本發(fā)明屬于生物實驗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用石蠟切片和掃描電鏡對同一樣品進(jìn)行觀察的方法。

背景技術(shù)：

植物組織的石蠟切片和電鏡掃描觀察技術(shù)已經(jīng)趨于成熟，而對一份樣品的兩種觀察方法還并不常見。

石蠟切片是通過將生物組織切成薄片，然后通過光學(xué)顯微鏡觀察獲得組織切面輪廓以及組織中各種細(xì)胞的形態(tài)，所得的圖像具有廣視野、粗線條、大輪廓的特點，但是由于石蠟切片的圖像為平面圖像且光學(xué)顯微鏡放大的倍數(shù)有限(最大放大倍數(shù)1000倍)，很難對植物組織的整體形態(tài)、三維立體形態(tài)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)做觀察。掃描電鏡技術(shù)則能很好的彌補(bǔ)這一不足。掃描電鏡技術(shù)通常是獲得組織的外部形態(tài)，其結(jié)果具有很強(qiáng)的立體感，能獲得三維結(jié)構(gòu)圖像，且分辨率極高，對植物組織和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確分辨十分有利。然而電鏡掃描只能觀察到組織表面的形態(tài)，對于組織內(nèi)部的形態(tài)不能進(jìn)行觀察。

現(xiàn)有的技術(shù)方案是尋找兩個發(fā)育狀態(tài)相當(dāng)?shù)臉悠?，分別用石蠟切片與掃描電鏡來處理，以獲得這兩種觀察結(jié)果。另一種方法是對已經(jīng)做成石蠟切片的蠟帶脫蠟處理后進(jìn)行電鏡掃描觀察。然而，若是尋找兩個發(fā)育狀態(tài)相當(dāng)?shù)臉悠穪磉M(jìn)行處理，那么問題是不可能存在兩個完全一致的樣品，獲得的只能是近似一致的結(jié)果，且對材料的浪費較大。若是利用對蠟帶脫蠟進(jìn)行處理，缺點在于只能獲得切面的掃描圖像，而不能看到石蠟切片的結(jié)果；同時因樣片已經(jīng)進(jìn)行切片，所以無法獲得植物組織的三維輪廓。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種利用石蠟切片和掃描電鏡對同一樣品進(jìn)行觀察的方法。

本發(fā)明提供的利用石蠟切片和掃描電鏡對同一樣品進(jìn)行觀察的方法，其為對樣品石蠟包埋后進(jìn)行組織切片，切片進(jìn)行到樣品對稱軸，或根據(jù)觀察組織切片結(jié)果來確定，然后將剩余的已經(jīng)包埋好的樣品蠟塊經(jīng)過脫蠟處理后再進(jìn)行電鏡掃描，獲得樣品切面的電鏡掃描結(jié)果。

其中，所述的脫蠟處理為：將剩余樣品置于二甲苯或叔丁醇中，浸泡二甲苯的樣品置于40℃的恒溫箱中，浸泡叔丁醇的樣品置于60℃恒溫箱中，3小時換新溶液，重復(fù)3次，第三次過夜；

將置于二甲苯中退蠟的樣品轉(zhuǎn)移到1/2二甲苯+1/2乙醇(100％)混合液中在40℃的恒溫箱浸泡3小時，置于叔丁醇中退蠟的樣品轉(zhuǎn)移到1/2叔丁醇+1/2乙醇(100％)混合液中在40℃的恒溫箱浸泡3小時，之后兩種樣品都需換成100％乙醇浸泡3小時，重復(fù)100％乙醇浸泡3小時，再將樣品浸入乙酸異戊酯中；

將處理完的材料置于臨界點干燥儀中進(jìn)行臨界點干燥。

本發(fā)明充分利用一份樣品，不僅可以觀察到樣品內(nèi)部的各種細(xì)胞形態(tài)，而且獲得樣品的電鏡掃描結(jié)果，同時可以觀察到組織的外部輪廓以及之中細(xì)微結(jié)構(gòu)的高倍率、高分辨的三維像，這對研究植物形態(tài)發(fā)育將十分有利。

附圖說明

圖1所示為白玉蘭種子石蠟切片光鏡圖像/200倍。

圖2所示為石蠟切片后剩余樣品經(jīng)叔丁醇退蠟6h后的電鏡掃描圖像/200倍。

圖3所示為同一樣品經(jīng)兩種觀察方法所得圖像對比，左側(cè)為電鏡掃描的圖像結(jié)果，右側(cè)為石蠟切片的光學(xué)圖像結(jié)果，圖中的紅框內(nèi)為同一細(xì)胞/200倍。

