本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種病毒活性快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

人類(lèi)的很多疾病由病毒引起，目前有效的抗病毒性藥物較少，病毒性疾病的防治主要需要依靠疫苗等進(jìn)行預(yù)防。因此要控制病毒的傳播、最小化病毒所致死亡率，對(duì)病毒活性進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)至關(guān)重要。

病毒需要在宿主細(xì)胞內(nèi)才能增殖，活病毒首先通過(guò)隨機(jī)碰撞、靜電引力，與宿主細(xì)胞形成非特異性吸附；然后病毒通過(guò)自身的粘附素與宿主細(xì)胞表面的特異性黏附受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生改變，病毒核酸或病毒進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行生物合成、裝配和釋放。傳統(tǒng)病毒檢測(cè)方法是通過(guò)測(cè)定活病毒感染并殺死宿主細(xì)胞后形成的空斑數(shù)量(空斑形成單位，plaqueformingunit,pfu)，測(cè)定是否存在活病毒，計(jì)算空斑形成單位(pfu)確定病毒滴度，并進(jìn)一步對(duì)病毒進(jìn)行分型?？瞻咝纬蓪?shí)驗(yàn)是病毒活性的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于通過(guò)觀察病毒裂解細(xì)胞后形成的空斑檢測(cè)病毒活性和病毒滴度，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，通常需要2-4天的時(shí)間，且干擾因素多，操作步驟繁多，需要一定熟練程度的人來(lái)操作，無(wú)法滿足實(shí)際需要，更重要的是有些情況下病毒不能被培養(yǎng)出來(lái)。pcr和免疫熒光等方法可靈敏快速地測(cè)定靶病毒滴度和分型，但這些方法均無(wú)法測(cè)定病毒活性。因此，開(kāi)發(fā)無(wú)需培養(yǎng)的病毒活性快速檢測(cè)技術(shù)，在病毒性疾病的預(yù)防和控制中十分重要。

為了開(kāi)發(fā)無(wú)需培養(yǎng)的病毒活性快速檢測(cè)技術(shù)，本發(fā)明利用分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymers，mips)，目前，細(xì)菌的mips制備已有少量研究，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的mips則極少有報(bào)道。在細(xì)菌mip中，部分研究者以細(xì)菌表面蛋白為模板制備mips，例如khan等人在單壁碳納米管上，以金黃色葡萄球菌外層有代表性的蛋白a為模板，通過(guò)循環(huán)伏安法使3-氨基酚發(fā)生電聚合制備mips，在有牛血清白蛋白干擾的情況下，mips對(duì)模板仍有良好的選擇性(khanmsr,moreiraftc,riujetal.plasticantibodyfortheelectrochemicaldetectionofbacterialsurfaceproteins.sensoractuatb-chem,2016,233:697-704.)。jiang等人在磁性納米顆粒表面，以革蘭陰性菌的信號(hào)分子ahls為模板，通過(guò)表面印跡制備了mips，可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行間接檢測(cè)(jiangh,jiangd,shaojetal.magneticmolecularlyimprintedpolymernanoparticlesbasedelectrochemicalsensorforthemeasurementofgram-negativebacterialquorumsignalingmolecules(n-acyl-homoserine-lactones).biosensbioelectron,2016,75:411-419.)。idil等人以整個(gè)大腸桿菌為模板，以n-甲基丙烯酰-l-組氨酸、2-甲基丙烯酸羥乙酯為功能單體，以乙二醇二甲基丙烯酸為交聯(lián)劑，用紫外光進(jìn)行引發(fā)，制備大腸桿菌mips，可特異性吸附模板大腸桿菌。對(duì)大腸桿菌的檢出限為70cfu/ml，檢測(cè)范圍為1.0×102-1.0×107cfu/ml。該方法用于果汁和河水中加標(biāo)大腸桿菌的檢測(cè)，回收率為81-97％(idiln,hedstromm,denizliaetal.wholecellbasedmicrocontactimprintedcapacitivebiosensorforthedetectionofescherichiacoli.biosensbioelectron,2017,87:807-815.)。roy等人以整個(gè)大腸桿菌為模板，以n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺為功能單體制備大腸桿菌mips。與亞鐵/鐵氰化物氧化還原探針連用，可實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)，且與大腸桿菌在10-109cfu/ml范圍線性相關(guān)，檢出限為10cfu/ml。除了能檢測(cè)外，該材料還可從水樣中捕獲超過(guò)98％的大腸桿菌。最后該材料還可以通過(guò)光熱在5分鐘內(nèi)殺死10⁵cfu/ml大腸桿菌(roye,patras,tiwariaetal.singlecellimprintingonthesurfaceofag-znobimetallicnanoparticlemodifiedgrapheneoxidesheetsfortargeteddetection,removalandphotothermalkillingofe.coli.biosensbioelectron,2017,89(pt1):620-626.)。以上研究均表明細(xì)菌mips可特異性結(jié)合并檢測(cè)靶細(xì)菌，但是，如何利用mips測(cè)定病毒活性至今仍是需亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決以上問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種病毒活性快速檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法具有快速、安全、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

