本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于觀察小麥矮腥黑粉菌在小麥子房內(nèi)的侵染、發(fā)病和為害過程的方法。

背景技術(shù)：

小麥矮腥黑穗病(wheatdwarfbuntdisease,db)是危害世界麥類作物的重要檢疫性病害，主要危害小麥(triticumaestivum)，可造成植株矮化、分蘗增多等病癥，且防治困難，一旦傳入將會給小麥生產(chǎn)帶來毀滅性危害，其冬孢子具魚腥臭味，會極大地影響小麥品質(zhì)。小麥矮腥黑穗病病害風(fēng)險評估表明，中國有19.3％的冬小麥種植區(qū)有適宜該病害發(fā)生的自然條件，屬高風(fēng)險發(fā)生區(qū)。小麥矮腥黑粉菌(tilletiacontroversakühn,tck)屬擔(dān)子菌亞門(basidiomycotina)、冬孢菌綱(teliomycetes)、黑粉菌目(ustilaginales)、腥黑粉菌科(tilletiaceae)、腥黑粉菌屬(tilletia)。小麥矮腥黑粉菌的寄主范圍很廣，除主要侵染小麥外，還能侵染大麥(hordeumvulgarel.)、黑麥(secalecereale)等禾本科18個屬的70多種植物。國內(nèi)外對小麥腥黑粉菌屬病原菌的研究工作主要集中在小麥矮腥黑粉菌及其近源種的種內(nèi)及種間分子生物學(xué)分類方面的相關(guān)研究，依據(jù)rdna的轉(zhuǎn)錄間區(qū)測序分析、隨機擴增多態(tài)性dna標(biāo)記(randomamplifiedpolymorphicdna,rapd)、重復(fù)片段pcr基因指紋分析(repetitiveelementpcrgenomicfingerprinting,reppcr)及real-timepcr等方法研究腥黑粉菌的種內(nèi)及種間差異,以尋求其變異特征，目前已實現(xiàn)小麥矮腥黑粉菌的早期檢測及其冬孢子的分子檢測與免疫熒光法檢測，小麥矮腥黑粉菌侵染過程的研究將有助于揭示小麥矮腥黑粉菌的致病過程及其與寄主的互作。散落在土壤中的該病菌冬孢子萌發(fā)后侵染小麥幼嫩的分孽處，逐步進入穗原始體、花器等組織，破壞子房，最終形成該病菌的冬孢子堆。姚卓等人和楊巖等人在室內(nèi)條件下小麥矮腥黑粉菌的人工接種。小麥矮腥黑粉菌侵染寄主小麥的細(xì)胞學(xué)研究僅限于20世紀(jì)90年代的組織切片技術(shù)。trione等人采用切片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)小麥子房被侵染后菌絲在子實層形成冬孢子；fernandez和duran采用組織切片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)該真菌在小麥生長點存在大量菌絲。截至目前,該病菌侵染過程研究尚未有詳細(xì)報道。激光掃描共聚焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope,lscm)可高效、直觀地觀察真菌的菌絲，gao等人利用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)揭示了玉米瘤黑粉菌對玉米(zeamays)花藥細(xì)胞發(fā)育的影響，該技術(shù)還可長期監(jiān)測病原菌和寄主的相互作用，如觀察煙草疫霉、大麗輪枝菌、馬鈴薯細(xì)菌性軟腐病菌分別侵染其寄主的生長動態(tài)及與寄主的互作方式等研究。

但本領(lǐng)域尚缺乏一種可有效清楚地展現(xiàn)小麥矮腥黑粉菌對小麥子房侵染過程的顯微觀察方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于本領(lǐng)域的空白，本發(fā)明的目的在于提供一種方法，用于對小麥矮腥黑粉菌侵染小麥子房進行有效清楚的觀察。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明首先提供一種用于觀察小麥矮腥黑粉菌侵染小麥子房的方法，包括如下步驟：(1)接種：用小麥矮腥黑粉菌對孕穗期小麥的小穗進行接種；(2)采樣：上述接種一周后，將確定感染小麥矮腥黑粉菌的小麥的小穗的子房取出浸入無水乙醇中保存；所述小穗為小麥孕穗期開始時的小穗；(3)染色制片：將所述子房置于載玻片上進行染色后制成觀察用玻片，并將所述玻片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察；所述染色指：將所述子房先置于10μg/mlpropidiumidodide和0.02％tween20染色20min，再用20μg/mlwga-af488染色20min，最后用1×pbs(ph7.4)沖洗4至6次。現(xiàn)有染色方法記載在“蔚慧欣、高利等，2016《小麥矮腥黑粉菌在小麥體內(nèi)侵染過程的顯微觀察》一文中，經(jīng)實驗對比，現(xiàn)有染色方法與本發(fā)明的染色方法針對同樣的小麥品種進行采樣、染色、觀察獲得的圖像差別巨大，現(xiàn)有方法并不能滿足清楚準(zhǔn)確地顯示子房內(nèi)部各細(xì)胞的要求，而本發(fā)明的方法能夠清楚地辨別子房內(nèi)部的細(xì)胞形態(tài)和大小，從而便于進一步進行圖像的數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

