本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種改進(jìn)的免疫組織化學(xué)試驗(yàn)方法。

背景技術(shù)：

免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)。目前主流的生物或醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中，免疫組織化學(xué)是一種較為常用的試驗(yàn)方法，在現(xiàn)有技術(shù)中，其具體操作步驟為：（1）將生物標(biāo)本制作成石蠟切片，石蠟切片置于烤箱中60℃烤片2小時(shí)，取出后依次放入二甲苯ⅰ、ⅱ中脫蠟，每次15分鐘；（2）然后將切片依次放入無(wú)水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，每次5分鐘；蒸餾水洗3分鐘；（3）pbs洗滌切片3次，每次3分鐘；（4）抗原修復(fù)：將組織切片置于盛滿edta抗原修復(fù)緩沖液（ph8.0）的修復(fù)盒中放入微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。依次中火8分鐘，?；?分鐘，然后中低火7分鐘，此修復(fù)過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，以免干片；（5）自然冷卻至室溫后，將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；（6）阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：切片放入3%過(guò)氧化氫溶液中，室溫避光孵育25分鐘；（7）將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；（8）切片稍甩干后滴加相關(guān)動(dòng)物血清覆蓋組織，室溫封閉30分鐘；（9）加一抗：甩掉血清封閉液并滴加按一定比例臨時(shí)配制好的一抗覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)4°c孵育過(guò)夜；（10）濕盒4℃冰箱取出后恢復(fù)至室溫；（11）將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；（12）加二抗：切片稍甩干后滴加與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗（生物素標(biāo)記）覆蓋組織，置于濕盒內(nèi)室溫孵育50分鐘；（13）然后將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；（14）切片稍甩干并滴加鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，室溫下孵育25分鐘；（15）將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；（16）dab顯色：切片稍甩干后滴加新鮮配制的dab顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，顯色后自來(lái)水沖洗切片終止顯色；（17）harris蘇木素復(fù)染3分鐘左右，自來(lái)水沖洗；（18）1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗；（19）脫水透明：將切片依次放入70%酒精5分鐘、80%酒精5分鐘、90%酒精5分鐘、95%酒精5分鐘、無(wú)水乙醇ⅰ、ⅱ各5分鐘、二甲苯ⅰ、ⅱ各5分鐘中脫水透明；（20）將切片從二甲苯中拿出稍晾干，中性樹(shù)膠封片。

現(xiàn)有的試驗(yàn)方法試驗(yàn)結(jié)果理想，但操作步驟相對(duì)較多，試驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有免疫組織化學(xué)存在的缺陷和不足，提供一種改進(jìn)的免疫組織化學(xué)試驗(yàn)方法。本發(fā)明通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)免疫組化順序一抗、二抗標(biāo)記后，需要鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液孵化顯色過(guò)程進(jìn)行改進(jìn)，利用新型復(fù)合抗體為二抗孵育，后可直接進(jìn)行顯色步驟，在保證試驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)簡(jiǎn)了化試驗(yàn)步驟，縮短了試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)。

本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的免疫組織化學(xué)試驗(yàn)方法。

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的：

一種改進(jìn)的免疫組織化學(xué)試驗(yàn)方法，包括如下步驟：

s1.生物標(biāo)本制成石蠟切片脫蠟至水，再抗原熱修復(fù)；

s2.將切片置于3%h2o2中溫室25min內(nèi)滅活內(nèi)源性酶；

s3.切片經(jīng)相關(guān)動(dòng)物血清封閉；

s4.除去封閉液，用一抗稀釋液4℃孵育過(guò)夜；

s5.用hrp標(biāo)記的二抗孵育一抗；

s6.切片再經(jīng)dab顯色，顯色終止后復(fù)染；

s7.切片脫水透明，最后封片。

優(yōu)選地，步驟s1所述脫蠟至水為石蠟切片置于烤箱中60℃烤片2小時(shí)，取出后依次放入二甲苯ⅰ、ⅱ中脫蠟，每次15分鐘；然后將切片依次放入無(wú)水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，每次5分鐘，再蒸餾水洗3分鐘；最后用pbs洗滌切片3次，每次3分鐘。

優(yōu)選地，步驟s1所述抗原熱修復(fù)為將組織切片置于ph8.0的edta抗原修復(fù)緩沖液中，然后放入微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，依次中火8分鐘，?；?分鐘，然后中低火7分鐘，此修復(fù)過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，以免干片。

優(yōu)選地，步驟s3所述封閉為室溫封閉30分鐘。

優(yōu)選地，步驟s5所述孵育為室溫孵育50分鐘。

優(yōu)選地，步驟s6所述dab顯色為切片稍甩干后滴加新鮮配制的dab顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，顯色后自來(lái)水沖洗切片終止顯色。

優(yōu)選地，步驟s8所述脫水透明為將切片依次放入70%酒精5分鐘、80%酒精5分鐘、90%酒精5分鐘、95%酒精5分鐘、無(wú)水乙醇ⅰ、ⅱ各5分鐘、二甲苯ⅰ、ⅱ各5分鐘中脫水透明。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明所述改進(jìn)的免疫組織化學(xué)試驗(yàn)方法具體包括如下步驟：

（1）將生物標(biāo)本制作成石蠟切片，石蠟切片置于烤箱中60℃烤片2小時(shí)，取出后依次放入二甲苯ⅰ、ⅱ中脫蠟，每次15分鐘；

（2）然后將切片依次放入無(wú)水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，每次5分鐘；蒸餾水洗3分鐘；

