本發(fā)明涉及生物分析領(lǐng)域的糖蛋白糖型檢測(cè)樣品前處理方法，特別涉及血漿(或血清)igg2-ab標(biāo)記的糖型檢測(cè)批量前處理方法。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)糖基化是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式。真核細(xì)胞中約有一半的蛋白質(zhì)發(fā)生過(guò)糖基化。蛋白質(zhì)糖基化不僅賦予蛋白質(zhì)特定的理化性質(zhì)(如溶解性和穩(wěn)定性)，更重要的是參與凝血、免疫、細(xì)胞生長(zhǎng)、分泌和信號(hào)傳導(dǎo)等生理活動(dòng)。蛋白質(zhì)糖基化異常與許多疾病密切相關(guān)，比如惡性腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和阿爾茨海默病等。蛋白質(zhì)糖基化也為腫瘤早期診斷和治療提供依據(jù)，絕大多數(shù)臨床用腫瘤標(biāo)記物和蛋白質(zhì)類藥物是糖蛋白。因此，研究蛋白質(zhì)糖基化不僅可以加深對(duì)糖蛋白的生物功能的認(rèn)識(shí)，而且對(duì)探討疾病發(fā)生、發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)記物和開發(fā)新藥具有重要意義。免疫球蛋白(英文全稱，igg)，又稱抗體是一種很重要的糖蛋白，主要分布在血清中。它由兩條相同的分子量較小的輕鏈和兩條分子量較大的重鏈通過(guò)二硫鍵連接而成，抗體的糖鏈位于重鏈fc片段上，為n-連接糖。igg的糖基化對(duì)于調(diào)節(jié)igg的細(xì)胞毒性和抗炎、促炎等炎性潛力非常關(guān)鍵。自身免疫狀態(tài)和igg抗體的特定糖基化模式之間的聯(lián)系已在患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幾自身免疫血管炎的患者中被觀察到，其中已報(bào)道與igg抗體的降低的半乳糖基化和唾液酸化相關(guān)。對(duì)igg糖鏈結(jié)構(gòu)分析已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。陶磊等人(《藥物分析雜志》，2011年第11期)分析igg1型單抗中糖鏈切除對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的影響，結(jié)果表明糖鏈切除后抗體的圓二色譜發(fā)生改變，抗原結(jié)合能力下降，體外cdc活性基本消失。然而糖鏈結(jié)構(gòu)中富含多羥基且基本不含發(fā)色團(tuán)，呈電中性等性質(zhì)，使得糖類分析非常困難、復(fù)雜結(jié)構(gòu)的檢測(cè)更是異常艱難。因此，需要快速、簡(jiǎn)單且精確的方式分析糖鏈結(jié)構(gòu)的技術(shù)，并且通過(guò)各種方法進(jìn)行糖鏈分析。為了進(jìn)行糖鏈分析，必須首先從包含在生物樣品中分離純化糖鏈。一般是將糖蛋白上的糖鏈切掉并分離純化后進(jìn)行分析。因?yàn)樘擎湵旧頉]有發(fā)色基團(tuán)，而且其在質(zhì)譜儀上不易離子化，為了在分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定過(guò)程中能夠更有效地檢測(cè)到糖鏈，一般進(jìn)行柱前衍生的方法。該方法主要是對(duì)糖鏈進(jìn)行標(biāo)記，使糖鏈帶上紫外或熒光基團(tuán)，提高檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)又可以使糖鏈帶上疏水基團(tuán)，降低糖鏈的極性，使糖鏈在反相色譜柱上得到保留，利于糖鏈的分離。目前對(duì)糖鏈進(jìn)行衍生化標(biāo)記的試劑主要包括2-ab標(biāo)記衍生糖鏈的方法。