本發(fā)明涉及柱[5]芳烴在分子檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其涉及柱[5]芳烴為分子傳感器在純水相中比色-熒光專(zhuān)一性識(shí)別甲硫氨酸的應(yīng)用，屬于分子檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

甲硫氨酸，是構(gòu)成人體的必需氨基酸之一，參與蛋白質(zhì)合成，是含硫必需氨基酸，生物體必須將d-型在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為l-型才能被機(jī)體利用。與生物體內(nèi)各種含硫化合物的代謝密切相關(guān)。在生物體內(nèi)先從atp接受腺苷基變成s-腺苷酰甲硫氨酸（活性甲硫氨酸）再進(jìn)行甲基轉(zhuǎn)移。失去甲基的同型半胱氨酸經(jīng)胱硫醚變成半胱氨酸。當(dāng)缺乏蛋氨酸時(shí)，會(huì)引起食欲減退、生長(zhǎng)減緩或不增加體重、腎臟腫大和肝臟鐵堆積等現(xiàn)象，最后導(dǎo)致肝壞死或纖維化。所以，甲硫氨酸在生命過(guò)程中扮演著重要的角色。

對(duì)于氨基酸的檢測(cè)方法，之前有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，例如，高效液相色譜法，分光光度法，電化學(xué)法，質(zhì)譜分析法，毛細(xì)管電泳法等等。然而對(duì)甲硫氨酸檢測(cè)的方法卻報(bào)道很少。甲硫氨酸是α-氨基酸的一種，在它的分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)堿性基團(tuán)（-nh2）和一個(gè)酸性基團(tuán)（-cooh），因而是兩性的。在強(qiáng)酸性溶液中它是以陽(yáng)離子形式存在，而在強(qiáng)堿性溶液中是以陰離子形式存在的，在等電點(diǎn)處結(jié)晶出來(lái)，即當(dāng)加酸或加堿至羧基和氨基的離子化程度相等時(shí)，溶液的ph值為它的等電點(diǎn)。甲硫氨酸的等電點(diǎn)為5.74，由于這些性質(zhì)，所以甲硫氨酸雖然是有機(jī)物，但它具有無(wú)機(jī)物的某些屬性，如它可以溶于水，但難溶于非極性物質(zhì)，有相當(dāng)高的熔點(diǎn)，其水溶液性質(zhì)與具有高偶極矩的水溶液相似等等。目前，純水相中進(jìn)行識(shí)別甲硫氨酸的方法報(bào)道特別少，大部分識(shí)別檢測(cè)都是在有機(jī)溶液里。而水是生物生理活動(dòng)和日常生活中必不可少的溶液，因此在純水相中檢測(cè)識(shí)別是非常重要的。

柱芳烴，一種在苯環(huán)的2,5位用亞甲基橋連的新型大環(huán)分子，自從2008年首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)已經(jīng)引起了很大的關(guān)注度，柱芳烴因?yàn)槠涓叨葘?duì)稱(chēng)的結(jié)構(gòu)和含有富電子體系的空腔結(jié)構(gòu)使得其在超分子聚合物，傳感器等領(lǐng)域展現(xiàn)出其獨(dú)特的識(shí)別性能與應(yīng)用前景。cn201610200496.6公開(kāi)了對(duì)稱(chēng)性柱[5]芳烴作為受體比色熒光識(shí)別l-色氨酸的應(yīng)用，該柱[5]芳烴（dp5）傳感器能與l-色氨酸在dmso/ch3ch2oh/h2o(8:1:1,v/v/v)的混合溶液中形成1:1絡(luò)合，而其他人體必須的19種l型氨基酸沒(méi)有影響。但是由于該柱[5]芳烴只有對(duì)稱(chēng)的兩條長(zhǎng)烷基鏈，不能溶解與水，只能通過(guò)有機(jī)溶劑中溶解后再進(jìn)行識(shí)別。識(shí)別組裝只是通過(guò)π-π作用的電子轉(zhuǎn)移進(jìn)行組裝，而使得發(fā)生熒光“關(guān)-開(kāi)”的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種柱[5]芳烴作為分子傳感器在純水相中高選擇性、高靈敏度比色-熒光識(shí)別甲硫氨酸的應(yīng)用方法。