病毒活性快速檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1)制備宿主靶細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物：

首先稱(chēng)取多巴胺和丹磺酰多巴胺，配制多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液；然后將多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液、宿主靶細(xì)胞與載體混合均勻，以宿主靶細(xì)胞為模板、丹磺酰多巴胺為熒光功能單體、多巴胺為功能單體，在載體表面進(jìn)行聚合反應(yīng)得到宿主靶細(xì)胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體；最后利用洗脫劑將宿主靶細(xì)胞從宿主靶細(xì)胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體上洗脫下來(lái)，得到宿主靶細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物；

2)檢測(cè)病毒活性：

向熒光分子印跡聚合物中加入宿主靶細(xì)胞和病毒樣品，即刻測(cè)定熒光值為i0，待病毒樣品中的病毒完全侵染宿主靶細(xì)胞后，測(cè)定熒光值為i，i/i0-1表示熒光變化水平，通過(guò)熒光變化水平確定病毒樣品中是否含有靶病毒以及該靶病毒的含量。

作為優(yōu)選方案，所述步驟1)中載體為經(jīng)聚多巴胺修飾后的多巴胺-載體復(fù)合體，所述多巴胺-載體復(fù)合體是通過(guò)將多巴胺和載體材料混合，并在過(guò)硫酸銨催化作用下，多巴胺在載體材料表面發(fā)生自聚合反應(yīng)而制得。載體材料經(jīng)多巴胺修飾后得到的多巴胺-載體復(fù)合體能提供大量的氨基和兒茶酚基，可與細(xì)菌壁外層的功能基團(tuán)發(fā)生作用，增加了與細(xì)菌的結(jié)合能力，從而使熒光變化更明顯，使測(cè)定的結(jié)果更加準(zhǔn)確。

作為優(yōu)選方案，所述載體材料為納米微球、微米微球或多孔板。

作為優(yōu)選方案，所述多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液中還包括催化劑，所述催化劑為過(guò)硫酸銨。

作為優(yōu)選方案，所述多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液中多巴胺、丹磺酰多巴胺、過(guò)硫酸銨的摩爾比為4:1:1。

作為優(yōu)選方案，所述宿主靶細(xì)胞為大腸桿菌或雞胚細(xì)胞，所述大腸桿菌的濃度為10⁴～10⁶cfu/ml，所述雞胚細(xì)胞的濃度為10⁴～10⁶個(gè)/ml；所述洗脫劑為去離子水。

本發(fā)明制得的熒光分子印跡聚合物，包括載體材料以及聚合在載體材料表面的丹磺酰多巴胺/多巴胺熒光層，所述丹磺酰多巴胺/多巴胺熒光層具有特異性結(jié)合宿主靶細(xì)胞的印跡孔穴。其中，所述載體材料為納米微球、微米微球或多孔板，所述印跡孔穴的直徑為0.8～1.7μm。

