本發(fā)明涉及分析檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種尿液中褪黑素硫酸鹽的檢測方法。
背景技術(shù)：
：尿液中褪黑素硫酸鹽(mt6s)是褪黑素的主要代謝產(chǎn)物，通過檢測尿液中mt6s可以間接反映人體內(nèi)mt水平。褪黑激素(melatonine，mt)因為能使皮膚變白而得名，是由腦松果體分泌的激素之一。褪黑激素屬于吲哚雜環(huán)類化合物，其化學(xué)名是n-乙?；?5-甲氧基色胺，又稱為松果體素、褪黑素。褪黑素合成后，儲存在松果體內(nèi)，交感神經(jīng)興奮支配松果體細胞釋放褪黑素人血。褪黑素的分泌具有明顯的晝夜節(jié)律，白天分泌受抑制，晚上分泌活躍。褪黑素可抑制下丘腦-垂體-性腺軸，使促性腺激素釋放激素、促性腺激素、黃體生成素以及卵泡雌激素的含量均減低，并可直接作用于性腺，降低雄激素、雌激素及孕激素的含量。另外，mt有強大的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)活性和清除自由基抗氧化能力，可能會成為新的抗病毒治療的方法和途徑。mt最終在肝臟中代謝，肝細胞的損傷可影響體內(nèi)mt的水平。目前尿液中褪黑素硫酸鹽檢測主要采用傳統(tǒng)的放免法、酶聯(lián)免疫、化學(xué)發(fā)光或者液相色譜的方法檢測尿液樣本中的褪黑素硫酸鹽，鮮少有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，且普遍存在：1.尿液樣本的運輸和保存條件嚴格運輸不方便；2.褪黑素硫酸鹽濃度較低一般為ppb級別，且極性強，人體尿液組成復(fù)雜存在大量的結(jié)構(gòu)相似的化合物，因此傳統(tǒng)方法檢測存在嚴重的基質(zhì)干擾，特異性差，靈敏度低，準確度低等缺點。3.色譜或者質(zhì)譜法存在前處理復(fù)雜，操作繁瑣，周期長，檢測通量小。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于此，本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、特異性強、通量高的褪黑素硫酸鹽的檢測方法。具體的技術(shù)方案如下：一種尿液中褪黑素硫酸鹽的檢測方法，包括如下步驟：樣品前處理：取尿液樣品，加入去離子水稀釋，所述尿液樣品與所述去離子水的體積比為1:1-2；然后加入內(nèi)標液，所述尿液樣品與所述內(nèi)標液的體積比為1:1-3，得待測樣品；富集、分離和檢測：對所述待測樣品采用二維液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進行富集、分離和檢測。在其中一些實施例中，所述富集、分離和檢測的步驟包括：先用流動相1洗脫富集柱中的所述待測樣品，對所述待測樣品進行富集、純化；將富集柱與分析柱連通，用流動相2將待測物從富集柱洗脫至分析柱，用流動相2將待測物從分析柱洗脫、分離；斷開富集柱與分析柱，用流動相2將待測物從分析柱洗脫、分離至四級桿質(zhì)譜進行檢測；其中，富集柱為c8柱，分析柱為c18柱；流動相1：a相為乙腈，b相為水，流速為1.0-2.0ml/min；流動相2：c相為含0.09-0.3wt％甲酸的乙腈，d相為含0.09-0.2wt％甲酸和5-10mm醋酸銨的水，流速為0.2-1.0ml/min。所述的二維液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀配置了兩套泵，兩套泵通過六通閥(或者其它可實現(xiàn)切換的方式)實現(xiàn)切換。起始模式下，富集柱與分析柱處于未連通狀態(tài)，待測樣品經(jīng)進樣器進入富集柱進行富集、純化后，0.25min切換六通閥使富集柱與分析柱連通，將待測樣品洗脫至分析柱，0.8min六通閥切回起始模式，斷開富集柱與分析柱，待測物在分析柱中經(jīng)梯度洗脫至分離后進入質(zhì)譜進行檢測，富集柱中的殘留雜質(zhì)經(jīng)梯度洗脫至廢液瓶中。