水溶性的陽(yáng)離子柱[5]芳烴，是以柱[5]芳烴的大環(huán)為熒光信號(hào)報(bào)告基團(tuán)，用三甲胺修飾柱[5]芳烴引進(jìn)了多個(gè)親水性集團(tuán)，使其具有很好的水溶性。其中柱[5]芳烴上的季銨鹽集團(tuán)的存在，增強(qiáng)了傳感器的水溶性，使其易溶于水，一些氨基酸穿入柱[5]芳烴的空腔，進(jìn)行主客體絡(luò)合，從而實(shí)現(xiàn)了在純水介質(zhì)中對(duì)氨基酸的單一選擇性識(shí)別，因此，在環(huán)境檢測(cè)中有很好的應(yīng)用前景。柱[5]芳烴標(biāo)記為p5，其結(jié)構(gòu)式如下：

下面通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)對(duì)柱[5]芳烴的熒光性能、以及熒光識(shí)別甲硫氨酸的方法和機(jī)理進(jìn)行分析說(shuō)明。

1、p5對(duì)氨基酸的比色-熒光相應(yīng)實(shí)驗(yàn)

移取10ul配好的p5水溶液（2.0×10^-3mol/l）于一系列點(diǎn)滴板中，分別加入氨基酸ala，arg，asp，cys，gln，glu，his，ile，gly，asn，leu，lys，met，phe，pro，ser，thr，trp，tyr和val的水溶液（濃度為1.0×10^-4m），若溶液熒光打開(kāi)，且溶液顏色由無(wú)色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S綠色，則說(shuō)明滴加的是met，若溶液的熒光沒(méi)有發(fā)生變化，則說(shuō)明滴加的不是met。在其相應(yīng)的熒光光譜中，甲硫氨酸的加入使p5熒光的吸收峰明顯增強(qiáng)，而其余氨基酸的加入對(duì)p5的熒光光譜無(wú)明顯影響（見(jiàn)圖1）。說(shuō)明p5能夠?qū)琢虬彼徇M(jìn)行專(zhuān)一性的識(shí)別。

2、滴定實(shí)驗(yàn)

移取2.0mlp5的水溶液（2.0×10^-3mol/l）于比色池中，用累積加樣法逐漸加入met的水的溶液。發(fā)現(xiàn)隨著met的加入，主體p5在650nm處的吸收峰逐漸增強(qiáng)，直到終點(diǎn)，于25℃測(cè)其熒光發(fā)射光譜（見(jiàn)圖2）。通過(guò)對(duì)滴定數(shù)據(jù)的處理以及應(yīng)用公式，算出了甲硫氨酸檢測(cè)的最低檢測(cè)限lod=6.328×10^-7m。

3、抗干擾性能檢測(cè)

為了測(cè)定傳感器分子p5對(duì)met的檢測(cè)效果，我們又進(jìn)行了如下測(cè)試：取兩組10ml比色管分別加入0.5ml該受體的水溶液，再分別加入0.25ml各種氨基酸的水溶液（4×10^-3mol·l^?1），然后用蒸餾水稀釋至5ml刻度；另外一組中再分別加0.25ml的met水溶液，在每一個(gè)比色管中分別加入0.25ml其它十九種氨基酸（ala，arg，asp，cys，gln，glu，his，ile，gly，asn，leu，lys，phe，pro，ser，thr，trp，tyr，val），然后用蒸餾水稀釋至5ml刻度。將上述溶液混合均勻后進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入上述十九種氨基酸后，受體p5的熒光吸收峰仍然存在，這與met對(duì)受體的影響是一致的（見(jiàn)圖3），從而說(shuō)明p5檢測(cè)met基本不受其它氨基酸的干擾。

4、p5的ph響應(yīng)實(shí)驗(yàn)

傳感器超分子p5和met的穩(wěn)定性也可以通過(guò)一系列ph緩沖液檢測(cè)。從結(jié)果看，超分子絡(luò)合物p5-met在酸性和堿性環(huán)境下，穩(wěn)定性良好。（見(jiàn)圖4）。

