本發(fā)明屬于細(xì)胞膜電信號(hào)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無損檢測方法。

背景技術(shù)：

生物膜中脂質(zhì)排列成雙分子層，在膜中每個(gè)類脂分子均可橫向運(yùn)動(dòng)，也可以發(fā)生轉(zhuǎn)動(dòng)和連接的活動(dòng)，使得生物膜具有柔韌性、流動(dòng)性、高電阻性以及對(duì)高分子的不透過性。脂類包括磷酸甘油酯(即磷脂)、鞘脂類和類固醇，這些成分的有序排列及相互作用，形成了細(xì)胞膜特定的結(jié)構(gòu)與生物功能。脂質(zhì)均由一疏水部分和極性端基構(gòu)成，磷脂或羧酸酯的極性端基間常能形成氫鍵，大多數(shù)脂質(zhì)的疏水部分為兩個(gè)脂肪族雙鏈。生物膜表面帶電主要原因是組成生物膜的磷脂或生物大分子)帶有帶電官能團(tuán)（如多肽鏈的羧基末端和氨基末端）；致使生物膜內(nèi)外側(cè)的電荷不致具有一定的電位。

膜電位對(duì)細(xì)胞的生長、增殖以及酶活性等至關(guān)重要，導(dǎo)致細(xì)胞生長和分化異常、細(xì)胞功能紊亂。一些具有帶電性的蛋白質(zhì)甚至dna鏈也會(huì)在膜上的特定微區(qū)-“脂筏”。脂筏組裝體是鞘磷脂緊密有序的排列，鞘磷脂所含長鏈飽和脂肪鏈，相變溫度差，脂肪鏈流動(dòng)性差，導(dǎo)致混合膜發(fā)生相分離。以脂雙層分子的疏水端為界，生物膜可分為近胞質(zhì)面和非胞質(zhì)面內(nèi)外兩層，使生物膜具有不對(duì)稱性。同時(shí)膜脂、膜蛋白和復(fù)合糖在膜上均呈不對(duì)稱分布，導(dǎo)致膜具有不對(duì)稱性和方向性，從而使膜內(nèi)外兩層的流動(dòng)性不同，使物質(zhì)傳遞有一定方向，信號(hào)的接受和傳遞也有一定的方向性。

生物親脂性的染料分子在膜的取向，顯示膜周圍的物理和化學(xué)性質(zhì)。偶極是一個(gè)內(nèi)部潛在生物膜膜脂質(zhì)和水分子的界面的由于非隨機(jī)生成和電偶極的取向。根據(jù)細(xì)胞膜的成分不同，偶極在為200-1000mv范圍中，偶極可能影響膜蛋白和多肽等na⁺/k⁺atpase和離子通道。

細(xì)胞膜內(nèi)外具有不同的電位，常用膜邊鑷來測定細(xì)胞膜的電極電位，此方法對(duì)顯微觀察設(shè)備、實(shí)驗(yàn)操作精確度要求比較高，主要采用探針尖端刺入被測細(xì)胞中，同時(shí)容易對(duì)細(xì)胞造成損傷。探針di-8-anepps穩(wěn)定熒光發(fā)光基團(tuán)位于膜表面距離中心近200um,電荷轉(zhuǎn)移熒光光譜變化與熒光探針di-8-anepps電場強(qiáng)度相關(guān)，通過外加電場的改變來調(diào)控細(xì)胞膜的膜電位響應(yīng)情況，結(jié)合雙波長熒光比率計(jì)算方法，用熒光探針標(biāo)記細(xì)胞膜測定膜電位的變化，利用電場導(dǎo)致di-8-anepps改變熒光強(qiáng)度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無損檢測的技術(shù)方案。該方法通過采用膜電位敏感熒光探針di-8-anepps標(biāo)記細(xì)胞膜，采用微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化，通過熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱反映了細(xì)胞膜電位的變化，且不影響細(xì)胞壽命。

所述的一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無損檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）以di-8-anepps為熒光染料標(biāo)記細(xì)胞膜；

（2）通過脈沖發(fā)生器調(diào)節(jié)電場變化，使細(xì)胞熒光強(qiáng)度與外加電場成線性相關(guān)；

（3）通過微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化；

（4）測定di-8-anepps標(biāo)記細(xì)胞膜的熒光強(qiáng)度變化，并通過細(xì)胞熒光強(qiáng)度與外加電場之間的線性方程，得到細(xì)胞膜在微囊泡誘導(dǎo)下電位變化。

所述的一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無損檢測方法，其特征在于所述的步驟（2）中外加電場強(qiáng)度為100-500mv。

所述的一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無損檢測方法，其特征在于所述的步驟（3）中微囊泡為脂肪酸和磷酸自組裝形成的微囊泡。

上述的一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無損檢測方法，設(shè)計(jì)合理，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：