在其中一些實施例中，流動相采用梯度洗脫模式：0min時，流動相1中a相與b相的體積比為100:0，流動相2中c相與d相的體積比為98:2，用流動相1洗脫富集柱中的待測樣品，對待測樣品進行富集、純化；0.25min時，將富集柱與分析柱連通，用流動相2將待測物從富集柱洗脫至分析柱；0.3min時，流動相2中c相與d相的體積比為70:30；0.3min-0.5min時，流動相2中c相與d相的體積比由70:30變化至50:50；0.8min時，斷開富集柱與分析柱，用流動相2將待測物從分析柱洗脫、分離至四級桿質(zhì)譜進行檢測，流動相2中c相與d相的體積比為50:50；用流動相1將富集柱中的殘留雜質(zhì)洗脫至廢液瓶中；1.6min時，流動相2中c相與d相的體積比為50:50；1.6min-3.0min時，流動相2中c相與d相的體積比由50:50變化至37:63；3.1min時，流動相2中c相與d相的體積比為5:95；3.7min時，流動相2中c相與d相的體積比為98:2；整個梯度時間為4.5-7.0min。在其中一些實施例中，所述流動相1的流速為1.2-1.3ml/min，所述流動相2的流速為0.4-0.6ml/min。在其中一些實施例中，所述內(nèi)標液為含10-50μg/l內(nèi)標物的乙腈溶液；所述內(nèi)標物為褪黑素的c13標記物或氘代標記物。在其中一些實施例中，所述四級桿質(zhì)譜條件為：正離子模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描mrm；所述正離子模式中，目標定量離子對包括褪黑素d4定量離子對和/或褪黑素硫酸鹽定量離子對；目標定量離子的多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描mrm的質(zhì)/荷比條件包括：褪黑素硫酸鹽的母離子的質(zhì)/荷比為328.9-329.5，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為189-191；褪黑素d4的母離子的質(zhì)/荷比為236.8-237.5，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為177.8-178.5。在其中一些實施例中，所述四級桿質(zhì)譜條件還包括以下離子源參數(shù)：電離源為電噴霧電離esi源，氣簾氣壓力為35-45psi，加熱氣壓力為35-45psi，輔助加熱氣壓力為55-65psi，加熱氣溫度為450-550℃，碰撞氣為氮氣，碰撞氣壓力為6.0-8.0psi，電噴霧針電壓為5000-6000v。在其中一些實施例中，所述四級桿質(zhì)譜條件還包括：尿液中褪黑素硫酸鹽定量離子對的去簇電壓為70-90v，入口電壓為8-12v，碰撞電壓為25-35v，出口電壓為8-12v；褪黑素d4的定量離子對的去簇電壓為60-70v，入口電壓為6-10v，碰撞電壓為6-15v，出口電壓為18-25v。在其中一些實施例中，所述樣品前處理步驟為：取尿液樣品，將濾紙片浸入所述尿液樣品中，取出，晾干，得尿紙片；用去離子水洗脫所述尿紙片得洗脫液，于所述洗脫液中加入所述內(nèi)標液混勻，離心得待測樣品；所述洗脫液與所述內(nèi)標液的體積比為1:1-3。在其中一些實施例中，所述離心的條件為：溫度0-5℃，轉(zhuǎn)速11000-13000r/min，時間4-8min。上述尿液中褪黑素硫酸鹽的檢測方法具有以下優(yōu)點和有益效果：(1)上述檢測方法的樣品前處理步驟簡單只需將尿液樣品稀釋后即可上機，不需要萃取，氮吹濃縮，復(fù)溶等，處理時間短，處理單個樣本只需1.0-2.5min，處理一批(20個)也只需要3-10min，而常用的萃取法處理單個樣本至少需90min，處理一批(20個)也至少需要120min。即本發(fā)明的檢測方法大大縮短了檢測時間，提高了樣本的檢測通量。