中國(guó)專利申請(qǐng)201410844142.6、發(fā)明名稱“快速全面檢測(cè)單克隆抗體n糖基化位點(diǎn)上寡糖的方法”公開了通過(guò)酶解反應(yīng)切除寡糖，然后使用2-ab溶液標(biāo)記寡糖，純化寡糖后通過(guò)lc-熒光-esi-ms分析。然而，該方法需要通過(guò)氨丙基固相萃取柱進(jìn)行純化，過(guò)柱純化步驟復(fù)雜并且成本較高，因此不適于批處理切除糖鏈和2-ab標(biāo)記及純化。此外，陶磊等人同時(shí)公開了從抗體或蛋白上切除或測(cè)定糖鏈的方法。然而，該方法也需要色譜柱或過(guò)柱純化，導(dǎo)致不能高通量或批處理，因此限制了批處理切除糖鏈和2-ab標(biāo)記及純化。中國(guó)專利申請(qǐng)200610084289.5、發(fā)明名稱“糖鏈切除裝置”公開了用于從堿溶液中切除糖鏈的裝置，包括反應(yīng)槽和分離純化的離子交換柱。然而，該裝置只適于從復(fù)合碳水化合物中切除糖鏈，且整個(gè)裝置包括復(fù)雜的構(gòu)成部件，因此也不適于批處理切除糖鏈和2-ab標(biāo)記及純化。另外，使用2-ab試劑標(biāo)記糖鏈的一般步驟為:(1)通過(guò)糖苷酶從糖蛋白切除糖鏈；(2)對(duì)獲得的糖鏈進(jìn)行純化；(3)2-ab標(biāo)記糖鏈；(4)標(biāo)記后糖鏈的純化，也就是傳統(tǒng)的二步純化法。其中，對(duì)于血清或血漿igg的糖鏈分析，還需igg的分離純化步驟。因此對(duì)于血清(或血漿)igg的糖鏈分析，相當(dāng)于需要進(jìn)行三次糖鏈純化，其中在標(biāo)記之前必須純化糖鏈，否則可能出現(xiàn)雜質(zhì)干擾，導(dǎo)致標(biāo)記不完全，因此二步法存在步驟繁瑣并且可能造成糖鏈產(chǎn)物的損失。同時(shí)，在一些現(xiàn)有技術(shù)中，在酶切前需要更換緩沖液，否則導(dǎo)致切糖酶活性變?nèi)?，切糖不充分，從而不能保證檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度。因此，目前需要一種能夠降低成本、簡(jiǎn)化步驟，且適用批處理切除糖鏈和2-ab標(biāo)記及純化的方法，該方法應(yīng)當(dāng)適用于質(zhì)譜或色譜檢測(cè)用的檢測(cè)平板或微孔板。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明原理之一在于：本發(fā)明不再遵循先純化糖鏈后進(jìn)行標(biāo)記的傳統(tǒng)方法，而是直接進(jìn)行標(biāo)記后再進(jìn)行純化。由于相對(duì)于昂貴的抗體及其糖鏈樣品而言，2-ab試劑更為廉價(jià)，因此在確保切除的糖鏈充分被2-ab試劑標(biāo)記后再進(jìn)行純化，能夠有效提高標(biāo)記效率和產(chǎn)率。本發(fā)明原理之二在于：在進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，為了糖鏈混合物中的雜質(zhì)影響標(biāo)記，通過(guò)優(yōu)化標(biāo)記反應(yīng)參數(shù)，盡可能使得標(biāo)記效率達(dá)到或基本達(dá)到常規(guī)的純化環(huán)境中的標(biāo)記效率，從而通過(guò)因取消純化糖鏈步驟而客觀上提高或基本提高糖鏈的標(biāo)記效率。本發(fā)明原理之三在于：通過(guò)摸索2-ab與氰基硼氫化鈉的配比，選擇最適的配比，從而在保證足夠的標(biāo)記效率的情況下，減少熒光劑的使用，有效減少了成本。本發(fā)明原理之四在于：還可聯(lián)合使用已有的proteing提取板，對(duì)血漿(或血清)igg進(jìn)行快速純化和高效分離，從而能夠?qū)崿F(xiàn)快速、高通量的批處理過(guò)程。因此，本發(fā)明目的是提供一種從血漿或血清的igg上批處理切除糖鏈和純化的方法，步驟包括：(1)igg提?。