本發(fā)明涉及中藥指紋圖譜的構(gòu)建方法，特別涉及一種千年健指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

背景技術(shù)：

中藥指紋圖譜特指某種中藥材或中成藥所共有的、具有特征性的某類(lèi)或數(shù)類(lèi)成分的色譜或光譜的圖譜。中藥指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的質(zhì)量控制手段，可提供比單一指標(biāo)成分更全面的信息。目前，fda、英國(guó)草藥典、印度草藥典、德國(guó)藥用植物學(xué)會(huì)、加拿大藥用植物學(xué)會(huì)等均接受指紋圖譜的質(zhì)控方法，中國(guó)藥品監(jiān)督管理局也頒布了《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》。在現(xiàn)階段中藥有效成分絕大多數(shù)沒(méi)有明確的情況下，中藥指紋圖譜對(duì)于有效控制和評(píng)價(jià)中藥材或中成藥的質(zhì)量具有重要的意義。中藥指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)成為牽動(dòng)行業(yè)全面進(jìn)步、帶動(dòng)中藥現(xiàn)代化、推動(dòng)中藥走向世界的關(guān)鍵技術(shù)之一。

千年健為天南星科植物千年健homalomenaocculta(lour.)schott的干燥根莖，又名千顆針、絲棱線。產(chǎn)于廣西、云南等地，具有祛風(fēng)濕，壯筋骨之功效，臨床常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。千年健含大量揮發(fā)油成分，2015年版中國(guó)藥典一部規(guī)定用千年健中含芳樟醇的含量(不少于0.2％)來(lái)控制千年健藥材的質(zhì)量，但此單指標(biāo)成分的質(zhì)量控制不能全面的評(píng)價(jià)藥材的優(yōu)劣。中藥指紋圖譜是控制天然藥物質(zhì)量的有效方式之一。指紋圖譜全面整體地反映了藥材的內(nèi)在質(zhì)量，能為中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供一個(gè)有效的參考方法。全面、系統(tǒng)而又特征地指紋圖譜有利于全方位地控制中藥質(zhì)量并與國(guó)際接軌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的上述不足，提供一種符合千年健藥材特點(diǎn)的指紋圖譜構(gòu)建方法。該指紋圖譜構(gòu)建方法前處理簡(jiǎn)單，所得圖譜中各峰分離度佳，構(gòu)成了千年健藥材的指紋特征，可作為千年健藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

一種千年健指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

s1、供試品溶液的制備：精密稱(chēng)取千年健粉末，加入甲醇后超聲提取，靜置冷卻，用甲醇補(bǔ)足失重，離心，取上清液蒸發(fā)干燥，殘?jiān)蛹状紡?fù)溶，渦旋，過(guò)濾，取續(xù)濾液，所得溶液即為供試品溶液；

s2、供試品溶液的測(cè)定：吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法采用梯度洗脫進(jìn)行測(cè)定，得到千年健的指紋圖譜；

其中，高效液相色譜的色譜條件為：色譜柱的填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相a為乙腈，流動(dòng)相b為磷酸水溶液，流動(dòng)相中a與b的體積比隨時(shí)間逐漸增加；檢測(cè)波長(zhǎng)為285～305nm；

梯度洗脫的程序是：

0～10分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝2.5:97.5；

10～20分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝2.5：97.5～3：97；

20～35分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝3：97～5：95；

35～40分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝5：95～8：92；

40～50分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝8：92～10∶90；

50～60分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝10∶90～14：86；

60～80分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝14：86～15：85；

80～90分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝15：85～20：80；

90～110分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝20：80～30：70；

梯度洗脫過(guò)程中，流速為0.5～1.0毫升/分鐘，梯度洗脫程序中的比例均為體積比。

根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，步驟s1中千年健粉末全部能夠通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥典篩三號(hào)篩。

根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，步驟s1中超聲提取的時(shí)間為30分鐘。

根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，步驟s1中過(guò)濾為用0.45μm有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾。