(2)上述檢測方法在儀器投入方面比普通的液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀僅增加了一個富集柱和一組泵起到了提純，濃縮的效果，并且采用的富集柱簡單、成本低且可重復(fù)使用數(shù)千次以上，大大提高了檢測效率、靈敏度、精密度等。(3)上述檢測方法富集、分離和檢測的各參數(shù)(比如富集柱的選擇、流動相的選擇、流速等條件)進行了大量實驗研究進行優(yōu)化，使最后得到的檢測方法可以有效去除基質(zhì)干擾，特異性、抗基質(zhì)干擾能力強。定量限低(<0.975ng/l)，靈敏度高，精密度rsd小于10％，可以準確的定性或定量檢測出尿液中褪黑素硫酸鹽檢測含量。即與常用的檢測相比，上述檢測方法檢測靈敏度高、精密度高、特異性強。(4)上述檢測方法還可以將尿液樣品制作為尿紙片，測試者可以在家自己采集樣本晾干后寄送至實驗室，樣本采集便捷，運輸方便。附圖說明圖1為實施例1人尿液中褪黑素硫酸鹽及其內(nèi)標物的tic圖；圖2為實施例1褪黑素硫酸鹽的線性回歸曲線圖；圖3為線性驗證的線性回歸曲線圖。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進行更全面的描述。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。實施例1本實施例的褪黑素硫酸鹽的檢測方法，包括以下步驟：一、樣品采集采集某個時間(通常為：早上5-7點、早上7-9點、下午4-6點(16-18點)、晚上10-12點(22-24點)四個時間點，該時間段的數(shù)值能夠比較真實反映出人體一天中褪黑素水平的變化情況)的尿液于尿杯中并將濾紙片浸入尿液中，待紙片上的尿液蔓延至刻度時取出尿紙片，自然晾干。二、樣品前處理移取1ml的離子水洗脫尿紙片，洗脫2次，于離心機5000r/min，4℃離心分離10min，得到洗脫液，在洗脫液中加入等體積的內(nèi)標液(內(nèi)標液為含20μg/l內(nèi)標物的乙腈溶液；所述內(nèi)標物為褪黑素的c13標記物或氘代標記物)，漩渦混勻60s后，于離心機12000r/min，4℃離心分離5min，取200μl上清液至棕色進樣瓶中，即得待測樣品，將其加載至液相色譜自動進樣器中?？梢岳斫獾模蛞簶悠芬部梢灾苯咏?jīng)過去離子水稀釋(二者體積比為1:1)，然后加入內(nèi)標液(尿液樣品與內(nèi)標液的體積比為1:3)，混勻離心后得待測樣品。對所述待測樣品采用二維液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進行富集、分離提純和檢測，方法簡單，時間短通量高，靈敏度和特異性高，準確度和精密度好。通過檢測得到尿液中褪黑素硫酸鹽的濃度并與尿液中肌酐進行比值得到最終的結(jié)果。二、富集、分離和檢測自動進樣器自動將50ul待測樣品加載到二維液相色譜系統(tǒng)中，對所述待測樣品采用二維液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀lc-ms/ms進行富集、分離與檢測。該系統(tǒng)配置了兩套泵，兩套泵通過一個六通閥實現(xiàn)切換(也可以通過兩個六通閥或者其它的方式進行切換)，六通閥3號位連接flow1(流動相1)，1號和4號位連接富集柱，5號位連接flow2(流動相2)，6號位連接分析柱，2號位連接廢液瓶。其中，富集柱為c8-phenyl(4×2.0mm)，分析柱為c18(50×2.0mm，3μm)；流動相1：a相為乙腈，b相為水，流速為1.20ml/min；流動相2：c相為含0.1％甲酸的乙腈，d相為含0.1％甲酸和9mm醋酸銨的水，流速為0.5ml/min；柱溫為40℃。六通閥的起始模式為0，即富集柱與分析柱處于未連通狀態(tài)，待測樣品經(jīng)進樣器進入富集柱進行富集、純化，此過程中富集柱用flow1流動相進行洗脫；0.25min切換六通閥為1，即富集柱與分析柱連通，將待測樣品洗脫至分析柱，此過程中富集柱與分析柱中的洗脫流動相均為flow2流動相；0.8min六通閥切回起始模式0，斷開富集柱與分析柱，待測物在分析柱中經(jīng)梯度洗脫(流動相為flow2流動相)至分離后進入質(zhì)譜進行檢測，富集柱中的殘留雜質(zhì)經(jīng)梯度洗脫(流動相為flow1流動相)至廢液瓶中。