所述熒光分子印跡聚合物是通過(guò)熒光分子印跡聚合物的制備方法制備而得，所述熒光分子印跡聚合物的制備方法為：首先制備多巴胺-載體復(fù)合體：將多巴胺與載體材料混合，并在過(guò)硫酸銨催化作用下，多巴胺在載體材料表面發(fā)生自聚合反應(yīng)制得多巴胺-載體復(fù)合體；然后制備宿主靶細(xì)胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體：首先稱(chēng)取多巴胺、丹磺酰多巴胺和過(guò)硫酸銨，配制多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液；然后將多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液、宿主靶細(xì)胞和多巴胺-載體復(fù)合體混合均勻，以宿主靶細(xì)胞為模板、丹磺酰多巴胺為熒光功能單體、多巴胺為功能單體，在多巴胺-載體復(fù)合體表面進(jìn)行聚合反應(yīng)得到宿主靶細(xì)胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體；最后洗脫宿主靶細(xì)胞：利用去離子水將宿主靶細(xì)胞從宿主靶細(xì)胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體上洗脫下來(lái)，得到該宿主靶細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物。

本發(fā)明制得的熒光分子印跡聚合物在測(cè)定水中病毒含量以及區(qū)分水中活病毒和死病毒的應(yīng)用。由于熒光分子印跡聚合物耐受水中其他病毒、離子、有機(jī)物的干擾，采用熒光分子印跡聚合物能準(zhǔn)確的區(qū)分水中活病毒和死病毒以及測(cè)定水中的病毒含量。

本發(fā)明的病毒活性快速檢測(cè)方法的原理是：

分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymers，mips)是化學(xué)合成的高分子聚合物，通過(guò)特定的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵(包括共價(jià)鍵、離子鍵、氫鍵等)特異性識(shí)別和結(jié)合靶分子，其吸附特異性與天然抗體類(lèi)似，但耐受有機(jī)溶劑、離子、酸堿、高溫和高壓。其中含熒光的mips，又稱(chēng)熒光分子印跡聚合物(fluorescentmolecularlyimprintedpolymers,fmips)，不僅可以特異性結(jié)合模板分子，同時(shí)模板分子的結(jié)合還可以導(dǎo)致熒光mip發(fā)生熒光信號(hào)的改變(如熒光波長(zhǎng)改變，或者熒光強(qiáng)度改變)，根據(jù)熒光信號(hào)的改變，即可測(cè)定與fmips特異性結(jié)合的模板分子的含量。

結(jié)合圖1所示，本發(fā)明以宿主靶細(xì)胞為模板、丹磺酰多巴胺作為熒光功能單體，多巴胺作為功能單體，在載體表面制備宿主靶細(xì)胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體，然后再?gòu)膹?fù)合體上將宿主靶細(xì)胞洗脫，即得到可特異性吸附宿主靶細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物(fmips)。

當(dāng)活的宿主靶細(xì)胞與fmips結(jié)合時(shí)，可導(dǎo)致fmips的熒光減弱，加入帶檢測(cè)的病毒樣品，如果樣品中存在活病毒，則活病毒會(huì)侵染結(jié)合在fmips上的宿主靶細(xì)胞，造成細(xì)胞破裂，并從fmips上脫落，從而使fmips熒光增強(qiáng)。通過(guò)比較病毒樣品加樣前后的熒光改變，即可快速測(cè)定樣品中是否存在活病毒，并初步確定活病毒的數(shù)量。

本發(fā)明中采用的丹磺酰多巴胺的制備方法參閱中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利(授權(quán)公告號(hào)cn103992252b授權(quán)公告日2016.06.22)公開(kāi)的一種多巴胺衍生物及分子印跡聚合物制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1，本發(fā)明通過(guò)使用丹磺酰多巴胺和多巴胺在載體表面進(jìn)行聚合反應(yīng)制備得到宿主靶細(xì)胞的fmips，由于丹磺酰多巴胺和多巴胺在水相條件下即可進(jìn)行聚合反應(yīng)，在水相條件下保證了宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而且聚多巴胺可為細(xì)菌和細(xì)胞印跡提供豐富的羥基，提高了fmips的印跡效果。

2，宿主靶細(xì)胞的fmips對(duì)宿主靶細(xì)胞具有特異性識(shí)別能力。fmips集特異性吸附和熒光檢測(cè)于一體，不僅可以特異性吸附宿主靶細(xì)胞，還可以根據(jù)熒光的改變，直接快速測(cè)定其結(jié)合的宿主靶細(xì)胞數(shù)量。

