本發(fā)明涉及一種整體蛋白質(zhì)分子的定量方法，尤其是涉及一種基于全準(zhǔn)同重二乙基標(biāo)記的蛋白質(zhì)定量方法，屬于與生物質(zhì)譜相關(guān)的系統(tǒng)生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等
技術(shù)領(lǐng)域：
：。
背景技術(shù)：
：：近幾年來(lái)，帶高效解離模式的高質(zhì)量測(cè)量精度、高質(zhì)量分辨質(zhì)譜儀(如軌道阱質(zhì)譜儀)得到了快速發(fā)展和普及；這使得蛋白質(zhì)的質(zhì)譜的串級(jí)質(zhì)譜分析和高可信度定性鑒定成為了可能。不同生理或病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)研究和分析同時(shí)需要準(zhǔn)確度高的定量方法。同位素標(biāo)記定量，因?yàn)槟苡杏行Э朔椒ê拖到y(tǒng)誤差，一般比非標(biāo)定量要準(zhǔn)確。在同位素標(biāo)記中，通常有同位素、同重和準(zhǔn)同重三種模式；準(zhǔn)同重模式因?yàn)槭褂貌煌赝凰貥?biāo)記的、質(zhì)量?jī)H有細(xì)微差異(mda)的同一個(gè)碎片離子的相對(duì)峰強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)定量，不僅能最大限度地克服方法和系統(tǒng)誤差，而且能有效同重模式下來(lái)自共囚禁前體離子的干擾?；趕ilac的體內(nèi)同位素標(biāo)記1-3和基于tmt的體外同重標(biāo)記4，由于靶向氨基酸的非完全標(biāo)記(如重的賴氨酸或精氨酸在silac中的非完全替代)和非靶向氨基酸的非選擇性標(biāo)記(如蘇氨酸的tmt標(biāo)記)，其應(yīng)用范圍受到了比較大的限制。二甲基(同位素、同重、準(zhǔn)同重)標(biāo)記由于其試劑易得，標(biāo)記效率高，在蛋白質(zhì)和多肽定量方面得到了廣泛的研究和應(yīng)用。我國(guó)科學(xué)家在這個(gè)定量技術(shù)方面也做出了巨大的貢獻(xiàn)，發(fā)展了多種不同形式的二甲基標(biāo)記5-8；其中申請(qǐng)人首次將全準(zhǔn)同重二甲基標(biāo)記(universalpseudo-isobaricdimethylation)引入到完整蛋白質(zhì)的定量分析，n端氨基酸上的氨基和賴氨酸殘基上的氨基的“一鍋式”全標(biāo)記有效避開了后者的額外預(yù)保護(hù)及其相關(guān)副反應(yīng)，大大提高了定量分析的效率和準(zhǔn)確度8。申請(qǐng)人自己開發(fā)的完整蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索引擎proteingoggle(http://proteingoggle.#edu.cn/)9-11能自動(dòng)將二甲基基團(tuán)作為動(dòng)態(tài)修飾加到任意位置的賴氨酸上，從而使得全標(biāo)記成為可能。proteingoggle是基于申請(qǐng)人發(fā)明的同位素輪廓指紋比對(duì)算法(isotopicenvelopefingerprinting,ief)12開發(fā)的；ief算法直接在原始數(shù)據(jù)上進(jìn)行匹配離子的搜索和蛋白質(zhì)的鑒定。該算法無(wú)需對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行“去同位素”預(yù)處理，可以節(jié)省相應(yīng)的時(shí)間；根據(jù)各個(gè)離子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相對(duì)強(qiáng)度的偏差對(duì)理想及非理想實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行很好的區(qū)分，保證蛋白鑒定的可信度；根據(jù)已知重疊離子的同位素峰相對(duì)強(qiáng)度關(guān)系對(duì)重疊實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的解析。基于該算法申請(qǐng)人成功地開發(fā)了整體蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)搜索引擎proteingoggle，在單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白(泛素、肌紅蛋白)及整體蛋白質(zhì)組混合物(組蛋白h4家族翻譯后修飾異構(gòu)體、大腸桿菌)的定性鑒定中，表現(xiàn)出較高的可信度和較好的應(yīng)用前景。在定量分析方面，proteingoggle有著它內(nèi)在的和獨(dú)特的潛在優(yōu)勢(shì)；一方面基于同位素輪廓及其中每個(gè)同位素的指紋比對(duì)可以快速精確地搜索同位素或同重標(biāo)記的定量離子對(duì)；另一方面，搜索過(guò)程中每個(gè)離子中每個(gè)同位素峰的實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度都被記錄和輸出，可以用來(lái)直接計(jì)算相對(duì)定量比。在準(zhǔn)同重二甲基標(biāo)記定量中，n端第一個(gè)氨基酸的a1離子因?yàn)榉鍙?qiáng)度高而通常用作定量的碎片離子。