和ㄟ^(guò)96孔proteing提取板將血漿或血清igg提取至2ml96孔收集板中，測(cè)定蛋白濃度后，取出250-350μligg溶液或120-180μgigg于1.1ml96孔深孔板中整板揮干；(2)igg切糖：在深孔板中加入變性劑變性蛋白后調(diào)節(jié)溶液ph至8.0，加入糖苷酶或切糖酶進(jìn)行切除糖鏈；(3)糖鏈標(biāo)記：在揮干的深孔板中加入2-ab標(biāo)記溶液，65℃反應(yīng)3小時(shí)，進(jìn)行2-ab標(biāo)記；(4)標(biāo)記后純化：深孔板加入乙腈溶液，上清液轉(zhuǎn)移至96孔糖鏈純化板，除去多余的標(biāo)記試劑，在深孔板中收集洗脫出的被標(biāo)記糖鏈，整板揮干；其中，步驟2)中變性劑為sds溶液，并在60℃變性反應(yīng)10min，或變性劑為igepal溶液，并在室溫變性反應(yīng)10分鐘；以及加入的糖苷酶或切糖酶的質(zhì)量g與蛋白質(zhì)的質(zhì)量g比約1:50～1:30；步驟3)中，每孔加入的標(biāo)記溶液為0.5mg的2-ab和1.2mg的氰基硼氫化鈉，并且所述2-ab和氰基硼氫化鈉預(yù)先配制在含30％乙酸的dmso溶液中；步驟4)中，去除多余標(biāo)記試劑所用清洗液為96％的乙腈溶液，洗脫標(biāo)記的糖鏈為超純水。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟1)中還包括igg提取板前處理、igg結(jié)合和清洗、igg洗脫、igg提取板再生和保護(hù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述igg提取板前處理方法為：①用2毫升超純水清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；②用2毫升1×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；③用1毫升0.1m甲酸溶液清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；④用2毫升10×pbs進(jìn)行板子的中和-真空泵抽濾，去除廢液；⑤用4毫升1×pbs平衡板子-真空泵抽濾，去除廢液。在另一具體實(shí)施方案中，所述igg結(jié)合和清洗方法為：用2毫升1×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液。再重復(fù)2次。在其他具體實(shí)施方案中，所述igg洗脫的方法為：①用1毫升0.1m甲酸溶液洗脫igg-真空泵抽濾，收集洗脫液；②向收集板中加入170μl中和緩沖液，并用槍頭混勻；③用錫箔紙將收集板蓋好，放在震蕩器輕微搖晃，避免交叉污染，直至檢測(cè)樣品濃度。④在其他具體實(shí)施方案中，所述igg提取板再生和保護(hù)的方法為：⑤用2毫升0.1m甲酸溶液清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；⑥用2毫升10×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；⑦用4毫升1×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；⑧加入1毫升-真空泵抽濾，去除廢液，其中存儲(chǔ)緩沖液為20％乙醇溶于20mmtris+0.1mnacl；⑨加入1毫升存儲(chǔ)緩沖液，4℃保存。上述20％乙醇配制為20ml無(wú)水乙醇與80ml水混合而成。在另一實(shí)施方案中，步驟1)中血漿或血清樣本量為50μl，使用前用1×pbs(ph7.4)稀釋7倍，proteing提取板為96孔proteing提取板，igg收集為96孔收集板；蛋白濃度測(cè)定所用儀器為nano-drop蛋白濃度測(cè)定儀，測(cè)定波長(zhǎng)為280nm，igg的摩爾吸光系數(shù)值為2.534×105。在另外實(shí)施方案中，步驟(2)中，sds溶液濃度為1.33％，igepal溶液濃度為為10％，ph調(diào)節(jié)劑為0.1mnaoh和5×pbs的混合液，加入的切糖酶為pngasef酶，所述igepal為(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇-辛基苯基-聚乙烯二醇。