3，利用宿主靶細(xì)胞的fmips，可以特異性檢測(cè)侵染宿主靶細(xì)胞的活病毒的濃度，還可區(qū)分活病毒和死病毒，而且還能檢測(cè)細(xì)菌病毒和人類(lèi)病毒等多種病毒，無(wú)需培養(yǎng)病毒，能快速檢測(cè)病毒活性。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明病毒活性快速檢測(cè)方法的流程圖；

圖2a為使用經(jīng)聚多巴胺修飾的多巴胺-載體復(fù)合體和不使用聚多巴胺修飾的多巴胺-載體復(fù)合體，所制備的fmips吸附宿主靶細(xì)胞前后的熒光變化水平圖；

圖2b為多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液的過(guò)硫酸銨、多巴胺和丹磺酰多巴胺配比優(yōu)化圖；

圖2c為使用不同洗脫液所制備的fmips吸附宿主靶細(xì)胞后的熒光變化水平圖；

圖2d為使用不同的宿主靶細(xì)胞濃度制備的fmips吸附宿主靶細(xì)胞后的熒光變化水平圖；

圖3a為實(shí)施例1制得的e.coli-fmips-ⅰ的電鏡掃描圖；

圖3b為對(duì)比例1制得的fnip的電鏡掃描圖；

圖3c為fmips膜的厚度的測(cè)量；

圖3d為聚多巴胺修飾多孔板得到的多巴胺-載體復(fù)合體上的單層多巴胺膜(pda)厚度的測(cè)量；

圖3e為單層多巴胺膜(pda)、e.coli-fmips-ⅰ和fnip膜的熱重曲線；

圖4a為e.coli-fmips-ⅰ對(duì)e.coli285的吸附等溫曲線圖；

圖4b為e.coli-fmips-ⅰ吸附動(dòng)力學(xué)曲線；

圖4c為e.coli-fmips-ⅰ吸附e.coli285時(shí)熒光隨時(shí)間變化趨勢(shì)線圖；

圖4d為e.coli-fmips-ⅰ對(duì)活菌和死菌的識(shí)別能力圖；

圖5a為e.coli-fmips-ⅰ檢測(cè)f2噬菌體的熒光變化時(shí)間趨勢(shì)圖；

圖5b為e.coli-fmips-ⅰ檢測(cè)t4噬菌體的熒光變化時(shí)間趨勢(shì)圖；

圖5c為e.coli-fmips-ⅰ檢測(cè)m13噬菌體的熒光變化時(shí)間趨勢(shì)圖；

圖6a為不同大腸桿菌fmips對(duì)相應(yīng)噬菌體的熒光響應(yīng)圖(p<0.05)；

圖6b為e.coli285-fmip對(duì)不同噬菌體的熒光響應(yīng)圖(p<0.05)

圖6c為e.colitg1-fmip對(duì)不同噬菌體的熒光響應(yīng)圖(p<0.05)；

圖6d為e.colibl21-fmip對(duì)不同噬菌體的熒光響應(yīng)圖(p<0.05)；

圖7a為fmip對(duì)不同種類(lèi)活噬菌體及滅活噬菌體的熒光響應(yīng)圖(p<0.05)；

圖7b為不同感染復(fù)數(shù)引起的熒光響應(yīng)圖(p<0.05)；

圖8a為雞胚細(xì)胞-fmip的吸附等溫曲線；

圖8b為雞胚細(xì)胞的吸附動(dòng)力學(xué)曲線；

圖8c為雞胚細(xì)胞-fmips對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞的熒光響應(yīng)圖；

圖8d為雞胚細(xì)胞-fmips檢測(cè)流感病毒的熒光響應(yīng)圖；

圖中各部件標(biāo)號(hào)如下：宿主靶細(xì)胞(大腸桿菌)1、多巴胺2、丹磺酰多巴胺3、96孔酶標(biāo)板4、大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體5、大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物6、加入大腸桿菌后的熒光分子印跡聚合物7、病毒8、加入病毒后的熒光分子印跡聚合物9；其中，熒光值的大小為6>9>7。