在進一步的實施例中，進行所述采樣后，將所述小穗子房包埋進石蠟中并制作成石蠟切片，在對所述石蠟切片進行染色。制作石蠟切片的作用是，用來與激光共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果對比。

在更進一步的實施例中，在載玻片上所述石蠟切片的兩側(cè)分別使用雙面貼，用于加高蓋玻片并使所述蓋玻片蓋上后可通過雙面貼與載玻片固定并制成觀察用玻片；將所述玻片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

在另一些實施例中，所述小麥通過下述方法獲得：將種子消毒、清洗后進行春化處理，待小麥發(fā)芽至芽長1-2cm時種植到具有小麥生長所需養(yǎng)分的土壤中，置于15℃、相對濕度為70％的環(huán)境下繼續(xù)春化生長至少2周后，改為白天25℃、夜間10℃繼續(xù)培養(yǎng)至所述孕穗期。而現(xiàn)有方法(姚卓、陳萬權(quán)等，2014，《小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)和室內(nèi)人工接種方法的探索》一文中記載)的則為待小麥發(fā)芽至芽長4-5cm時備用，相比而言，本發(fā)明在小麥芽1-2cm時就轉(zhuǎn)入土壤中好處在于，用更幼嫩的小麥芽種植于土壤中，再繼續(xù)進行春化處理，可使整體春化效果更好，進而使后續(xù)生長出來的小麥植株順利開啟孕穗期，縮短種子萌發(fā)至進入孕穗期的時間的同時，還可以使進入孕穗期的小麥的小穗狀態(tài)最佳，所侵染得到的小穗材料經(jīng)染色制片后觀察效果達(dá)到最優(yōu)，對于獲得本發(fā)明最終的最佳觀察效果，這一步驟非常關(guān)鍵。

同時，關(guān)于小麥生長種植方法，現(xiàn)有方法(姚卓、陳萬權(quán)等，2014《小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)和室內(nèi)人工接種方法的探索》一文記載)為：將接種后的種子播于直徑24cm塑料盆中，深度約5cm，每盆種10粒種子。在10℃下培養(yǎng)，直到幼苗出土良好，時間約2周。然后將幼苗移至高溫室中培養(yǎng)，白天溫度約25℃，夜間溫度約13℃，進行常規(guī)管理，將植株種植至成熟。相比上述現(xiàn)有方法，本發(fā)明采用的小麥種植步驟能獲得符合要求的孕穗期小麥材料，尤其能夠獲得最佳觀察時期的小麥子房狀態(tài)。

在進一步具體的實施例中，步驟(2)中，所述取出小麥小穗的子房的具體操作如下：在體視顯微鏡下使用鑷子對所述小穗進行解剖，去掉小穗的外稃、內(nèi)稃和花藥，從盾片上剝離下來子房并去掉柱頭。

在優(yōu)選的實施例中，所述小麥孕穗期開始時的小穗指，小麥旗葉葉片全部從倒二葉葉鞘內(nèi)伸出后，小麥莖部由于小穗生長開始膨大時從小麥中剝離獲得的小穗。這個階段的小麥孕穗剛剛開始發(fā)育，此時接種可使小麥矮腥黑粉菌盡早地接觸小麥材料，使整個侵染過程的開始節(jié)點提前，并最大可能地延長黑粉菌侵染小麥的時間，使最終侵染結(jié)果觀察效果更好。