根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，高效液相色譜的色譜柱采用phenomenexc18色譜柱，規(guī)格為250mm×4.6mm×5μm。

根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，高效液相色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm。

根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，高效液相色譜分析的柱溫為25℃～45℃。

根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，高效液相色譜分析的柱溫為30℃。

根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，梯度洗脫的流動(dòng)相的流速為0～10分鐘流速為0.5毫升/分鐘，10～110分鐘流速為1毫升/分鐘。

根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，流動(dòng)相b為體積分?jǐn)?shù)為0.01％的磷酸水溶液。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種千年健的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，所述千年健的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜有11個(gè)共有峰，其中以4號(hào)峰為參照峰，各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分別如下：

相對(duì)保留時(shí)間：

1號(hào)峰：0.4630～0.5203，2號(hào)峰：0.5818～0.6321；

3號(hào)峰：0.7778～0.8663，4號(hào)峰：1.0000；

5號(hào)峰：1.2414～1.3366，6號(hào)峰：2.0336～2.2459；

7號(hào)峰：2.8514～3.2557，8號(hào)峰：4.8665～5.4458；

9號(hào)峰：6.0079～7.0212，10號(hào)峰：8.9389～10.0941；

11號(hào)峰：9.0958～10.2898；

相對(duì)峰面積：

1號(hào)峰：0.7009～0.8801；2號(hào)峰：0.2832～0.4267；

3號(hào)峰：0.1334～0.1786；4號(hào)峰：1.0000；

5號(hào)峰：0.1623～0.3051；6號(hào)峰：0.4014～2.0643；

7號(hào)峰：0.1332～0.2106；8號(hào)峰：0.1088～0.1687；

9號(hào)峰：0.1616～0.2553；10號(hào)峰：1.5681～2.8527；

11號(hào)峰：0.3848～0.6889。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明提供的千年健指紋圖譜的構(gòu)建方法，確認(rèn)了千年健藥材11個(gè)共有特征指紋峰，并對(duì)其相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行了研究，保證了千年健原材料質(zhì)量的穩(wěn)定性。

2、本發(fā)明建立的千年健標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜代表著千年健藥材大部分藥理活性，能有效地表征千年健藥材的質(zhì)量，為千年健藥材的鑒別、質(zhì)量控制提供了一定的參考依據(jù)，對(duì)千年健藥材的全面質(zhì)量控制具有重要的意義，也為不同廠家千年健藥材的質(zhì)量分析提供了新的科學(xué)依據(jù)。

3、本發(fā)明提供的千年健指紋圖譜的構(gòu)建方法具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠用于千年健藥材的綜合質(zhì)量控制。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中10批次千年健藥材的hplc指紋圖譜。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中千年健藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜r。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合試驗(yàn)例及具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

千年健指紋圖譜的構(gòu)建

1.主要儀器與試劑：waterse2695高效液相色譜儀，waters2998pda檢測(cè)器，empower3色譜數(shù)據(jù)工作站(購(gòu)自美國(guó)waters公司)；bp211d型十萬(wàn)分之一電子分析天平(購(gòu)自德國(guó)sartorius公司)；優(yōu)普系列純水系統(tǒng)(購(gòu)自成都超純科技有限公司)；kq-500db型數(shù)控超聲波清洗器(購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)藥典篩(購(gòu)自浙江紹興市不銹鋼篩廠)；10批次不同廠家提供的千年健藥材(見(jiàn)下表1)，均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)蔣桂華教授鑒定為天南星科植物千年健homalomenaocculta(lour.)schott的干燥根莖；甲醇、乙腈均為色譜純(購(gòu)自dikma公司)，磷酸為分析純(購(gòu)自成都科龍化工試劑廠)，試驗(yàn)用水為超純水。

表110批不同廠家千年健藥材信息表

2、實(shí)驗(yàn)方法

供試品溶液的制備：精密稱(chēng)取千年健藥材粉末過(guò)三號(hào)篩2.00g，置于10ml容量瓶中，加甲醇8ml，超聲提取30min，靜置冷卻，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，離心，取上清液蒸發(fā)干燥，殘?jiān)?ml甲醇復(fù)溶，渦旋30s后用0.45μmpvdf微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，所得溶液即為供試品溶液。