具體實(shí)施方式

為解決現(xiàn)有技術(shù)中通過(guò)測(cè)定活病毒感染并殺死宿主細(xì)胞后形成的空斑數(shù)量的方法，存在培養(yǎng)時(shí)間、長(zhǎng)干擾因素多、操作步驟繁多的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種病毒活性快速檢測(cè)方法，本方法從制備病毒靶細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物為設(shè)計(jì)思路的出發(fā)，通過(guò)以宿主細(xì)胞為模板、丹磺酰多巴胺作為熒光功能單體，多巴胺作為功能單體，在載體表面發(fā)生聚合反應(yīng)，制備宿主靶細(xì)胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體材料復(fù)合體，再?gòu)膹?fù)合體上將靶細(xì)胞洗脫，得到可特異性吸附宿主靶細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物(fmips)來(lái)達(dá)到上述設(shè)計(jì)目的。以下通過(guò)具體的實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明的病毒活性快速檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明。

實(shí)施例1制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅰ

制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅰ的方法，包括步驟：

1)試劑的配制：

多巴胺溶液?。哼^(guò)硫酸銨與多巴胺以2:1的摩爾比溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

多巴胺溶液ⅱ：多巴胺溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液：多巴胺：丹磺酰多巴胺：過(guò)硫酸銨摩爾比＝4：1：1的摩爾比溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

載體材料：以96孔酶標(biāo)板作為載體材料；

宿主靶細(xì)胞：10⁴～10⁶cfu/ml的大腸桿菌菌液，大腸桿菌采用e.coli285；

洗脫液：去離子水；

2)多巴胺-載體復(fù)合體的制備(聚多巴胺修飾載體材料)：

向在96孔酶標(biāo)板中的每孔加300μl多巴胺溶液ⅰ，置于37℃的空氣中96孔酶標(biāo)板與多巴胺發(fā)生自聚合反應(yīng)，反應(yīng)24h后將孔中多巴胺溶液倒去，得到多巴胺-載體復(fù)合體；

3)大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體的制備：

向多巴胺-載體復(fù)合體中加入多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液和宿主靶細(xì)胞(大腸桿菌)，置于搖床中(溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為150rpm)緩慢振搖72h后倒去孔中的液體，即得大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體；

4)洗脫宿主靶細(xì)胞：

用去離子水反復(fù)洗滌大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體，將大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體中的大腸桿菌洗脫下來(lái)，每次洗滌30min，共洗滌6次，得到大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅰ，大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅰ以下均采用簡(jiǎn)稱(chēng)e.coli-fmips-ⅰ。

實(shí)施例2制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅱ

實(shí)施例2的制備方法與是實(shí)施例相比，區(qū)別在于：實(shí)施例2不進(jìn)行實(shí)施例1中的步驟2)，即實(shí)施例2不采用經(jīng)聚多巴胺修飾的多巴胺-載體復(fù)合體作為載體，而是直接將多巴胺，丹磺酰多巴胺，大腸桿菌在載體材料上聚合。具體過(guò)程如下：

1)大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體的制備：向96孔酶標(biāo)板中加入多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液和宿主靶細(xì)胞(大腸桿菌)，置于搖床中(溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為150rpm)緩慢振搖72h后倒去孔中的液體，即得大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體；；

2)洗脫宿主靶細(xì)胞：用洗脫劑反復(fù)洗滌大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體，將大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體中的大腸桿菌洗脫下來(lái)，每次洗滌30min，共洗滌6次，得到大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅱ。

實(shí)施例3制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅲ

大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅲ的制備方法與實(shí)施例1相同，不同之處在于：本實(shí)施例將實(shí)施例1步驟2)中的多巴胺溶液ⅰ改為多巴胺溶液ⅱ，多巴胺溶液ⅰ與多巴胺溶液ⅱ的區(qū)別在于過(guò)硫酸銨的是否添加。本實(shí)施例制備的大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅲ的方法在此不再贅述。

實(shí)施例4制備雞胚細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物

雞胚細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物制備方法與實(shí)施例1相同，不同之處在于：本實(shí)施例將實(shí)施例1步驟3)中的宿主靶細(xì)胞改為雞胚細(xì)胞(cek),本實(shí)施例制得的雞胚細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物以下均采用簡(jiǎn)稱(chēng)雞胚細(xì)胞-fmips。