在一些實施例中，步驟(2)中，所述確定感染小麥矮腥黑粉菌的小麥采用分子生物學(xué)手段進行檢測。所述分子生物學(xué)手段具體指采用改良的ctab法提取小麥子房dna進行樣品檢測，參照(gaoetal.，2014)中篩選的基于issr的tck特異性scar分子標(biāo)記引物(gaoli,yuhuixin,hanwensu,gaofei,liutaiguo,liubo,kangxiaohui,gaojiguo,chenwanquan.developmentofascarmarkerformoleculardetectionanddiagnosisoftilletiacontroversakuhn,thecausalfungusofwheatdwarfbunt)，進行常規(guī)pcr擴增，凝膠電泳檢測得到一條大小為372bp片段的樣品植株可以確定為已發(fā)病小麥植株。

在本發(fā)明所有的實施例中，所述小麥品種為小麥矮腥黑粉菌易感病品種，優(yōu)選“冬選三號”。

本發(fā)明另一方面還提供了上述方法在觀察研究小麥矮腥黑粉菌侵染小麥方面的應(yīng)用。

本發(fā)明最大的貢獻是提供了一種通過病原菌菌絲侵染植物組織的三維立體觀察構(gòu)象的手段來研究病原菌的侵染過程的技術(shù)，采用本發(fā)明的方法，能對小麥矮腥黑粉菌侵染小麥、尤其是小麥子房的全部過程進行跟蹤、觀察，并且與現(xiàn)有方法相比較，本發(fā)明的方法能夠清楚地辨別子房內(nèi)部的細(xì)胞形態(tài)和大小，從而便于進一步進行圖像的數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

附圖說明

圖1是采用本發(fā)明的1個實施例的方法所得到的石蠟切片成像：左邊是直徑大小為1000μm的小麥子房圖；右邊是直徑大小為700μm的小麥子房圖。

圖2是采用本發(fā)明的1個實施例的方法所得到的激光共聚焦成像：左邊是直徑大小為900μm的小麥子房圖；右邊是直徑大小為430的小麥胚珠圖。

圖3是采用現(xiàn)有技術(shù)方法所得到的激光共聚焦成像。

圖4是采用本發(fā)明的1個實施例的方法所得到的激光共聚焦成像。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)說明，但并不限制本發(fā)明的范圍。如無特殊說明，下述實施例中使用的操作均為常規(guī)方法，所采用的試劑均可以商購獲得。

生物材料的來源

本文中所使用的小麥品種“冬選三號”為現(xiàn)有已知品種，可商購獲得。

主要試劑

次氯酸鈉溶液、二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ、無水乙醇ⅰ、95％酒精、90％酒精、80％酒精、70％酒精均為國產(chǎn)分析純；

番紅染液購自北京百斯威生物科技有限公司；

wga-af488、propidiumidodide購自lifetechnologiescorporation(北京江晨源遠(yuǎn)生物科技有限公司代購)；

0.02％tween20染購自北京冰達(dá)生物科技有限公司；

pbs購自gehealthcarelifesciencescompany(北京江晨源遠(yuǎn)生物科技有限公司代購)。

本發(fā)明第一個系列的實施例提供一種用于觀察小麥矮腥黑粉菌侵染小麥子房的方法，在該系列所有實施例中，所述方法包括如下步驟：

(1)接種：用小麥矮腥黑粉菌對孕穗期小麥的小穗進行接種；(2)采樣：上述接種一周后，將確定感染小麥矮腥黑粉菌的小麥的小穗的子房取出浸入無水乙醇中保存；所述小穗為小麥孕穗期開始時的小穗；(3)染色制片：將所述子房置于載玻片上進行染色后制成觀察用玻片，并將所述玻片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察；所述染色指：將所述子房先置于10μg/mlpropidiumidodide和0.02％tween20染色20min，再用20μg/mlwga-af488染色20min，最后用1×pbs(ph7.4)沖洗4至6次。現(xiàn)有染色方法記載在“蔚慧欣、高利等，2016《小麥矮腥黑粉菌在小麥體內(nèi)侵染過程的顯微觀察》一文中，經(jīng)實驗對比，現(xiàn)有染色方法與本發(fā)明的染色方法針對同樣的小麥品種進行采樣、染色、觀察獲得的圖像差別巨大，現(xiàn)有方法并不能滿足清楚準(zhǔn)確地顯示子房內(nèi)部各細(xì)胞的要求，而本發(fā)明的方法能夠清楚地辨別子房內(nèi)部的細(xì)胞形態(tài)和大小，從而便于進一步進行圖像的數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