還在其他的實(shí)施方案中，步驟(4)中，純化標(biāo)記后的糖鏈的純化板為0.22μm的親水性96孔板，純化過(guò)程包括清洗、洗脫過(guò)程，其中，清洗過(guò)程包括：①每個(gè)樣品中加入700μl100％乙腈，用槍頭混勻并全部(含75μl樣品和700μl乙腈)轉(zhuǎn)移到純化板中，孵育兩分鐘。真空泵抽濾，去除廢液；②在純化板的每個(gè)孔中加入200μl96％乙腈-真空泵抽濾，去除廢液，重復(fù)四次；③將純化板放在1毫升或2毫升收集板上，每個(gè)孔中加入200μl96％乙腈；④1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。其中，洗脫過(guò)程包括：①每個(gè)孔中加入100μl超純水，震蕩15分鐘；②用真空抽濾法，將第一次洗脫液收集到pcr板中，重復(fù)一次；③每個(gè)孔中加入100μl超純水，震蕩15分鐘；④純化板離心5分鐘，1000轉(zhuǎn)/分鐘，將第三次洗脫液收集到pcr板中；⑤合并三次洗脫液，揮干后于-20℃保存。在上述任一實(shí)施方案中，其中步驟4中還包括純化板預(yù)處理過(guò)程，包括：①在純化板的每個(gè)孔中加入200μl70％乙醇-真空泵抽濾，去除廢液；②在純化板的每個(gè)孔中加入200μl超純水-真空泵抽濾，去除廢液；③在純化板的每個(gè)孔中加入200μl96％乙腈-真空泵抽濾，去除廢液。在上述任一實(shí)施方案中，所述任一的加樣、洗脫、清洗等過(guò)程，均可使用thermoscientific儀器公司聯(lián)排、多孔加樣槍(型號(hào)：e1-cliptipeq8-ch15-125050，序列號(hào)：mh69055)及其配套槍頭(型號(hào)：clintip1250，序列號(hào)：94410817)。有益效果1、與傳統(tǒng)的單個(gè)糖蛋白(igg)樣品進(jìn)行igg切糖-糖鏈純化-2-ab標(biāo)記糖鏈-標(biāo)記后糖鏈純化步驟相比，本發(fā)明在2-ab前省去了糖鏈的純化步驟，大大縮減了樣品前處理時(shí)間，還節(jié)約了成本，并且本方法能同時(shí)快速高效地處理96份血漿(或血清)樣品，具有高通量特性。2、本發(fā)明通過(guò)比對(duì)分析，確定了280nm下抗體的測(cè)定濃度的摩爾吸光系數(shù)為2.534×105。該系數(shù)能夠?qū)?yīng)于最適的抗體濃度，從而保障后續(xù)的糖鏈純化過(guò)程。3、本發(fā)明通過(guò)比對(duì)分析，確定了糖鏈標(biāo)記2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比為2-ab:氰基硼氫化鈉＝0.5mg:1.2mg。術(shù)語(yǔ)和解釋術(shù)語(yǔ)“摩爾吸光系數(shù)”，表示液層厚度為1cm的單位濃度溶液，對(duì)一定波長(zhǎng)的光的吸光度.表示某物質(zhì)對(duì)特定波長(zhǎng)光的吸收能力。單位是：l/(mol*cm)，其中，朗伯-比爾吸收定律：a＝kbca是物質(zhì)對(duì)光的吸收程度——吸光度；k是摩爾吸光系數(shù)；b是比色皿的厚度；c是待測(cè)溶液的濃度；當(dāng)知道以上的兩個(gè)條件(摩爾吸光系數(shù)已知的情況下)的時(shí)候，就可求出另一個(gè)數(shù)。在測(cè)定蛋白濃度時(shí)，nano-drop的比色皿厚度已知，吸光度a(280nm)由儀器自動(dòng)讀出，確定抗體的摩爾吸光系數(shù)后就能對(duì)抗體濃度進(jìn)行測(cè)定。因此，抗體的摩爾吸光系數(shù)準(zhǔn)確性直接關(guān)系抗體濃度的準(zhǔn)確性。已知的280nm下蛋白的摩爾吸光系數(shù)由蛋白中個(gè)別存在吸光度的氨基酸貢獻(xiàn)而得。其公式為：k280＝5500*[trpresidues]+1490*[tyrresidues]+125*[cystine(disulfidebond)]。