1、本發(fā)明提供了一種以本發(fā)明通過熒光顯微鏡觀察di-8-anepps標(biāo)記的細(xì)胞膜熒光強(qiáng)度的變化，可以有效、連續(xù)測定細(xì)胞的膜電位變化。

2、本發(fā)明最大的特點(diǎn)在于對(duì)被測細(xì)胞沒有損傷，實(shí)現(xiàn)無損、精確測量，快捷、動(dòng)態(tài)地反應(yīng)出細(xì)胞膜隨環(huán)境變化引起的膜電位極化變化趨勢，可以有效反映出微囊泡與細(xì)胞相互作用引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生理變化。

3、本發(fā)明利用自組裝形成微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化。

4、本發(fā)明為在靜電引力、范德華力和氫鍵作用，導(dǎo)致細(xì)胞表面電荷密度的改變，誘導(dǎo)膜中蛋白質(zhì)等其他分子的構(gòu)象變化引起膜電位變化的無損檢測提供有效方法。

附圖說明

圖1為進(jìn)行微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位無損檢測方法的裝置圖；

圖2為實(shí)施例2中熒光強(qiáng)度與細(xì)胞膜電位之間的關(guān)系圖；

圖3為實(shí)施例3中熒光輕度與外加電場成線性相關(guān)圖；

圖4為實(shí)施例4中不同鏈長不同濃度脂肪酸對(duì)iec-6細(xì)胞膜電位熒光強(qiáng)度影響圖；

圖5為實(shí)施例5中不同鏈長磷酸（cn=6，7，8）對(duì)iec-6細(xì)胞膜電位熒光強(qiáng)度影響圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。

實(shí)施例1：一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位無損檢測方法，包括以下步驟：

（1）以di-8-anepps為熒光染料標(biāo)記細(xì)胞膜；

（2）通過脈沖發(fā)生器調(diào)節(jié)電場變化（100-500mv），使細(xì)胞熒光強(qiáng)度與外加電場成線性相關(guān)；

（3）通過微囊泡（脂肪酸和磷酸自組裝形成的微囊泡，如鏈長為c4-c9的脂肪酸，鏈長為c4-c8的磷酸）誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化；

（4）測定di-8-anepps標(biāo)記細(xì)胞膜的熒光強(qiáng)度變化，并通過細(xì)胞熒光強(qiáng)度與外加電場之間的線性方程，得到細(xì)胞膜在微囊泡誘導(dǎo)下電位變化。

本發(fā)明用到的試驗(yàn)裝置如圖1所示，包括了pc、外加電場裝置、顯微鏡等。

實(shí)施例2

采用膜電位染料di-8-anepps測定iec-6膜電位的變化，di-8-anepps是一種對(duì)膜電位高度敏感的染色劑，能特異性地分布在細(xì)胞膜表面，使細(xì)胞膜呈現(xiàn)熒光，電位的高低將變化di-8-anepps的熒光強(qiáng)度分布濃度。電位高，di-8-anepps熒光顯色為紅色或桔紅色；反之則為黃色，熒光強(qiáng)度之比降低則意味著iec-6細(xì)胞膜電位的降低，如圖2所示。

實(shí)施例3

經(jīng)過di-8-anepps膜熒光染料標(biāo)記的iec-6細(xì)胞，在外加電場作用（100-500mv）對(duì)iec-6細(xì)胞表面膜電位的影響，采用leica倒置熒光顯微鏡進(jìn)行成像觀察，leica分析軟件采用分析圖像，獲得iec-6細(xì)胞表面膜電位定量曲線；從iec-6細(xì)胞表面膜電位的變化來看，iec-6細(xì)胞表面膜電位與外加電場成線性相關(guān)，隨著外加電場的不斷增加，iec-6細(xì)胞表面膜熒光強(qiáng)度不斷減小，如圖3所示。

實(shí)施例4

由于不同鏈長脂肪酸會(huì)形成自組裝，脂肪酸親水頭基的電荷作用將改變iec-6細(xì)胞膜偶極，引起膜電位的變化。通過對(duì)不同脂肪酸在不同濃度值對(duì)iec-6細(xì)胞膜電位變化的影響，測得熒光光譜數(shù)據(jù)，不同鏈長脂肪酸不同濃度引起膜染料熒光強(qiáng)度的變化，反應(yīng)了細(xì)胞膜電位的變化，如圖4所示。

實(shí)施例5

由于不同鏈長磷酸會(huì)形成自組裝，磷酸親水頭基的電荷作用將改變iec-6細(xì)胞膜偶極，引起膜電位的變化。通過對(duì)不同鏈長磷酸對(duì)iec-6細(xì)胞膜電位變化的影響，測得熒光光譜數(shù)據(jù)，不同鏈長磷酸引起膜染料熒光強(qiáng)度的變化，反應(yīng)了細(xì)胞膜電位的變化，如圖5所示。