在進一步的實施例中，進行所述采樣后，將所述小穗子房包埋進石蠟中并制作成石蠟切片，在對所述石蠟切片進行染色。制作石蠟切片的作用是，用來與激光共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果對比。經(jīng)實驗對比，石蠟切片由于其本身的操作特點，會造成小麥的子房細(xì)胞部分被破壞和損傷，具有局限性，因此最優(yōu)選的還是采用上述染色方法進行激光共聚焦顯微觀察。

在更進一步的實施例中，在載玻片上所述石蠟切片的兩側(cè)分別使用雙面貼，用于加高蓋玻片并使所述蓋玻片蓋上后可通過雙面貼與載玻片固定并制成觀察用玻片；將所述玻片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

在另一些實施例中，所述小麥通過下述方法獲得：將種子消毒、清洗后進行春化處理，待小麥發(fā)芽至芽長1-2cm時種植到具有小麥生長所需養(yǎng)分的土壤中，置于15℃、相對濕度為70％的環(huán)境下繼續(xù)春化生長至少2周后，改為白天25℃、夜間10℃繼續(xù)培養(yǎng)至所述孕穗期。而現(xiàn)有方法(姚卓、陳萬權(quán)等，2014，《小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)和室內(nèi)人工接種方法的探索》一文中記載)的則為待小麥發(fā)芽至芽長4-5cm時備用，相比而言，本發(fā)明在小麥芽1-2cm時就轉(zhuǎn)入土壤中好處在于，用更幼嫩的小麥芽種植于土壤中，再繼續(xù)進行春化處理，可使整體春化效果更好，進而使后續(xù)生長出來的小麥植株順利開啟孕穗期，縮短種子萌發(fā)至進入孕穗期的時間的同時，還可以使進入孕穗期的小麥的小穗狀態(tài)最佳，所侵染得到的小穗材料經(jīng)染色制片后觀察效果達(dá)到最優(yōu)，對于獲得本發(fā)明最終的最佳觀察效果，這一步驟非常關(guān)鍵。

同時，關(guān)于小麥生長種植方法，現(xiàn)有方法(姚卓、陳萬權(quán)等，2014《小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)和室內(nèi)人工接種方法的探索》一文記載)為：將接種后的種子播于直徑24cm塑料盆中，深度約5cm，每盆種10粒種子。在10℃下培養(yǎng)，直到幼苗出土良好，時間約2周。然后將幼苗移至高溫室中培養(yǎng)，白天溫度約25℃，夜間溫度約13℃，進行常規(guī)管理，將植株種植至成熟。相比上述現(xiàn)有方法，本發(fā)明采用的小麥種植步驟能獲得符合要求的孕穗期小麥材料，尤其能夠獲得最佳觀察時期的小麥子房狀態(tài)。

在進一步具體的實施例中，步驟(2)中，所述取出小麥小穗的子房的具體操作如下：在體視顯微鏡下使用鑷子對所述小穗進行解剖，去掉小穗的外稃、內(nèi)稃和花藥，從盾片上剝離下來子房并去掉柱頭。

在優(yōu)選的實施例中，所述小麥孕穗期開始時的小穗指，小麥旗葉葉片全部從倒二葉葉鞘內(nèi)伸出后，小麥莖部由于小穗生長開始膨大時從小麥中剝離獲得的小穗。這個階段的小麥孕穗剛剛開始發(fā)育，此時接種可使小麥矮腥黑粉菌盡早地接觸小麥材料，使整個侵染過程的開始節(jié)點提前，并最大可能地延長黑粉菌侵染小麥的時間，使最終侵染結(jié)果觀察效果更好。

在一些實施例中，步驟(2)中，所述確定感染小麥矮腥黑粉菌的小麥采用分子生物學(xué)手段進行檢測。所述分子生物學(xué)手段具體指采用改良的ctab法提取小麥子房dna進行樣品檢測，參照(gaoetal.，2014)中篩選的基于issr的tck特異性scar分子標(biāo)記引物(gaoli,yuhuixin,hanwensu,gaofei,liutaiguo,liubo,kangxiaohui,gaojiguo,chenwanquan.developmentofascarmarkerformoleculardetectionanddiagnosisoftilletiacontroversakuhn,thecausalfungusofwheatdwarfbunt)，進行常規(guī)pcr擴增，凝膠電泳檢測得到一條大小為372bp片段的樣品植株可以確定為已發(fā)病小麥植株。