（3）pbs洗滌切片3次，每次3分鐘；

（4）抗原修復(fù)：將組織切片置于盛滿edta抗原修復(fù)緩沖液（ph8.0）的修復(fù)盒中放入微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。依次中火8分鐘，?；?分鐘，然后中低火7分鐘，此修復(fù)過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，以免干片；

（5）自然冷卻至室溫后，將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；

（6）阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：切片放入3%過(guò)氧化氫溶液中，室溫避光孵育25分鐘；

（7）將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；

（8）切片稍甩干后滴加相關(guān)動(dòng)物血清覆蓋組織，室溫封閉30分鐘；

（9）加一抗：甩掉血清封閉液并滴加按一定比例臨時(shí)配制好的一抗覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)4°c孵育過(guò)夜；

（10）濕盒4℃冰箱取出后恢復(fù)至室溫；

（11）將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；

（12）加二抗：切片稍甩干后滴加與一抗相對(duì)應(yīng)二抗（hrp標(biāo)記）覆蓋組織，置于濕盒內(nèi)室溫孵育50分鐘；

（13）然后將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；

（14）dab顯色：切片稍甩干后滴加新鮮配制的dab顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，顯色后自來(lái)水沖洗切片終止顯色；

（15）harris蘇木素復(fù)染3分鐘左右，自來(lái)水沖洗；

（16）1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗；

（17）脫水透明：將切片依次放入70%酒精5分鐘、80%酒精5分鐘、90%酒精5分鐘、95%酒精5分鐘、無(wú)水乙醇ⅰ、ⅱ各5分鐘、二甲苯ⅰ、ⅱ各5分鐘中脫水透明；

（18）將切片從二甲苯中拿出稍晾干，中性樹(shù)膠封片。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)免疫組化順序一抗、二抗標(biāo)記后，需要鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液孵化顯色過(guò)程進(jìn)行改進(jìn)，利用新型復(fù)合抗體為二抗孵育，后可直接進(jìn)行顯色步驟，在保證試驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)簡(jiǎn)了化試驗(yàn)步驟，縮短了試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)。

（2）本發(fā)明該進(jìn)后的方法簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟，縮短了試驗(yàn)時(shí)間，從而使研究者有條不紊的試驗(yàn)，加快了試驗(yàn)進(jìn)度，可用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，具有較大的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1免疫組化的試驗(yàn)流程；a為傳統(tǒng)方法試驗(yàn)流程，b為改進(jìn)方法試驗(yàn)流程。

圖2為免疫組化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；a為傳統(tǒng)免疫組化，b為改進(jìn)后的免疫組；a與b所得實(shí)驗(yàn)效果相同，但改進(jìn)后的免疫組化在保證試驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。

實(shí)施例1一種改進(jìn)的免疫組織化學(xué)試驗(yàn)方法

免疫組化的具體操作步驟如下：

（1）將生物標(biāo)本制作成石蠟切片，石蠟切片置于烤箱中60℃烤片2小時(shí)，取出后依次放入二甲苯ⅰ、ⅱ中脫蠟，每次15分鐘；

（2）然后將切片依次放入無(wú)水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，每次5分鐘；蒸餾水洗3分鐘；

（3）pbs洗滌切片3次，每次3分鐘；

（4）抗原修復(fù)：將組織切片置于盛滿edta抗原修復(fù)緩沖液（ph8.0）的修復(fù)盒中放入微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。依次中火8分鐘，?；?分鐘，然后中低火7分鐘，此修復(fù)過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，以免干片；

（5）自然冷卻至室溫后，將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；

（6）阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：切片放入3%過(guò)氧化氫溶液中，室溫避光孵育25分鐘；

（7）將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；

（8）切片稍甩干后滴加相關(guān)動(dòng)物血清覆蓋組織，室溫封閉30分鐘；

（9）加一抗：甩掉血清封閉液并滴加按一定比例臨時(shí)配制好的一抗覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)4°c孵育過(guò)夜；

（10）濕盒4℃冰箱取出后恢復(fù)至室溫；

（11）將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；

（12）加二抗：切片稍甩干后滴加與一抗相對(duì)應(yīng)二抗（hrp標(biāo)記）覆蓋組織，置于濕盒內(nèi)室溫孵育50分鐘；

（13）然后將玻片置于pbs（ph7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次3分鐘；

（14）dab顯色：切片稍甩干后滴加新鮮配制的dab顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，顯色后自來(lái)水沖洗切片終止顯色；

（15）harris蘇木素復(fù)染3分鐘左右，自來(lái)水沖洗；

（16）1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗；

（17）脫水透明：將切片依次放入70%酒精5分鐘、80%酒精5分鐘、90%酒精5分鐘、95%酒精5分鐘、無(wú)水乙醇ⅰ、ⅱ各5分鐘、二甲苯ⅰ、ⅱ各5分鐘中脫水透明；

（18）將切片從二甲苯中拿出稍晾干，中性樹(shù)膠封片。

改進(jìn)后的免疫組化與傳統(tǒng)免疫組化相比，在二抗的選擇上進(jìn)行了改進(jìn)，通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)傳統(tǒng)免疫組化要鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液孵化顯色過(guò)程進(jìn)行改進(jìn)，利用新型復(fù)合抗體為二抗孵育，后可直接進(jìn)行顯色步驟（如圖1所示），在保證試驗(yàn)結(jié)果（如圖2所示）的同時(shí)簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，縮短了試驗(yàn)時(shí)間，從而使研究者有條不紊的試驗(yàn)，加快了試驗(yàn)進(jìn)度。