本發(fā)明采用輕鏈(序列長(zhǎng)度236，來(lái)源prt數(shù)據(jù)庫(kù))和重鏈(序列長(zhǎng)度469，來(lái)源prt數(shù)據(jù)庫(kù))的序列計(jì)算出trp、tyr和cys的個(gè)數(shù)分別為15、29和16，因抗體為雙鏈結(jié)構(gòu)，trp、tyr和二硫鍵的個(gè)數(shù)分別為30、58和16。帶入上述公式得出k280的摩爾吸光系數(shù)為2.534×105。術(shù)語(yǔ)“igg提取板再生和保護(hù)”，指是為了重復(fù)利用igg提取板，對(duì)提取板進(jìn)行再生和保護(hù)。已知實(shí)驗(yàn)室已重復(fù)利用約10次左右仍然有效，這樣可以降低實(shí)驗(yàn)成本。附圖說(shuō)明圖1.血漿(或血清)igg2-ab標(biāo)記的糖型檢測(cè)批量前處理方法的操作流程示意圖圖2.uplc檢測(cè)2-ab標(biāo)記糖鏈的檢測(cè)結(jié)果圖3.lc-ms/ms測(cè)定人血igg糖型圖譜具體實(shí)施方法下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。實(shí)施例一、實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)所用儀器：(1)本發(fā)明的方法需使用與96孔igg提取板和96孔糖鏈純化板相匹配的負(fù)壓泵或正壓泵(推薦使用waters負(fù)壓泵)、真空濃縮儀(可96孔板整板揮干)，對(duì)于本發(fā)明處理的糖鏈的檢測(cè)可使用(1)配備熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀，其中，96孔proteing提取板為biaseparations公司，貨號(hào)no:2375，96孔收集板為axygen公司，貨號(hào)：p-dw-20-c)板，96孔深孔板為axygen公司，貨號(hào)：p-dw-11-c。(2)與配備熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀相連的、具有esi離子源的高分辨質(zhì)譜儀。(3)maldi-tof質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟：(一)血漿(或血清)igg的提取純化步驟如下：1、igg提取板前處理①用2毫升超純水清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；②用2毫升1×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；③用1毫升0.1m甲酸溶液清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；④用2毫升10×pbs進(jìn)行板子的中和-真空泵抽濾，去除廢液；⑤用4毫升1×pbs平衡板子-真空泵抽濾，去除廢液。(二)igg結(jié)合和清洗①血漿(或血清)樣本量為50μl，用1×pbs(ph7.4)稀釋7倍后加入igg提取板；②用2毫升1×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液，③再重復(fù)2次。(三)igg洗脫①用1毫升0.1m甲酸溶液洗脫igg-真空泵抽濾，收集洗脫液；②向收集板中加入170μl中和緩沖液，并用槍頭混勻；③放在震蕩器輕微搖晃，避免交叉污染，直至檢測(cè)樣品濃度；④震蕩結(jié)束后用nanodrop蛋白濃度測(cè)定儀進(jìn)行蛋白定量，其中測(cè)定波長(zhǎng)為280nm，igg的摩爾吸光系數(shù)值設(shè)為2.534×105，之后用錫箔紙蓋好。