在本發(fā)明所有的實施例中，所述小麥品種為小麥矮腥黑粉菌易感病品種，優(yōu)選“冬選三號”。

本發(fā)明另一個系列的實施例還提供了上述方法在觀察研究小麥矮腥黑粉菌侵染小麥方面的應(yīng)用，特征是，采用上述任一實施例所述的方法來進行黑粉菌侵染小麥并觀察的操作。

下面是本發(fā)明最具體的一個實施例，包括如下步驟：

采用易感病品種：“冬選三號”小麥品種約200g使用30％的次氯酸鈉溶液消毒1min，消毒后使用蒸餾水沖洗小麥種子三遍，將處理好的種子平攤在直徑為15cm的玻璃培養(yǎng)皿中置于溫度為4℃、相對濕度為50％的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行為期一個月低溫春化處理，待小麥發(fā)芽至芽長1-2cm時備用。

將土壤基質(zhì)和營養(yǎng)土按3:1的比例混合攪拌均勻后用立式全自動高壓滅菌鍋滅菌，稱取冷卻好的混合土壤1.5-2.0kg分裝到直徑為15cm、深度為20cm的陶瓷花盆中澆水后準(zhǔn)備種苗。

將每一粒發(fā)芽的小麥種子種植到裝有混合土的花盆中，為保證小麥生長所需的養(yǎng)分分配，每盆種7粒發(fā)芽的小麥種子為宜。將種下小麥發(fā)芽種子的花盆放置在15℃、相對濕度為70％的人工氣候生長培養(yǎng)箱(lt-36vlc8，percival)內(nèi)繼續(xù)低溫春化生長至少2個周，待小麥植株健壯后培養(yǎng)箱參數(shù)改為白天25℃、夜間10℃繼續(xù)培養(yǎng)生長，當(dāng)小麥生長到孕穗期(最優(yōu)時期為孕穗期開始時)準(zhǔn)備人工接種，人工接種后改為10℃低溫培養(yǎng)，接種一周后恢復(fù)白天25℃、夜間10℃的設(shè)定參數(shù)。而現(xiàn)有方法(姚卓、陳萬權(quán)等，2014《小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)和室內(nèi)人工接種方法的探索》一文記載)為：將接種后的種子播于直徑24cm塑料盆中，深度約5cm，每盆種10粒種子。在10℃下培養(yǎng)，直到幼苗出土良好，時間約2周。然后將幼苗移至高溫室中培養(yǎng)，白天溫度約25℃，夜間溫度約13℃，進行常規(guī)管理，將植株種植至成熟。相比上述現(xiàn)有方法，本發(fā)明采用的小麥種植步驟能獲得符合要求的孕穗期小麥材料，尤其能夠獲得最佳觀察時期的小麥子房狀態(tài)。

萌發(fā)的小麥矮腥黑粉菌人工接種(具體接種步驟詳見姚卓、陳萬權(quán)等，2014《小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)和室內(nèi)人工接種方法的探索》)一周后，采集小麥孕穗時期的小穗進行分子檢測確定發(fā)病植株后采樣，同時也在對照組的正常小麥中進行采樣。采集的小麥穗在體視顯微鏡(laicas6d)下使用尖嘴鑷子(dumont5-antimagetic-e)進行解剖，小心地去掉小麥小穗的外稃、內(nèi)稃和花藥，從盾片上剝離下來子房并去掉柱頭。所獲得的子房浸入無水乙醇中保存。采用這種方法的好處是：使用尖嘴鑷子(dumont5-antimagetic-e)能夠很好地在體視顯微鏡(laicas6d)下操作分離特別微小的小麥子房，避免擠壓扎破小麥子房；經(jīng)過人工分離得到的離體小麥子房可以進行石蠟切片制作和confocal電鏡觀察，在石蠟切片的制作中可以排除其它穗部組織的擠壓；在激光共聚焦顯微鏡下觀察的組織不能太大，只觀察離體小麥子房能夠排除了小麥穗部其它器官和組織對于激光的干擾，能夠更好地操作觀察和采集成像。獲得的子房將分別用來進行石蠟切片和共聚焦觀察。