加上二甲基基團(tuán)的28da，a1離子的質(zhì)荷比范圍在58-187da之間；a1離子是二級(jí)質(zhì)譜中最小的碎片離子。為了保證較好的檢測(cè)a1，一般要設(shè)定一個(gè)比a1離子小一些(比如10da)的二級(jí)質(zhì)譜最低檢測(cè)質(zhì)量。由于離子阱只能對(duì)最低檢測(cè)質(zhì)量15倍以內(nèi)的碎片離子進(jìn)行很好的囚禁，這使得碎片離子的檢測(cè)范圍比通常使用的2000要小得多；也就是說(shuō)，最低質(zhì)量端的a1離子的檢測(cè)使得高質(zhì)量端的離子得不到很好的囚禁和檢測(cè)，從而對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定產(chǎn)生較大的影響。參考文獻(xiàn)1waanders,l.f.,hanke,s.&mann,m.top-downquantitationandcharacterizationofsilac-labeledproteins.journaloftheamericansocietyformassspectrometry18,2058-2064,doi:10.1016/j.jasms.2007.09.001(2007).2collier,t.s.,hawkridge,a.m.,georgianna,d.r.,payne,g.a.&muddiman,d.c.top-downidentificationandquantificationofstableisotopelabeledproteinsfromaspergillusflavususingonlinenano-flowreversed-phaseliquidchromatographycoupledtoaltq-fticrmassspectrometer.analyticalchemistry80,4994-5001,doi:10.1021/ac800254z(2008).3collier,t.s.&muddiman,d.c.analyticalstrategiesfortheglobalquantificationofintactproteins.aminoacids43,1109-1117,doi:10.1007/s00726-012-1285-z(2012).4hung,c.w.&tholey,a.tandemmasstagproteinlabelingfortop-downidentificationandquantification.analyticalchemistry84,161-170,doi:10.1021/ac202243r(2012).5zhou,y.etal.massdefect-basedpseudo-isobaricdimethyllabelingforproteomequantification.analyticalchemistry85,10658-10663,doi:10.1021/ac402834w(2013).6wu,y.etal.five-plexisotopedimethyllabelingforquantitativeproteomics.chemcommun(camb)50,1708-1710,doi:10.1039/c3cc47998f(2014).7yang,s.j.etal.anovelquantitativeproteomicsworkflowbyisobaricterminallabeling.journalofproteomics75,5797-5806,doi:10.1016/j.jprot.2012.07.011(2012).8fang,h.q.etal.intactproteinquantitationusingpseudoisobaricdimethyllabeling.analyticalchemistry88,7198-7205,doi:10.1021/acs.analchem.6b01388(2016).9xiao,k.j.,yu,f.&tian,z.x.top-downproteinidentificationusingisotopicenvelopefingerprinting.journalofproteomics152,41-47,doi:10.1016/j.jprot.2016.10.010(2017).10xiao,k.j.etal.accurateandefficientresolutionofoverlappingisotopicenvelopesinproteintandemmassspectra.scirep-uk5,doi:artn1475510.1038/srep14755(2015).11li,l.&tian,z.x.interpretingrawbiologicalmassspectrausingisotopicmass-to-chargeratioandenvelopefingerprinting.rapidcommunmasssp27,1267-1277,doi:10.1002/rcm.6565(2013).12肖開捷，沈赟，王悅，田志新。一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾定位的方法。申請(qǐng)?zhí)枺?01510197719.3，申請(qǐng)日期：04/21/2015；申請(qǐng)公布號(hào)：cn104820011a，申請(qǐng)公布日：08/05/2015。13肖開捷，田志新。