣品于分析后置于自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)(4℃)24h后再次分析。比較兩次測(cè)定濃度,評(píng)估預(yù)處理后放置過程對(duì)濃度測(cè)定的影響。
2.6生物等效性研究
應(yīng)用建立的定量分析方法測(cè)定血漿中at及代謝物的濃度,用于評(píng)價(jià)阿托伐他汀鈣片人體生物等效性。24名健康受試者隨機(jī)分成兩組,分別給予20mg阿托伐他汀片的參比制劑和受試制劑。8天清洗期后將參比制劑組與受試制劑組交換。于給藥前(0h)、給藥后0.17h、0.33h、0.5h、0.75h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h、4.0h、6.0h、8.0h、12h、16h、24h、36h、48h和72h,靜脈取血2~3ml,置肝素抗凝離心管中,離心(2000g,4℃)10min后分離血清,75±10℃保存
3結(jié)果與討論
3.1方法學(xué)驗(yàn)證
【方法的選擇性】
圖9至圖16所示為測(cè)定人血漿中at、o-oat、p-oat及內(nèi)標(biāo)典型mrm色譜圖,峰i、ii、iii、iv、v、vi分別為at、d5-at、o-oat、p-oat、d5-o-oat、d5-p-oat。at、o-oat和p-oat保留時(shí)間分別約為1.4、0.5、1.3min,保留時(shí)間附近未見共流出干擾峰。
【標(biāo)準(zhǔn)曲線】
本發(fā)明以at及代謝物濃度為橫坐標(biāo),at及代謝物內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo),回歸制得相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算at及代謝物的血藥濃度。測(cè)定人血漿中at和o-oat線性范圍均為0.0200~15.0ng/ml;p-oat線性范圍為0.0100~2.00ng/ml。待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)曲線直線平均回歸方程(n=3x2)分別為:
at:y=(0.461±0.042)x+(0.000335±0.000745)(r=0.9986±0.0005),
o-oat:y=(0.649±0.060)x-(0.000014±0.000734)(r=0.9983±0.0011),
p-oat:y=(0.404±0.031)x-(0.000534±0.000218)(r=0.9986±0.0003)。
【方法的精密度與準(zhǔn)確度】
各成分lloq日間精密度均不大于9.2%,日內(nèi)精密度均不大于11.7%。如表1所示,準(zhǔn)確度在0.3~9.6%范圍內(nèi)。各成分其余濃度qc樣品日內(nèi)精密度均不大于9.2%,日間精密度均不大于8.3%,同樣如表1所示準(zhǔn)確度在.7~2.7%范圍內(nèi)。
表1人血漿中at、o-oat、p-oat精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)定
【處理回收率】
lqc、mqc和hqc濃度水平:at的提取回收率分別為81.1%、94.0%和88.7%;o-oat的提取回收率分別為85.8%、89.0%和85.6%;p-oat的提取回收率分別為95.7%、89.9%和102%。d5-at、d5-o-oat和d5-p-oat的回收率分別為89.4%、87.7%和94.9%。
【基質(zhì)效應(yīng)】
lqc、hqc濃度水平下at的基質(zhì)因子分別為100%和94.1%,rsd分別為4.0%和4.7%;d5-at的基質(zhì)因子為99.7%,rsd為3.8%;o-oat基質(zhì)因子分別為101%和93.0%,rsd分別為4.8%和7.3%;d5-o-oat的基質(zhì)因子為99.5%,rsd為4.3%;p-oat基質(zhì)因子分別為95.3%和94.4%,rsd為4.3%和4.6%;d5-p-oat的基質(zhì)因子為104%,rsd為4.3%。以上結(jié)果表明,基質(zhì)不干擾待測(cè)物定量分析。
【血漿穩(wěn)定性考察】
如表2所示,為血漿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。at血漿樣品穩(wěn)定性樣品測(cè)定濃度的rsd范圍為0.6~6.7%,re為2.0~8.8%之間。o-oat血漿樣品穩(wěn)定性樣品測(cè)定濃度的rsd范圍為1.0~9.0%,re為4.5~8.9%之間。p-oat血漿樣品穩(wěn)定性樣品測(cè)定濃度的rsd范圍為2.0~8.9%,re為8.2~9.8%之間。結(jié)果表明在上述條件下at、o-oat和p-oat均穩(wěn)定。
表2at、o-oat、和p-oat在人血漿中的穩(wěn)定性(n=3)
3.2lac和car型相互轉(zhuǎn)化考察
溫度、ph的影響:本發(fā)明考察了at及代謝物的car和lac型化合物在不同溫度、ph環(huán)境中的相互轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示在室溫放置條件下血漿中l(wèi)ac型容易轉(zhuǎn)化為car型。通過降低血漿溫度(4℃)或者調(diào)節(jié)ph低于6的方法,可以抑制轉(zhuǎn)化的發(fā)生。
吹干方法的影響:盡管已有報(bào)道使用吹干的方法濃縮樣品,但目前為止,未見文獻(xiàn)考察該過程對(duì)待測(cè)物穩(wěn)定性的影響。本研究中,我們考察了吹干過程對(duì)相互轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果見表3,所示吹干前與吹干后的測(cè)定值偏差在-7.7~13.1%范圍內(nèi)。吹干過程不影響car型待測(cè)物測(cè)濃度測(cè)定。
表3混合血漿樣品經(jīng)吹干與不吹干處理后各待測(cè)物測(cè)定濃度對(duì)比
提取物復(fù)溶解及進(jìn)樣過程的影響:本發(fā)明考察了提取物復(fù)溶解后置于進(jìn)樣器內(nèi)(4℃)是否發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化。結(jié)果同樣如表3所示,放置24h以后重新測(cè)定值于原值之間變異在-6.3%~10.7%范圍內(nèi),見表4。因此,盡管未將復(fù)溶劑的ph調(diào)節(jié)至低于6,lac型沒有水解開環(huán)生成car型代謝物。
表4混合血漿樣品經(jīng)吹干與不吹干處理后各待測(cè)物測(cè)定濃度對(duì)比
4人體生物等效性研究
提供檢測(cè)人血漿中阿托伐他汀及代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法在評(píng)價(jià)阿托伐他汀生物等效性的應(yīng)用,是以d5-阿托伐他汀為分析檢測(cè)阿托伐他汀的內(nèi)標(biāo)物。將驗(yàn)證后的方法用于同時(shí)定量檢測(cè)血漿中at、o-oat和p-oat,以評(píng)價(jià)阿托伐他汀鈣片的生物等效性。24名健康受試者單次口服10mg受試制劑阿托伐他汀鈣(中國(guó)某制藥公司)或者參比制劑