(四)igg提取板再生和保護(hù)①用2毫升0.1m甲酸溶液清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；②用2毫升10×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；③用4毫升1×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；④加入1毫升存儲(chǔ)緩沖液(20％乙醇溶于20mmtris+0.1mnacl)-真空泵抽濾，去除廢液；⑤加入1毫升存儲(chǔ)緩沖液(20％乙醇溶于20mmtris+0.1mnacl)，4℃保存。(五)igg切除糖鏈①每孔取1.3.4的igg溶液300μl(約150μg)整板揮干，每孔加入1.33％sds30μl，60℃反應(yīng)10min。冷卻至室溫后，每孔加入10％igepal10μl，室溫反應(yīng)10min；②每孔加入20μl0.1mnaoh溶液和5×pbs溶液15μl調(diào)劑2.1溶液的ph約為7.8左右，震蕩混勻，加入pngasef酶(酶與蛋白質(zhì)量比約1:50～1:30)，37℃反應(yīng)18小時(shí)；③切糖結(jié)束后，將整板溶液進(jìn)行揮干，-20℃保存。(六)2-ab標(biāo)記糖鏈①標(biāo)記前配置標(biāo)記溶液，將醋酸加入dmso配制成30％醋酸溶液，然后將醋酸/dmso混合液加入2-ab中，混勻至完全溶解，再將上述溶液加入pb，混勻至完全溶解。每個(gè)樣本糖鏈標(biāo)記過(guò)程中2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比為2-ab:氰基硼氫化鈉＝0.5mg:1.2mg。②每個(gè)樣品中加入25μl標(biāo)記試劑，用槍頭混勻。將板子用密封膜封好，放在震蕩器上震蕩10分鐘。將板子放入烤箱，65℃，反應(yīng)3小時(shí)。(七)標(biāo)記后糖鏈的純化①純化板預(yù)處理；②純化板的每個(gè)孔中加入200μl70％乙醇-真空泵抽濾，去除廢液；③純化板的每個(gè)孔中加入200μl70％乙醇-真空泵抽濾，去除廢液；④純化板的每個(gè)孔中加入200μl超純水-真空泵抽濾，去除廢液；⑤純化板的每個(gè)孔中加入200μl96％乙腈-真空泵抽濾，去除廢液。(八)清洗糖鏈(去除雜質(zhì))①每個(gè)樣品中加入700μl100％乙腈，用槍頭混勻并全部(含75μl樣品和700μl乙腈)轉(zhuǎn)移到純化板中，孵育兩分鐘，真空泵抽濾，去除廢液；②在純化板的每個(gè)孔中加入200μl96％乙腈-真空泵抽濾，去除廢液；③重復(fù)四次；④將純化板放在1毫升或2毫升收集板上，每個(gè)孔中加入200μl96％乙腈，真空泵抽濾，去除廢液。1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。(九)糖鏈洗脫①每個(gè)孔中加入100μl超純水，震蕩15分鐘；②真空抽濾將第一次洗脫液收集到pcr板1中；每個(gè)孔中加入100μl超純水，震蕩15分鐘；③真空抽濾將第二次洗脫液收集到pcr板2中；每個(gè)孔中加入100μl超純水，震蕩15分鐘；④純化板離心5分鐘，1000轉(zhuǎn)/分鐘，將第三次洗脫液收集到pcr板中；⑤合并三次洗脫液，揮干后于-20℃保存。實(shí)施例二、lc法確定2-ab標(biāo)記糖鏈法的試劑的最適配比選用標(biāo)準(zhǔn)抗體樣品mab(waters公司，貨號(hào)：186006552，批號(hào)：w26081603)，對(duì)該抗體用水溶解，配成濃度為5mg/ml，每管取抗體溶液40μl(igg200μg)，共兩管，揮干樣本，進(jìn)行相同的變性和切糖實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)方法見實(shí)施例一)。切糖后溶液揮干，考察2-ab標(biāo)記糖鏈的標(biāo)記效果。配方1按照2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比(質(zhì)量比)5mg:12mg配置總體積為250為氫的配比關(guān)系進(jìn)行配置2-ab溶液。配方2按照2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比(質(zhì)量比)5mg:6mg配置總體積為1000為的配比關(guān)系進(jìn)行配置2-ab溶液。