一種生物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)快速建立與搜索的方法。申請(qǐng)?zhí)枺?01510125438.7，申請(qǐng)日期：03/20/2015；申請(qǐng)公布號(hào)：cn104765984a，申請(qǐng)公布日：07/08/2015。14田志新。一種生物質(zhì)譜重疊同位素輪廓的解析方法。申請(qǐng)?zhí)枺?01410593905.4，申請(qǐng)日期：10/29/2014；公布號(hào)：cn104359967a，公布日期：2015.02.18。15田志新。一種鑒定生物大分子的分析裝置和方法。申請(qǐng)?zhí)枺?01210146519.1，申請(qǐng)日期：05/11/2012；公布號(hào)：cn103389335a，公布日期:11/23/2013。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種標(biāo)記效率高、副反應(yīng)少、準(zhǔn)確度高的種基于全準(zhǔn)同重二乙基標(biāo)記的蛋白質(zhì)定量方法。本方法基于所述不同生理或病理?xiàng)l件下整體蛋白質(zhì)序列上賴氨酸殘基及n端氨基酸上的氨基的全準(zhǔn)同重二乙基標(biāo)記以及高分辨質(zhì)譜和串級(jí)質(zhì)譜分析，通過(guò)計(jì)算包含二乙基碎片離子的相對(duì)強(qiáng)度從而計(jì)算蛋白在不同生理或病理?xiàng)l件下的相對(duì)強(qiáng)度變化(上調(diào)或下調(diào))。本發(fā)明采用二乙基標(biāo)記，將a1離子的質(zhì)量增加28da(相對(duì)于二甲基標(biāo)記)，能較好地兼顧最低質(zhì)量端a1離子和高質(zhì)量端的離子的全面檢測(cè)。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種基于全準(zhǔn)同重二乙基標(biāo)記的蛋白質(zhì)定量方法，包括以下步驟：(1)將兩組不同生理或病理?xiàng)l件的整體蛋白分別作為控制組與疾病組；(2)將還原及烷基化后的控制組蛋白質(zhì)與疾病組蛋白質(zhì)任意位置賴氨酸及n端氨基酸上的所有氨基進(jìn)行全同重二乙基標(biāo)記，分別標(biāo)記為-n(13ch313chd)2和-n(cd3ch2)2，其質(zhì)量差異為11.68mda；(3)同重標(biāo)記后兩組蛋白按等比例混合進(jìn)行高分辨質(zhì)譜和串級(jí)質(zhì)譜分析得到一個(gè)數(shù)據(jù)組；(4)對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，得到蛋白質(zhì)的id及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)于控制組的相對(duì)比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況，上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)最大的蛋白即為與該疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白。步驟(2)中，一組蛋白質(zhì)任意位置賴氨酸及n端氨基酸上的所有氨基用乙醛(13ch313cho)和氘代氰基硼氫化鈉(nabd3cn)標(biāo)記，另一組蛋白質(zhì)任意位置賴氨酸及n端氨基酸上的所有氨基用乙醛(cd3cho)和氰基硼氫化鈉(nabh3cn)標(biāo)記。進(jìn)行標(biāo)記的反應(yīng)過(guò)程和條件如下：還原及烷基化后的蛋白重新溶解在乙酸鈉緩沖溶液后，加入剛剛配制的4％(v/v)乙醛溶液；在攪拌條件下加入600mm的新配制的氰基硼氫化鈉溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)后，反應(yīng)用4％(v/v)的氨水淬滅。所述的乙酸鈉緩沖溶液為100mmol/l，ph為5-6。用二硫蘇糖醇對(duì)控制組蛋白質(zhì)與疾病組蛋白質(zhì)進(jìn)行還原。用碘乙酰胺對(duì)控制組蛋白質(zhì)與疾病組蛋白質(zhì)進(jìn)行烷基化。步驟(3)所述的等比例混合指：按照控制組與疾病組的重量、體積或摩爾量以1:1比例進(jìn)行混合。步驟(4)中對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，得到蛋白質(zhì)的id及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)于控制組的相對(duì)比例為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選使用
背景技術(shù)：