實(shí)施例5制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅳ

1)試劑的配制：

多巴胺溶液?。哼^(guò)硫酸銨與多巴胺以2:1的摩爾比溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液：多巴胺：丹磺酰多巴胺：過(guò)硫酸銨摩爾比＝4：1：1的摩爾比溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

載體材料：以150mg/ml硅膠微球?yàn)檩d體材料；

宿主靶細(xì)胞：10⁴～10⁶cfu/ml的大腸桿菌菌液，大腸桿菌采用e.coli285；

洗脫液：去離子水

2)多巴胺-載體復(fù)合體的制備：

將150mg/ml硅膠微球與多巴胺溶液ⅰ在37℃攪拌混合10小時(shí)，硅膠微球與多巴胺發(fā)生自聚合反應(yīng)，10小時(shí)后取出硅膠微球，得到多巴胺-載體復(fù)合體；

3)大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體的制備：

向多巴胺-載體復(fù)合體中加入多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液和宿主靶細(xì)胞(大腸桿菌e.coli285)，置于搖床中(溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為150rpm)緩慢攪拌10小時(shí)后取出硅膠微球，即得大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體；

4)洗脫宿主靶細(xì)胞：

用洗脫劑反復(fù)洗滌大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體，將大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體中的大腸桿菌洗脫下來(lái)，每次洗滌30min，共洗滌6次，得到大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅳ。

實(shí)施例6制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅴ

大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅴ制備方法與實(shí)施例5相同，不同之處在于：本實(shí)施例將實(shí)施例5中的硅膠微球載體改為1mg/ml四氧化三鐵納米微球。

實(shí)施例7空白印跡聚合物(nip)的制備

分別制備實(shí)施例1～6的對(duì)比例，分別為對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3、對(duì)比例4、對(duì)比例5和對(duì)比例6。對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3、對(duì)比例4、對(duì)比例5和對(duì)比例6與對(duì)應(yīng)的實(shí)施例的制備方法相同，區(qū)別在于：不添加宿主靶細(xì)胞。以對(duì)比例1為例，其他在此不在贅述。

對(duì)比例1的制備方法與實(shí)施例1的制備方法相同，區(qū)別在于：步驟3)中不添加宿主靶細(xì)胞(大腸桿菌)。對(duì)比例1～6制得的空白印跡聚合物以下以及說(shuō)明說(shuō)附圖中均使用簡(jiǎn)稱(chēng)fnip。

實(shí)施例8反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化試驗(yàn)

向?qū)嵤├?～6中制備的細(xì)菌或細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物(fmips)以及各實(shí)施例對(duì)應(yīng)的空白印跡聚合物(fnips)中，分別加入300μlpbs緩沖溶液，測(cè)其熒光值作為i0，倒掉pbs緩沖溶液后，加入模板菌液或細(xì)胞液300μl后測(cè)其熒光值，作為i，用i0/i-1表示熒光變化程度。每個(gè)濃度平行測(cè)定3次取平均值，結(jié)果分別見(jiàn)圖2a、圖2b、圖2c、圖2d。以下分別對(duì)圖2a、圖2b、圖2c和圖2d作詳細(xì)的說(shuō)明。

圖2a為實(shí)施例1和實(shí)施例2的熒光變化水平對(duì)比圖，即使用聚多巴胺修飾的載體材料和不使用聚多巴胺的載體材料所制備的fmips吸附宿主靶細(xì)胞前后的熒光變化水平圖；實(shí)施例1中使用載體為聚多巴胺修飾的多巴胺-載體復(fù)合體，實(shí)施例2未對(duì)載體進(jìn)行修飾；分別測(cè)定fmips吸附宿主靶細(xì)胞前后的熒光變化水平。由圖2a可見(jiàn)，修飾在載體上的聚多巴胺膜(pda)的孔上再合成mips，熒光變化效果優(yōu)于未修飾聚多巴胺膜的。其原理是：聚多巴胺膜能提供大量的氨基和兒茶酚基，可與細(xì)菌壁外層的功能基團(tuán)發(fā)生作用，增加了與細(xì)菌的結(jié)合能力，從而使熒光變化明顯。