流動相的梯度洗脫如表1所示。表1流動相的洗脫梯度上述梯度下，褪黑素硫酸鹽的保留時間為2.29min。本實施例lc-ms/ms采用具有電噴霧電離源(esi)的appliedbiochemistryapi4500plus串聯(lián)質(zhì)譜分析儀作為檢測器進行分析。其中，氣簾氣壓力為25psi；加熱氣壓力為35psi；輔助加熱氣壓力為40psi；加熱氣溫度為400℃；碰撞氣為高純氮氣，壓力為7psi；電噴霧針電壓為5000v。其它質(zhì)譜條件：采用正離子模式，掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描mrm，其條件參見表2。表2多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描mrm條件待測物隨流動相流出分析柱后，在壓力的作用下進入質(zhì)譜儀離子源，由六通閥控制進入離子源的樣品通道，和進入切換時間。在離子源內(nèi)液體樣品被汽化并且電離為帶電分子，帶電分子在電壓和真空作用下，進入q1、q2和q3，其中，q1和q3為質(zhì)量過濾器，只允許根據(jù)25羥基維生素d及其內(nèi)標物的質(zhì)荷比選擇的母離子和子離子通過，q2為碰撞單元，母離子在此處與惰性氣體原子碰撞，產(chǎn)生特定的碎片離子。質(zhì)譜儀的第一個四極(q1)選擇具有25羥維生素d及其內(nèi)標物的特定質(zhì)荷比m/z的母離子，具有這些m/z比的母離子被允許進入q2，q2產(chǎn)生的碎片離子進入到q3，其中25羥維生素d及其內(nèi)標物的碎片離子(子離子)被選擇通過，而其它離子被除去。參見表3，示出了被用于鑒別和定量的褪黑素硫酸鹽的離子對的質(zhì)荷比m/z。表3mt6s的質(zhì)量轉(zhuǎn)變表被分析物q1母離子(m/z)q3子離子(m/z)褪黑素硫酸鹽329.2190褪黑素硫酸鹽內(nèi)標327.1178.1隨著離子與檢測器碰撞，它們將捕獲到的離子數(shù)轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號的電子脈沖。所獲得的數(shù)據(jù)被傳遞到計算機，其將所收集的離子數(shù)對時間作圖，即得總離子流圖(tic圖)(如圖1所示)。三、定性判斷和定量計算(1)依據(jù)褪黑素硫酸鹽標準品的相對保留時間和檢測的定量離子對與定性離子對的豐度比判斷褪黑素硫酸鹽的存在。在相同試驗條件下，檢測樣品中被測目標物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時間與標準溶液中對應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時間一致；檢測樣品的色譜圖中所選擇的檢測離子對的相對豐度比與相當濃度標準溶液的離子對相對豐度比的偏差(即表4中的最大允許誤差)不超過表4規(guī)定的范圍，則可以判斷樣品中存在對應(yīng)的目標物質(zhì)。表4定性判斷相對豐度的最大允許誤差相對豐度(k)k≥50％20％≤k≤50％10％≤k≤20％k≤10％最大允許誤差±20％±25％±30％±50％(2)采用內(nèi)標標準曲線法定量，以褪黑素硫酸鹽與內(nèi)標物的峰面積比值計算樣品中的褪黑素硫酸鹽的含量。配置系列濃度的含有褪黑素硫酸鹽的標準溶液，用本實施例的上述方法進行樣品前處理以及分離檢測，以標準溶液中褪黑素硫酸鹽和內(nèi)標物的峰面積的比值構(gòu)建內(nèi)標標準曲線，褪黑素硫酸鹽的標準曲線見圖2，曲線的方程y＝0.0033x+2.4e-6，r＝0.9993然后利用該標準曲線計算待測樣品或質(zhì)量控制物中的褪黑素硫酸鹽的濃度。