實(shí)際配置中根據(jù)樣本個(gè)數(shù)(每個(gè)樣本需加入25μl標(biāo)記試劑)優(yōu)先計(jì)算好所需的2-ab和氰基硼氫化鈉質(zhì)量，然后按比例進(jìn)行配置。配置標(biāo)記溶液，先將醋酸加入dmso配制成30％醋酸溶液，然后將醋酸/dmso混合液加入2-ab中，混勻至完全溶解，再將上述溶液加入pb，混勻至完全溶解。每個(gè)樣本需加入25μl2-ab標(biāo)記溶液，相當(dāng)于配方1中每個(gè)樣本2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比(質(zhì)量比)0.5mg:1.2mg，而配方2中每個(gè)樣本2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比(質(zhì)量比)為1.25mg:1.5mg。其中，含有2-ab的標(biāo)記溶液的組分如表1所示。配方12-ab(mg)nabh3cn(mg)乙酸(μl)dmso(μl)總體積(μl)加入比例51275175250每個(gè)樣本0.51.225配方22-ab(mg)nabh3cn(mg)乙酸(μl)dmso(μl)總體積(μl)加入比例563070100每個(gè)樣本1.251.525兩管樣本被標(biāo)記后純化實(shí)驗(yàn)參見實(shí)施例1。樣品uplc檢測(cè)：經(jīng)標(biāo)記純化的標(biāo)準(zhǔn)mab的糖鏈樣品用20μl50％acn水溶液進(jìn)行重溶，上樣10μl。uplc儀器型號(hào)：acquityuplch-class(waters公司)流動(dòng)相：a相：50mm甲酰銨(hcoonh4)；b相：100％乙腈(acn)；流速：0.4ml/min，梯度：25％～38％～90％～90％～25％～25％a；0min～20.0min～22min～25min～26min～30min。色譜柱：acquityuplcbehamidecolumn(1.7μm，2.1mmx150mm)；柱溫：60℃。熒光檢測(cè)器檢測(cè)條件：激發(fā)波長(zhǎng):330nm；發(fā)射波長(zhǎng):420nm檢測(cè)結(jié)果如圖2，藍(lán)色(圖2上圖)所示為按配方1配置2-ab試劑的檢測(cè)結(jié)果，紅色(圖2下圖)所示為按配方2配置2-ab試劑的檢測(cè)結(jié)果。比較這兩組結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1、圖中糖鏈色譜峰出峰個(gè)數(shù)與出峰時(shí)間一致，表明兩種方法配置的2-ab溶液標(biāo)記糖鏈時(shí)不存在漏標(biāo)現(xiàn)象；2、這兩組結(jié)果各糖鏈色譜峰的相對(duì)峰強(qiáng)一致，而絕對(duì)強(qiáng)度配方2僅僅略高不到10個(gè)單位(即上圖下圖強(qiáng)度低不足10左右)，并沒有使色譜峰強(qiáng)度提高很多，表明按配方1標(biāo)記糖鏈糖鏈已基本標(biāo)記完全。3、由于配方2加強(qiáng)了熒光劑2-ab的使用量，其標(biāo)記的效果通常預(yù)料到其應(yīng)當(dāng)顯著高于配方1。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在大幅度減少熒光劑的比例的情況下，配方1也能實(shí)現(xiàn)完全標(biāo)記，并且色譜峰強(qiáng)度與配方2沒有明顯區(qū)別。因此綜合考慮標(biāo)記效果和實(shí)驗(yàn)成本問題，優(yōu)先考慮配方1配置2-ab標(biāo)記試劑，即按每個(gè)樣本2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比(質(zhì)量比)0.5mg:1.2mg進(jìn)行2-ab標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例三、lc-ms/ms鑒定血漿(血清)igg糖鏈將實(shí)施例1所制備的人血漿igg2-ab標(biāo)記糖鏈進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms檢測(cè)，其中可按實(shí)施例1進(jìn)行人血漿(血清)樣品糖基前處理后。