圖2b為多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液的過(guò)硫酸銨、多巴胺和丹磺酰多巴胺配比優(yōu)化圖；通過(guò)測(cè)定過(guò)硫酸銨、多巴胺和丹磺酰多巴胺，在不同的摩爾比之下制備的fmip和fnip吸附靶細(xì)菌前后的熒光變化水平，選擇最佳的配比。圖2b可以看出，使用了過(guò)硫酸銨的mip熒光變化量提高了兩倍以上，可知催化劑過(guò)硫酸銨的使用是成功制備抗病毒mip的前提。多巴胺：丹磺酰多巴胺與過(guò)硫酸銨的比例選為4:1:1時(shí)，fmip的熒光變化量最大，表明該條件下所制備的fmips吸附性能最佳。

圖2c為使用不同洗脫液，所制備的fmips吸附宿主靶細(xì)胞后的熒光變化水平圖；由圖2c可以看出，以去離子水為洗脫液的效果明顯優(yōu)于3％乙酸與1mol/lnacl的混合液。其原理是在低滲環(huán)境中，細(xì)菌可因吸水過(guò)度而膨脹死亡。本實(shí)驗(yàn)中以去離子水為洗脫液，提供低滲環(huán)境，可使大腸桿菌發(fā)生死亡而洗脫下來(lái)。

圖2d為使用不同的宿主靶細(xì)胞濃度時(shí)，所制備的fmips吸附宿主靶細(xì)胞后的熒光變化水平圖；由圖2d可以看出，當(dāng)e.coli285菌懸液濃度為10⁵cfu/ml時(shí)，熒光變化最為明顯，在小于10⁵cfu/ml時(shí)，隨著模板滴度增加，能與模板結(jié)合的功能單體數(shù)量也增加，致使結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量增加，熒光變化增加。

實(shí)施例9理化性質(zhì)分析試驗(yàn)

圖3a為實(shí)施例1制得的e.coli-fmips-ⅰ的電鏡掃描圖；

圖3b為對(duì)比例1制得的fnip的電鏡掃描圖；

由圖3a和圖3b可看出，e.coli-fmips-ⅰ與fnip均為膜狀物，圖3a可見(jiàn)，大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體在洗脫完宿主靶細(xì)胞后存在形態(tài)、大小不一的孔穴，這些孔穴為大腸桿菌去除后留下的三維孔穴結(jié)構(gòu)，形狀有圓形、橢圓形，為大腸桿菌的橫斷面、不同側(cè)面留下的印跡。孔穴直徑為0.8～1.7μm，這與大腸桿菌的大小一致。圖3b的fnips膜并沒(méi)有看出明顯的孔穴。

在以硅膠微球?yàn)檩d體材料，制備多巴胺-載體復(fù)合體，對(duì)多巴胺-載體復(fù)合體上的單層聚多巴胺膜(pda)、大腸桿菌285-fmips和fnips膜用元素分析儀對(duì)n、c、h元素含量進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，fmips、fnips膜中n、c元素含量相比單層pda膜明顯增加，說(shuō)明成功地在pda單層膜上制備了含更多n元素的丹磺酰多巴胺和多巴胺的fmips、fnips。

表1elementcompositionofpda,fmips,fnipsmembrane

圖3c為fmips膜的厚度的測(cè)量；

圖3d為修飾在載體上的單層多巴胺膜厚度的測(cè)量；

由圖3c和圖3d可以看出，fmips膜的厚度并不均一，范圍從16.0～48.0μm，而且明顯厚于單層多巴胺膜(約為2.8μm)。

圖3e為單層多巴胺膜(pda)、e.coli-fmips-ⅰ和fnip膜的熱重曲線；不同物質(zhì)會(huì)隨著溫度不斷升高而發(fā)生分解，導(dǎo)致重量下降，通過(guò)熱重分析可判斷形成的薄膜量。多巴胺在248℃開(kāi)始分解，而交聯(lián)后形成的聚多巴胺比較耐熱，在400℃開(kāi)始分解。從圖3e中可以看出，從425℃開(kāi)始三條線的重量有明顯的下降，該溫度正是聚多巴胺開(kāi)始分解的溫度，說(shuō)明三種膜均有聚多巴胺。至700℃單層pda膜失重約0.4％，fmip膜約失重2％，fnip膜約失重1.3％，說(shuō)明fmipf和nip膜明顯厚于單層pda膜，成功在單層pda膜上制備了fmip。