本實施例測得褪黑素硫酸鹽的峰面積為7.79e+004，其內(nèi)標物的峰面積為5.53e+005，計算得到本實施例的尿液樣品中褪黑素硫酸鹽的濃度為42.6ug/l；肌酐檢測的肌酐為2.0g/l，那么最終得到尿液中褪黑素硫酸鹽的結(jié)果為21.3ug/g肌酐(μg/gcr)。實施例2方法學(xué)驗證實驗本實施例對實施例1中的褪黑素硫酸鹽的檢測方法進行方法學(xué)驗證實驗。1、精密度(precision)實驗1.1批內(nèi)精密度(intra-assay)a.取實際尿液樣本分別加標至低、中、高三水平，得到的樣本進行批內(nèi)精密度實驗；b.每個濃度水平的樣本平行處理20個，每個進樣1次；c.計算檢測結(jié)果的平均值及相對標準偏差(rsd)，要求rsd小于20％；d.表5即為批內(nèi)精密度數(shù)據(jù)，批內(nèi)精密度均小于6％，滿足要求。表5褪黑素硫酸鹽的批內(nèi)精密度實驗結(jié)果1.2批間精密度(inter-assay)a.取預(yù)先配制好的低、中、高三水平的質(zhì)控品，進行批間精密度實驗；b.每個水平的樣本分別做4個平行，即檢測得4組數(shù)據(jù)，連續(xù)測定5天；c.計算檢測結(jié)果的平均值及相對標準偏差(rsd),要求rsd小于20％；d.表6即為批間精密度數(shù)據(jù)，批間精密度均小于11％，滿足要求。表6褪黑素硫酸鹽批間精密度實驗結(jié)果2、分析靈敏度和線性范圍(analyticalsensitivityandanalyticalm--easurementrangeandlinearitystudy)2.1方法定量限與線性范圍(limitofquantitationandlinearity)a.配制空白基質(zhì)；b.配置標準曲線；c.每個濃度的樣本平行處理6個，分別檢測一次；d.計算各濃度樣本的平均值、rsd和回收率；e.方法定量限的確定標準：rsd小于20％且回收率在85％-115％范圍內(nèi)的最低濃度點視為定量限濃度，即loq；f.線性范圍的確定標準：rsd小于20％，回收率在85％-115％范圍內(nèi)，且以理論濃度比率與實際信號響應(yīng)峰面積比率繪制成的回歸曲線r2>0.98，即滿足線性范圍的要求；g.驗證實驗數(shù)據(jù)如表8和圖3，mt6s的loq為0.0975ug/l，線性范圍為0.0975-200ug/l。表7回歸曲線中的曲線點濃度表8mt6s定量限實驗結(jié)果2.2方法檢出限(limitofdetection)a.收集濃度均在定量限loq附近的病人樣本；b.平行處理此病人樣本20個，分別檢測1次；c.計算各濃度樣本的平均值、sd和方法檢出限(lod)；d.實驗結(jié)果如表9所示，mt6s的lod為0.0249ug/l。表9mt6s方法檢出限試驗結(jié)果2.3結(jié)論(summaryoftheamrstudy)表10mt6s分析靈敏度與線性范圍結(jié)果匯總3、方法準確度-回收率(recovery)a.收集一批混合尿液樣本，測得基礎(chǔ)濃度，分別加標至高、中、低三水平的樣本，進行加標回收率實驗；b.未加標及加標樣品，每個平行處理3個，分別進行檢測，計算加標樣品的回收率結(jié)果，回收率在85-115％范圍內(nèi)，認為方法準確；c.回收率實驗結(jié)果如表11所示。由結(jié)果可知，方法的回收率在89.94～109.10％之間，滿足要求。表11褪黑素硫酸鹽加標回收率試驗結(jié)果由上述的檢測結(jié)果顯示本發(fā)明的褪黑素硫酸鹽的檢測方法檢測尿液樣品或者質(zhì)控物質(zhì)結(jié)果準確，定量限為0.0975μg/l，檢測限為0.0249μg/l，精密度rsd<11％，加標回收率在89％-110％之間，前處理時間約1.2min，檢測效率高。說明本方法準確可靠，精密度高、靈敏度高、檢測通量高、成本低。以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。當前第1頁12