：中介紹的整體蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)搜索引擎proteingoggle，同時(shí)也可以使用其他數(shù)據(jù)庫(kù)。本發(fā)明涉及的方法同樣適用于多肽的全準(zhǔn)同重二乙基標(biāo)記定量分析。準(zhǔn)同重試劑對(duì)也可以是其他組合，例如13ch3cho+nabh3cn和ch3cho+nabd3cn；標(biāo)記后的二乙基至少有一對(duì)13c-d即可。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的解析方法基于所述質(zhì)譜的原始二級(jí)質(zhì)譜，通過(guò)計(jì)算包含準(zhǔn)同重標(biāo)記基團(tuán)的碎片離子的平均相對(duì)強(qiáng)度從而計(jì)算標(biāo)記蛋白在不同生理或病理?xiàng)l件下的相對(duì)強(qiáng)度。本發(fā)明的定量方法對(duì)蛋白質(zhì)任意位置賴氨酸及n端氨基酸上的所有氨基進(jìn)行準(zhǔn)同重標(biāo)記并對(duì)相應(yīng)高分辨串級(jí)質(zhì)譜中包含準(zhǔn)同重標(biāo)記基團(tuán)的碎片離子進(jìn)行同位素輪廓指紋比對(duì)原位數(shù)據(jù)解析，標(biāo)記效率高，準(zhǔn)確度高，適用于整體蛋白質(zhì)基于高分辨串級(jí)質(zhì)譜的定量分析。附圖說(shuō)明圖1、基于蛋白質(zhì)任意位置賴氨酸及n端氨基酸上的所有氨基的全準(zhǔn)同重二乙基標(biāo)記定量的整體分析流程圖。圖2、蛋白質(zhì)分子任意位置賴氨酸及n端氨基酸上的所有氨基的全準(zhǔn)同重二乙基標(biāo)記示意圖。控制組蛋白標(biāo)記為l(＝-n(13ch313chd)2，圖a)；疾病組蛋白標(biāo)記為h(＝-n(cd3ch2)2，圖b)具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例一種基于全準(zhǔn)同重二乙基標(biāo)記的蛋白質(zhì)定量方法，采用圖1所示的整理流程，包括以下步驟：(1)將兩組不同生理或病理?xiàng)l件的整體蛋白分別作為控制組與疾病組，用二硫蘇糖醇對(duì)控制組蛋白質(zhì)與疾病組蛋白質(zhì)進(jìn)行還原，用碘乙酰胺對(duì)控制組蛋白質(zhì)與疾病組蛋白質(zhì)進(jìn)行烷基化；(2)將還原及烷基化后的控制組蛋白質(zhì)與疾病組蛋白質(zhì)任意位置賴氨酸及n端氨基酸上的所有氨基進(jìn)行全同重二乙基標(biāo)記，分別標(biāo)記為-n(13ch313chd)2和-n(cd3ch2)2，如圖2所示，其質(zhì)量差異為11.68mda；步驟(2)中，一組蛋白質(zhì)任意位置賴氨酸及n端氨基酸上的所有氨基用乙醛(13ch313cho)和氘代氰基硼氫化鈉(nabd3cn)標(biāo)記，另一組蛋白質(zhì)任意位置賴氨酸及n端氨基酸上的所有氨基用乙醛(cd3cho)和氰基硼氫化鈉(nabh3cn)標(biāo)記。進(jìn)行標(biāo)記的反應(yīng)過(guò)程和條件如下：還原及烷基化后的蛋白重新溶解在乙酸鈉緩沖溶液后，加入剛剛配制的4％(v/v)乙醛溶液；在攪拌條件下加入600mm的新配制的氰基硼氫化鈉溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)后，反應(yīng)用4％(v/v)的氨水淬滅。所述的乙酸鈉緩沖溶液為100mmol/l，ph為5-6。(3)同重標(biāo)記后兩組蛋白按等比例混合進(jìn)行高分辨質(zhì)譜和串級(jí)質(zhì)譜分析得到一個(gè)數(shù)據(jù)組，等比例混合指：按照控制組與疾病組的重量、體積或摩爾量以1:1比例進(jìn)行混合；(4)使用
背景技術(shù)：
：中介紹的整體蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)搜索引擎proteingoggle對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，得到蛋白質(zhì)的id及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)于控制組的相對(duì)比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況，上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)最大的蛋白即為與該疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白。上述解析方法基于所述質(zhì)譜的原始二級(jí)質(zhì)譜，通過(guò)計(jì)算包含準(zhǔn)同重標(biāo)記基團(tuán)的碎片離子的平均相對(duì)強(qiáng)度從而計(jì)算標(biāo)記蛋白在不同生理或病理?xiàng)l件下的相對(duì)強(qiáng)度。本發(fā)明的定量方法對(duì)蛋白質(zhì)任意位置賴氨酸及n端氨基酸上的所有氨基進(jìn)行準(zhǔn)同重標(biāo)記并對(duì)相應(yīng)高分辨串級(jí)質(zhì)譜中包含準(zhǔn)同重標(biāo)記基團(tuán)的碎片離子進(jìn)行同位素輪廓指紋比對(duì)原位數(shù)據(jù)解析，標(biāo)記效率高，準(zhǔn)確度高，適用于整體蛋白質(zhì)基于高分辨串級(jí)質(zhì)譜的定量分析。上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該
技術(shù)領(lǐng)域：
：的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說(shuō)明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12