采用的實(shí)驗(yàn)條件如下：lc系統(tǒng)：acquityuplch-class(waters公司)。流動(dòng)相：a相：50mmhcoonh4；b相：100％acn。流速：0.4ml/min，梯度：25％～46％～100％～100％～25％～25％～25％a；0min～35.0min～36.5min～39.5min～43.1min～47.6min～55min。色譜柱：acquityuplcbehamidecolumn(1.7μm，2.1mmx150mm)；柱溫：60℃。熒光檢測(cè)器檢測(cè)條件：激發(fā)波長(zhǎng):330nm；發(fā)射波長(zhǎng):420nm。質(zhì)譜系統(tǒng)：高分辨質(zhì)譜synaptg2-s(waters公司)。源溫：120℃，毛細(xì)管電壓：3.0kv，錐孔電壓：80v，掃描范圍m/z：300～2000。數(shù)據(jù)處理軟件：unifi1.8，標(biāo)記：2-ab，數(shù)據(jù)庫(kù)：humanigg。經(jīng)標(biāo)記純化的糖鏈樣品用20μl50％acn水溶液進(jìn)行重溶，上樣10μl。經(jīng)lc分離得到的色譜峰在高分辨質(zhì)譜中進(jìn)行ms及ms/ms分析，所得的液相及質(zhì)譜數(shù)據(jù)用waters儀器自帶的unifi軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行搜庫(kù)檢索，設(shè)置糖鏈的標(biāo)記方式為2-ab標(biāo)記，數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源類型選hunanigg，m/z值匹配誤差設(shè)置為10ppm，gu值匹配誤差設(shè)置為0.2。經(jīng)unifi軟件處理得出人血漿igg糖鏈的分析鑒定結(jié)果如圖3所示。由圖3可知幾乎每個(gè)糖鏈色譜峰都得到了糖型歸屬。具體的糖鏈歸屬結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，共鑒定出51種糖型，其中保留時(shí)間為12.14min的f(6)a2這種糖型百分含量最高，百分占比為22.63；保留時(shí)間為14.81min的f(6)a2[6]g(4)1和17.79min的f(6)a2g這兩種含半乳糖的糖型的百分含量分別為第二高和第三高，百分占比分別為20.05和15.35。而唾液酸化(s表示唾液酸)的糖型占比超過(guò)25％，其他糖型的百分含量不再贅述(詳見表2)。表2lc-ms/ms鑒定人血漿igg糖型結(jié)果igg抗體糖鏈的半乳糖糖基化和唾液酸化通常是學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)，本實(shí)例結(jié)果表明，經(jīng)具體實(shí)施例1制備的igg糖鏈半乳糖糖基化和唾液酸化損失較少，樣本前處理方法可靠。經(jīng)上述檢測(cè)后，每個(gè)樣品均會(huì)得出血漿(或血清)igg經(jīng)2-ab標(biāo)記的糖鏈的質(zhì)譜定性和色譜定量結(jié)果。根據(jù)不同的樣本分組，對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)而得出血漿(或血清)igg某個(gè)(或某些)糖型跟疾病或或某種狀態(tài)之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，協(xié)助闡明血漿(或血清)igg某個(gè)(或某些)糖型差異跟疾病或或某種狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)。當(dāng)前第1頁(yè)12