本方法發(fā)明屬于蛋白表達(dá)領(lǐng)域，涉及一種定量確定微生物中表達(dá)的目的蛋白的表達(dá)情況的方法。

背景技術(shù)：

在生物蛋白研發(fā)及生產(chǎn)過程中，都會涉及到蛋白表達(dá)情況的檢測，包括可溶性目的蛋白的表達(dá)量，以及可溶性蛋白與包涵體的比例等等。而現(xiàn)如今大部分生物科研院所和生物公司，對蛋白表達(dá)情況的檢測，主要是定性的檢測，而且定性檢測效果也不盡如意，比如，蛋白電泳結(jié)果不是很糊分不清，就是很淡看不見。嚴(yán)重影響對蛋白表達(dá)情況的本質(zhì)把握，不能正確指導(dǎo)后續(xù)蛋白表達(dá)優(yōu)化，蛋白放大生產(chǎn)和后續(xù)的蛋白分離純化工作，從而造成時間,人力及資源的浪費(fèi)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明目的是提供一種操作簡單方便，所用到的儀器設(shè)備都是生物實驗室常用儀器。從定量的角度上來分析蛋白表達(dá)情況，解決現(xiàn)有問題，為后續(xù)蛋白表達(dá)優(yōu)化，蛋白放大生產(chǎn)及分離純化提供可靠依據(jù)的定量確定微生物中表達(dá)的目的蛋白的表達(dá)情況的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種定量確定微生物中表達(dá)的目的蛋白的表達(dá)情況的方法，對于一表達(dá)了目的蛋白的微生物菌液，總體積為v總ml,其在波長為600nm的光照下的光吸收值od600為a，從v總中取出的用于檢測目的蛋白表達(dá)情況的菌液體積為v檢ml。那么，取出的菌液經(jīng)離心去上清液后，得到菌體沉淀，往菌體沉淀中加入的裂解緩沖液體積為40v檢aul。

進(jìn)一步的，將所述體積為40v檢aul的含菌體沉淀的裂解緩沖液混勻，并用超聲破碎儀將菌體破碎后，各取30ul的破菌液于兩個1.5mlep管中。其中一個ep1管中加入10ul的4*蛋白樣品處理液，用于跑變性蛋白電泳的全菌液樣品s全菌；另一個ep2管于高速離心機(jī)中離心，將離心后的上清液小心轉(zhuǎn)入另一個新的ep3管中，并向ep3管中加入10ul的4*蛋白樣品處理液，用于跑變性蛋白電泳的上清液樣品s上清；已移除上清液的ep2管中所剩下的沉淀即為包涵體，往已移除上清液的ep2管中包涵體加入與上清液體積相同的裂解緩沖液30ul，并向ep2管中加入10ul的4*蛋白樣品處理液，用于跑變性蛋白電泳的包涵體樣品s包涵體。

進(jìn)一步的，所述s全菌，s上清，s包涵體，按同樣方法制得的不含目的蛋白的全菌液樣品s陰性和已知蛋白濃度的純蛋白s定量連同蛋白maker一起跑變性蛋白電泳，上樣量都為v上樣ul。根據(jù)蛋白電泳膠圖結(jié)果，可看出目的蛋白在上清液和包涵體中的大致分布，目的蛋白是在上清液中多，還是在包涵體中更多，此即為定性。通過凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白電泳膠圖，可得出s全菌，s上清，s包涵體中各自目的蛋白的量與s定量中已知蛋白量的比例，從而得到上樣量都為v上樣ul的s全菌，s上清，s包涵體里目的蛋白的量分別為m全菌ug,m上清ug，m包涵體ug，其中m全＝m上清+m包涵體。因此，上清液中目的蛋白量與包涵體中目的蛋白總量的比值為d＝m上清/m包涵體，其中上清液中的目的蛋白即為可溶性目的蛋白，從而體積為v總ml的微生物菌液中可溶性目的蛋白的總量m上清＝160m上清v總a/(3v上樣)ug；體積為v總ml的微生物菌液中可溶性目的蛋白的濃度為d上清＝160m上清a/(3v上樣)ug/ml。此即為定量分析。