圖4所示為白玉蘭種子石蠟切片圖像/40倍。

圖5所示為白玉蘭種子石蠟切片圖像/100倍。

圖6所示為白玉蘭種子石蠟切片圖像/200倍。

圖7所示為白玉蘭種子石蠟切片圖像/400倍。

圖8所示為石蠟切片剩余樣品的電鏡掃描圖像(與圖4為同一樣品)叔丁醇退蠟3h/40倍。

圖9所示為石蠟切片剩余樣品的電鏡掃描圖像(與圖5為同一樣品)二甲苯退蠟6h/100倍。

圖10所示為石蠟切片剩余樣品的電鏡掃描圖像(與圖6為同一樣品)叔丁醇退蠟9h/200倍。

圖11所示為石蠟切片剩余樣品的電鏡掃描圖像(與圖7為同一樣品)二甲苯退蠟3h/400倍。

圖12所示為石蠟切片剩余樣品的電鏡掃描圖像(與圖7為同一樣品)二甲苯退蠟3h/1000倍。

圖13所示為石蠟切片剩余樣品的電鏡掃描圖像(與圖7為同一樣品)二甲苯退蠟3h/2000倍。

圖14所示為石蠟切片剩余樣品的電鏡掃描圖像(與圖7為同一樣品)二甲苯退蠟3h/4000倍。

具體實施方式

以下實例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1石蠟切片的制作

材料為白玉蘭種子

1)固定：用faa固定液(70％酒精：甲醛：冰乙酸＝90:5:5)，常溫下固定24h。

2)脫水系列溶液浸泡，各試劑浸泡一天，按下表1-6的順序。

3)浸蠟

恒溫箱溫度調(diào)至60℃，將樣品置于玻璃瓶內(nèi)，加入適量蠟屑，少量叔丁醇，加蓋，兩天后開蓋，使叔丁醇揮發(fā)，浸蠟一周。

4)包埋

將液體蠟倒入鋁盒內(nèi)，置于展片機(jī)上防止凝固，展片機(jī)溫度設(shè)定為60℃，將浸蠟一周的材料放入液體蠟中，在室溫下緩慢凝固時用燒熱的鑷子上下挑動，使樣品位于蠟塊中央，表面凝固后將其置于冰袋上，3～5min后置于與冰袋同盆的水中。

5)修塊、粘塊

用小刀劃蠟塊表面，用手掰開，保證每個蠟塊中僅有一個樣品，再用小刀將蠟塊邊緣修整齊。取少量蠟屑熔化后傾倒在小木塊的一面，將蠟塊粘貼于其上，待冷卻后將其置于切片機(jī)上修蠟塊為梯形。

6)切片

在載玻片毛玻璃部分做好標(biāo)記，同面光滑部分均勻涂少量蛋白貼劑，再滴適量蒸餾水，在切片機(jī)上將蠟塊切為8～10μm的蠟帶，取適當(dāng)長度將其排列在載玻片上。在展片機(jī)上展片后用吸水紙吸去蒸餾水，然后在光學(xué)顯微鏡下至于40倍放大情況下鏡檢，根據(jù)鏡檢結(jié)果來控制樣片切片的進(jìn)度，直到切面位于樣品對稱線時停止切片，然后將展好的片子置于40℃烘箱中經(jīng)行干燥，時間最好兩天后，確保樣品完全黏附于載玻片上。

7)染色

采用番紅固綠對染。

8)封片

中性樹脂封片。

9)石蠟切片的觀察

將組織切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

結(jié)果見附圖1，圖3-7。

實施例2脫蠟方法與電鏡掃描

浸泡式脫蠟：

1、脫蠟--試劑：二甲苯或叔丁醇

將石蠟切片剩余的樣品分為2組，一組用二甲苯浸泡，置于40℃恒溫箱內(nèi)；另一組用叔丁醇浸泡，置于60℃恒溫箱內(nèi)，浸泡的時間設(shè)定為3小時，6小時和9小時，每個時間段兩個樣品重復(fù)三次。

2、過渡到乙酸異戊酯

3、臨界點干燥

將材料置于臨界點干燥儀中進(jìn)行臨界點干燥

4、電鏡掃描

結(jié)果見附圖2-3，圖8-14。

在觀察電鏡掃描圖像時發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞空腔，細(xì)胞內(nèi)容物丟失較多，且細(xì)胞收縮的比例較大。依據(jù)比例尺對不同處理下的細(xì)胞收縮率(細(xì)胞原有長度/細(xì)胞變形后長度)進(jìn)行了測量，結(jié)果如下：

表1

表1為利用叔丁醇(40℃)和二甲苯(60℃)下對樣品進(jìn)行退蠟處理3h，6h和9h的細(xì)胞收縮率表。其中二甲苯隨著處理時間的增長，收縮比率增大。而叔丁醇是3小時的細(xì)胞收縮最小，6小時的最大，9小時處于3小時和6小時之間。但就總的效果是，處理時間為3小時的細(xì)胞收縮率是最小的。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。