5、p5對(duì)met識(shí)別機(jī)理

針對(duì)傳感器分子p5對(duì)met識(shí)別機(jī)理的探究，我們通過(guò)可以通過(guò)¹hnmr來(lái)表征p5與met的自組裝機(jī)理。主體p5與加met后的混合物對(duì)比的¹hnmr（圖5）表明：當(dāng)把met加入到p5的d2o溶液中時(shí)，p5和met上的質(zhì)子峰發(fā)生了明顯的移動(dòng)。比較特殊的是，met上的三重峰h^a和h^b明顯的向高場(chǎng)移動(dòng)（δδ=-1.81,-0.51ppm），而且變寬。出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象原因可能是，這些質(zhì)子進(jìn)入到了p5的分子空腔中屏蔽了富電子空腔。而且，met上的雙重峰h^d和h^c逐漸向高場(chǎng)移動(dòng)（δδ=0.30,0.20ppm），可能原因是，met的烷基鏈和p5的富電子空腔發(fā)生了ch-π作用。這些ch-π作用，同樣也使p5上的h¹，h²，h³，向高場(chǎng)移動(dòng)(δδ=0.25,0.40ppm)。met上的羧酸基團(tuán)與p5上的季銨鹽通過(guò)靜電引力也參與了自組裝過(guò)程。這些靜電相互作用力直接導(dǎo)致了met上的羧酸鹽基團(tuán)向p5季銨鹽基團(tuán)的電荷轉(zhuǎn)移。同理，p5上的h^3-8同樣也向高場(chǎng)移動(dòng)。根據(jù)這些結(jié)果，我們推測(cè)出了它的自組裝機(jī)理，met上部分的烷基鏈進(jìn)入到了p5的分子空腔，柱[5]芳烴環(huán)與met的烷基鏈上有ch-π作用，以及met上的羧基與p5的季銨鹽之間發(fā)生了靜電引力。通過(guò)這種方式，p5和met構(gòu)成了主客體絡(luò)合物p5-met。機(jī)理如下式所示：

為了進(jìn)一步說(shuō)明，p5和met之間的相互作用。我們繼續(xù)做了柱[5]芳烴和met混合液的二維核磁氫圖譜圖（圖6）。從圖譜上可以看出，met上的h^b質(zhì)子與柱[5]芳烴p5上的h¹、h²，以及met上的h^b和p5上的h³、h⁴、h⁷、h⁸都有明顯的相互作用。二維核磁氫圖譜圖譜從側(cè)面說(shuō)明，p5與met的自組裝是以ch-π作為自組裝驅(qū)動(dòng)力。2甲硫氨酸的烷基鏈和p5的富電子空腔發(fā)生了ch-π作用，而且甲硫氨酸上的羧酸基團(tuán)與p5上的季銨鹽通過(guò)靜電引力也參與了自組裝過(guò)程，兩種作用力存在是的更容易發(fā)生組裝，從而提高了識(shí)別的靈敏度。

附圖說(shuō)明

圖1為p5對(duì)甲硫氨酸的熒光響應(yīng)圖。

圖2為p5對(duì)甲硫氨酸的滴定實(shí)驗(yàn)。

圖3為p5對(duì)其它氨基酸的抗干擾圖。

圖4為p5-met對(duì)不同ph下穩(wěn)定性測(cè)定圖。

圖5為p5與met組裝識(shí)別機(jī)理的核磁氫譜圖。

圖6為p5與met組裝識(shí)別機(jī)理的二維核磁氫譜圖。

圖7為在p5的水溶液中，依次加入ala，arg，asp，cys，gln，glu，his，ile，gly，asn，leu，lys，met，phe，pro，ser，thr，trp，tyr和val（1.0′10^-5moll^-1）后，在紫外燈下的照片。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明傳感器分子p5比色-熒光檢測(cè)甲硫氨酸的方法作進(jìn)一步說(shuō)明。

柱[5]芳烴p5的合成：按文獻(xiàn):y.ma,x.ji,f.xiang,x.chi,c.han,j.he,z.abliz,w.chen,f.huang,chem.commun.47(2011)12340合成。

柱[5]芳烴p5熒光檢測(cè)met：在傳感器分子p5的水溶液中，加入ala，arg，asp，cys，gln，glu，his，ile，gly，asn，leu，lys，met，phe，pro，ser，thr，trp，tyr和val的水溶液（4×10^-3mol·l^-1），若p5溶液產(chǎn)生淡黃綠色熒光，這說(shuō)明加入的是met；若p5溶液的熒光無(wú)明顯變化，則說(shuō)明加入的是其它氨基酸。

移取柱[5]芳烴感器超分子水溶液（2×10^-3mol/l）于一系列點(diǎn)滴板中，分別加依次滴加ala，arg，asp，cys，gln，glu，his，ile，gly，asn，leu，lys，met，phe，pro，ser，thr，trp，tyr和val的水溶液，若點(diǎn)滴板中的熒光打開(kāi)，溶液熒光顏色由無(wú)色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S綠色，說(shuō)明滴加的是met，若溶液的熒光沒(méi)有打開(kāi)，則說(shuō)明滴加的不是met。