進(jìn)一步的，所述不含目的蛋白的全菌液樣品s陰性,即做為實驗的陰性對照，用于判斷目的蛋白是否在實驗組有表達(dá)。

進(jìn)一步的，所述已知蛋白濃度的純蛋白s定量，即做為實驗的定量標(biāo)尺，用于定量目的蛋白的量。

進(jìn)一步的，所述d值越大，上清液中的目的蛋白越多，也就是可溶性目的蛋白越多；當(dāng)d>1時,上清液中的目的蛋白比包涵體中的目的蛋白多，也就是可溶性目的蛋白更多。

進(jìn)一步的，所述d上清＝160m上清a/(3v上樣)ug/ml＝60m上清a/(3v上樣)mg/l，表示每l菌液中含可溶性目的蛋白的毫克數(shù)。以此來判斷目的蛋白的表達(dá)是否可觀。

進(jìn)一步的，所述定量分析是通過凝膠成像系統(tǒng)來分析蛋白電泳膠圖，對于無凝膠成像系統(tǒng)的實驗室，也可通過肉眼大致得出目的蛋白與定量蛋白之間的比例，從而得出粗略的相應(yīng)數(shù)據(jù)。

本發(fā)明技術(shù)效果主要體現(xiàn)在以下方面：本方法發(fā)明操作簡單方便，所用到的儀器設(shè)備都是生物實驗室常用儀器。從定量的角度上來分析蛋白表達(dá)情況，解決現(xiàn)有問題，為后續(xù)蛋白表達(dá)優(yōu)化，蛋白放大生產(chǎn)及分離純化提供可靠依據(jù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的實施例的蛋白電泳膠圖；

圖2為本發(fā)明的對照組1電泳膠圖；

圖3為本發(fā)明的對照組2電泳膠圖；

圖4為本發(fā)明的對照組3電泳膠圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖1-4，對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳述，以使本發(fā)明技術(shù)方案更易于理解和掌握。

實施例

本方法發(fā)明操作簡單方便，所用到的儀器設(shè)備都是生物實驗室常用儀器。從定性和定量的角度上來分析蛋白表達(dá)情況，解決現(xiàn)有問題，為后續(xù)蛋白表達(dá)優(yōu)化，蛋白放大生產(chǎn)及分離純化提供可靠依據(jù)。

對于一已誘導(dǎo)表達(dá)了proteina的微生物菌液，總體積為50ml,其在波長為600nm的光照下的光吸收值od600為4.124，從v總中取出的用于檢測目的蛋白表達(dá)情況的菌液體積為5ml。那么，取出的菌液經(jīng)離心去上清液后，得到菌體沉淀，往菌體沉淀中加入的裂解緩沖液體積為824ul。

將所述體積為824ul的含菌體沉淀的裂解緩沖液混勻，并用超聲破碎儀將菌體破碎后，各取30ul的破菌液于兩個1.5mlep管中。其中一個ep1管中加入10ul的4*蛋白樣品處理液，用于跑變性蛋白電泳的全菌液樣品s全菌；另一個ep2管于高速離心機(jī)中離心，將離心后的上清液小心轉(zhuǎn)入另一個新的ep3管中，并向ep3管中加入10ul的4*蛋白樣品處理液，用于跑變性蛋白電泳的上清液樣品s上清；已移除上清液的ep2管中所剩下的沉淀即為包涵體，往已移除上清液的ep2管中包涵體加入與上清液體積相同的裂解緩沖液30ul，并向ep2管中加入10ul的4*蛋白樣品處理液，用于跑變性蛋白電泳的包涵體樣品s包涵體。

所述s全菌，s上清，s包涵體，按同樣方法制得的不含目的蛋白的全菌液樣品s陰性和已知蛋白濃度為1ug/ul的純蛋白s定量連同蛋白maker一起跑變性蛋白電泳，除s定量上樣量為1ul外，其余上樣量都為15ul。蛋白電泳膠圖結(jié)果如圖1所示。