供試品溶液的測(cè)定：色譜條件為采用phenomenexgemini110ac18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：a相為乙腈，b相為體積分?jǐn)?shù)為0.01％的磷酸水溶液。柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)290nm，色譜流動(dòng)相洗脫梯度程序?yàn)椋?～10分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝2.5:97.5；10～20分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝2.5：97.5～3：97；20～35分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝3：97～5：95；35～40分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝5：95～8：92；40～50分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝8：92～10∶90；50～60分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝10∶90～14：86；60～80分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝14：86～15：85；80～90分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝15：85～20：80；90～110分鐘時(shí)，流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b＝20：80～30：70；上述梯度洗脫程序的各步驟中，流速為0～10分鐘流速為0.5毫升/分鐘，10～110分鐘流速為1毫升/分鐘，上述流動(dòng)相的比例均為體積比。在上述條件下精密量取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，得到千年健藥材的指紋圖譜。

3、方法學(xué)研究

3.1精密度試驗(yàn)：稱(chēng)取千年健藥材藥品(表1中編號(hào)8樣品)，按上述實(shí)驗(yàn)方法制備供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間rsd均小于2.56％，相對(duì)峰面積rsd均小于1.46％；將同一供試品連續(xù)進(jìn)樣6次得到的色譜圖進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示其相似度均大于0.980，表明儀器精密度良好。

3.2重復(fù)性試驗(yàn)：稱(chēng)取千年健藥材藥品(表1中編號(hào)8樣品)6份，分別按照上述實(shí)驗(yàn)方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間rsd均小于2.26％，相對(duì)峰面積rsd均小于2.85％。將得到的色譜圖導(dǎo)入分析軟件進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示其相似度均大于0.990，表明構(gòu)建方法重復(fù)性良好。

3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)：取千年健藥材藥品(表1中編號(hào)8樣品)，按上述實(shí)驗(yàn)方法制備供試品溶液，分別于0h、3h、6h、9h、12h、24h按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。試驗(yàn)結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間rsd均小于3.00％，相對(duì)峰面積rsd均小于2.18％。將得到的色譜圖導(dǎo)入分析軟件進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示其相似度均大于0.980，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

以上方法學(xué)考察表明：目前建立的指紋圖譜操作方法可行，適合千年健藥材指紋圖譜的建立和分析。

千年健藥材對(duì)照?qǐng)D譜的建立

取不同批次千年健藥材共10批(樣品詳情見(jiàn)表1)，分別按照已建立的千年健指紋圖譜分析方法進(jìn)行分析，得到各批藥材的hplc(高效液相色譜)指紋圖譜(見(jiàn)附圖1)。

上述10批千年健藥材，經(jīng)專(zhuān)家鑒定質(zhì)量合格，且為相互獨(dú)立的藥材樣本，可作為代表性樣品。因此以上述10批次樣品的色譜指紋圖譜為基礎(chǔ)，使用藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004a版)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得到共有模式指紋圖譜，即為千年健標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜r(見(jiàn)附圖2)。

通過(guò)比較10批藥材的色譜圖，確定了11個(gè)共有峰。在標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，以4號(hào)峰為參照峰s峰，計(jì)算10批千年健藥材指紋圖譜各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表210批樣品共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間

表310批樣品共有指紋峰相對(duì)峰面積

借助《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004a版)對(duì)10批樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算10批千年健藥材和對(duì)照指紋圖譜之間的相似度，除s4和s10與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.492和0.624外，其余廠家千年健樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均在0.887～0.988之間，其中s1、s2、s3、s7與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度高達(dá)0.95以上，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4各批藥材與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度

以上研究表明本發(fā)明提供的千年健指紋圖譜的構(gòu)建方法具有良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，有良好的實(shí)用性，能夠用于千年健的綜合質(zhì)量控制。