上述步驟中，所述分子檢測指：采用改良的ctab法提取小麥子房dna進行樣品檢測，參照(gaoetal.，2014)中篩選的基于issr的tck特異性scar分子標(biāo)記引物(gaoli,yuhuixin,hanwensu,gaofei,liutaiguo,liubo,kangxiaohui,gaojiguo,chenwanquan.developmentofascarmarkerformoleculardetectionanddiagnosisoftilletiacontroversakuhn,thecausalfungusofwheatdwarfbunt)，進行常規(guī)pcr擴增，凝膠電泳檢測得到一條大小為372bp片段的樣品植株可以確定為已發(fā)病小麥植株。

石蠟切片的制作：依次將切片放入二甲苯ⅰ20min、二甲苯ⅱ20min、無水乙醇ⅰ10min、無水乙醇ⅱ10min、95％酒精5min、90％酒精5min、80％酒精5min、70％酒精5min處理，再用蒸餾水沖洗。處理過的切片放入1％番紅染液染色1-2h。自來水洗去多余染料。再將切片依次分別放入50％、70％、80％梯度酒精脫色各1min。切片入0.5％固綠染液中染色30-60s。無水乙醇i中脫色30s，無水乙醇ii中脫色1min，再將切片放于60°烤箱烤干后在二甲苯中透明5min，最后使用中性樹膠封片。

共聚焦的觀察：分離的小麥子房先置于10μg/mlpropidiumidodide和0.02％tween20染色20min，再用20μg/mlwga-af488染色20min。最后用1×pbs(ph7.4)沖洗4至6次，最后將染色好的子房保存在pbs溶液中準(zhǔn)備觀察?，F(xiàn)有方法為：分離的小麥子房先置于10μg/mlpropidiumidodide和0.02％tween20染色10min，再用20μg/mlwga-af488染色10min。最后用10×pbs(ph7.4)沖洗3次，最后將染色好的子房保存在pbs溶液中準(zhǔn)備觀察。(現(xiàn)有方法記載在“蔚慧欣、高利等，2016《小麥矮腥黑粉菌在小麥體內(nèi)侵染過程的顯微觀察》一文中)。經(jīng)實驗對比，現(xiàn)有方法與本發(fā)明的方法針對同樣的小麥品種進行采樣、染色、觀察獲得的圖像差別巨大，現(xiàn)有方法并不能滿足清楚準(zhǔn)確地顯示子房內(nèi)部各細(xì)胞的要求，而本發(fā)明的方法能夠清楚地辨別子房內(nèi)部的細(xì)胞形態(tài)和大小，從而便于進一步進行圖像的數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

將染色處理好的子房放置在兩邊用雙面貼加高的載玻片中央處，蓋玻片貼到雙面貼上，避免對于小麥子房的壓迫和損傷。將玻片倒置于激光共聚焦顯微鏡(leica,sp8)下觀察小麥矮腥黑粉菌菌絲的侵染過程。其中，設(shè)定的參數(shù)為wga-af488(gfp)激發(fā)藍(lán)光波長488nm，發(fā)射光波長分別為550nm和550nm。propidiumidodide激發(fā)綠光波長561nm，發(fā)射光波長分別為570nm和730nm。

實驗例、本發(fā)明的方法與現(xiàn)有方法的效果對比

采用蔚慧欣、高利、沈慧敏等，2016《小麥矮腥黑粉菌在小麥體內(nèi)侵染過程的顯微觀察》一文中記載的方法，針對正常小麥植株的子房的染色和處理方法進行觀察，所得的激光共聚焦成像如圖3所示。(圖3表示子房直徑為600μm的小麥子房confocal圖像)所得圖像并不能準(zhǔn)確而清晰地顯示子房內(nèi)部各部分細(xì)胞的輪廓和大小，無法針對圖像進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

采用本試驗的方法針對正常小麥植株的子房的分離、染色和處理方法進行觀察，所得的激光共聚焦成像如圖4所示。(圖4表示子房直徑為680μm的小麥子房confocal圖像)所得圖像能夠清楚地辨別子房內(nèi)部的細(xì)胞形態(tài)和大小，能夠進行圖像的數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

經(jīng)上述對比可知，本發(fā)明的方法不僅能準(zhǔn)確獲得最佳觀察時期的小麥穗部子房細(xì)胞，并能對其進行有效的染色和清楚的觀察，而這些是現(xiàn)有技術(shù)中的方法解決不了的，從獲得清晰準(zhǔn)確的子房細(xì)胞這一角度而言，本發(fā)明的方法相比現(xiàn)有技術(shù)獲得了預(yù)料不到的技術(shù)效果。