通過電泳膠圖定性分析為：有實驗組有目的蛋白表達(dá)，且上清液中目的蛋白比包涵體中的目的蛋白量更少些。

通過bio-radimagelab凝膠成像系統(tǒng)分析定量分析蛋白電泳膠圖，可得出

s全菌：s定量＝1.27，s上清：s定量＝0.48，s包涵體：s定量＝0.71，

從而得到上樣量都為15ul的s全菌，s上清，s包涵體里目的蛋白的量分別為1.27ug,0.48ug，0.71ug，其中m全菌大致等于m上清+m包涵體。

因此，可溶性目的蛋白量與包涵體中目的蛋白總量的比值為d＝m上清/m包涵體＝0.676，表明可溶性蛋白表達(dá)量相比當(dāng)包涵體少了32.4％。

從而體積為50ml的微生物菌液中可溶性目的蛋白的總量

m上清＝160m上清v總a/(3v上樣)ug＝352ug；

體積為v總ml的微生物菌液中可溶性目的蛋白的濃度為

d上清＝160m上清a/(3v上樣)ug/ml＝7ug/ml＝7mg/l。表明在該表達(dá)條件下，每升培養(yǎng)基能表達(dá)出7mg的可溶性目的蛋白，這樣的表達(dá)情況不算特別好，需要后續(xù)優(yōu)化表達(dá)條件或優(yōu)化質(zhì)粒構(gòu)建。

實驗例

實驗組：完全嚴(yán)格按實施例中公開的，本發(fā)明的方法來；

對照組1：與實驗組相比，區(qū)別在于：沒有加定量對照的純蛋白；

對照組2：與實驗組相比，區(qū)別在于：沒有加陰性對照的樣品和定量對照的純蛋白；

對照組3：與實驗組相比，區(qū)別在于：未按本發(fā)明的方法來，但是隨意加的，未加定量蛋白。

對照組1

按上述方法處理樣品，跑電泳，但是沒有加定量對照的純蛋白。電泳膠圖結(jié)果如圖2所示。

從電泳膠圖可以看出，對比陰性對照組，實驗組有目的蛋白表達(dá)，且上清液中目的蛋白量比包涵體中目的蛋白量多一些，表明可溶性目的蛋白表達(dá)量相對多一些。但因為沒有加定量對照的純蛋白，無法定量確定目的蛋白的絕對量，因此無法準(zhǔn)確確定目的蛋白的表達(dá)水平。因些有必要加上定量蛋白。

對照組2

按上述方法處理樣品，跑電泳，但是沒有加陰性對照的樣品和定量對照的純蛋白。電泳膠圖結(jié)果如圖3所示。

因為沒有陰性對照樣品，所以無法確定哪條帶是目的蛋白。因此更談不上定性和定量分析。于是一定要記得加上陰性對照的樣品。

對照組3

該實驗例中，取菌液時未量體積，也未測菌液的od600，經(jīng)離心得到菌體沉淀后，隨意加了一定體積的裂解緩沖液。超聲波破菌后，未按上述方法處理跑電泳前的樣品，未算好體積加樣品和蛋白樣品處理液，只是隨意處理樣品，未加定量對照的純蛋白，電泳結(jié)果如圖4所示。

從電泳膠圖可以看出，對比陰性對照組，實驗組有目的蛋白表達(dá)。但因為處理樣品時未算好體積，而是隨意加樣，導(dǎo)致包涵體中目的蛋白量比全菌中的目的蛋白還要多，因此不能反映目的蛋白在上清液和包涵體中的表達(dá)分布情況。即使假如加了定量蛋白，可能通過凝膠分析系統(tǒng)得出全菌、上清液和包涵體中目的蛋白的量，但因為沒有記錄制備電泳樣品的各項數(shù)據(jù)，從而也是無法定量算出可溶性目的蛋白的表達(dá)水平。因此制備電泳樣品時要遵循上述方法。

本發(fā)明技術(shù)效果主要體現(xiàn)在以下方面：本方法發(fā)明操作簡單方便，所用到的儀器設(shè)備都是生物實驗室常用儀器。從定量的角度上來分析蛋白表達(dá)情況，解決現(xiàn)有問題，為后續(xù)蛋白表達(dá)優(yōu)化，蛋白放大生產(chǎn)及分離純化提供可靠依據(jù)。

當(dāng)然，以上只是本發(fā)明的典型實例，除此之外，本發(fā)明還可以有其它多種具體實施方式，凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。