實(shí)施例10e.coli-fmips-ⅰ對(duì)e.coli285的吸附特性

如圖4a，e.coli-fmips-ⅰ對(duì)e.coli285的吸附等溫曲線圖；配制不同濃度的e.coli285菌懸液，分別加入到e.coli-fmips-ⅰ和對(duì)應(yīng)的fnip中，吸附平衡后，用平板涂布法測(cè)定上清液中細(xì)菌的滴度。以吸附量adsorption(cfu/cm²)為縱坐標(biāo)，菌液起始滴度c0(cfu/ml)為橫坐標(biāo)，繪制吸附等溫線。從圖4a可見(jiàn)當(dāng)起始菌液滴度小于800cfu/ml時(shí)，吸附容量隨著菌液的濃度增加而增加，大于800cfu/ml時(shí)，曲線趨于平緩，說(shuō)明此時(shí)fmip上的識(shí)別位點(diǎn)均已與大腸桿菌模板結(jié)合，達(dá)到吸附飽和狀態(tài)。

圖4b為e.coli-fmips-ⅰ吸附動(dòng)力學(xué)曲線；將100cfu/ml的e.coli285加入到fmip和fnip中，分別在0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h時(shí)間點(diǎn)用平板涂布法測(cè)上清菌液滴度，同時(shí)測(cè)其熒光變化。以吸附量adsorption(cfu/cm2)為縱坐標(biāo)，時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線；圖4b顯示，出在前1個(gè)小時(shí)，隨時(shí)間增加，吸附量明顯增加，吸附速率較快，吸附在1h后達(dá)到平衡。

圖4c為e.coli-fmips-ⅰ吸附e.coli285時(shí)熒光隨時(shí)間變化趨勢(shì)線圖；將100cfu/ml的e.coli285加入到fmip和fnip中，分別在0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h時(shí)間點(diǎn)測(cè)定fmips和fnips的熒光；圖4c顯示，fmips和fnips的熒光，與吸附率對(duì)應(yīng)，均在吸附1h后達(dá)到平衡。顯示熒光變化量可以準(zhǔn)確反映宿主細(xì)胞的吸附率。

圖4d為e.coli-fmips-ⅰ對(duì)活菌和死菌的識(shí)別能力圖；為評(píng)價(jià)e.coli-fmips-ⅰ在檢測(cè)過(guò)程中是否能區(qū)分活菌與死菌，分別在fmips、fnips中加入e.coli285活菌、高壓滅活菌、酒精滅活菌，待吸附平衡后，測(cè)定熒光變化i0/i-1。圖4d顯示fmips可以特異性識(shí)別活菌，對(duì)不同方法滅活的宿主細(xì)菌均可以有效識(shí)別。

實(shí)施例11e.coli-fmips-ⅰ檢測(cè)細(xì)菌病毒的時(shí)間變化規(guī)律

圖5a為e.coli-fmips-ⅰ檢測(cè)f2噬菌體的熒光變化時(shí)間趨勢(shì)圖；

圖5b為e.coli-fmips-ⅰ檢測(cè)t4噬菌體的熒光變化時(shí)間趨勢(shì)圖；

圖5c為e.coli-fmips-ⅰ檢測(cè)m13噬菌體的熒光變化時(shí)間趨勢(shì)圖；

f2和t4噬菌體為烈性噬菌體，可使宿主菌發(fā)生裂解，圖5a顯示f2噬菌體在前0.5h能使熒光快速發(fā)生變化，在2h處達(dá)到平衡狀態(tài)；圖5b可以看出t4噬菌體在侵染宿主菌后的前0.5h使熒光變化最快，但在1h時(shí)達(dá)到平衡。其原理是與f2的裂解周期比t4長(zhǎng)有關(guān)聯(lián)。m13為溫和噬菌體，可在不導(dǎo)致細(xì)菌死亡的情況下進(jìn)行增殖，圖5c顯示m13噬菌體在剛侵染宿主菌后，fmip和fnip的熒光隨時(shí)間沒(méi)有很明顯的變化，且fmip和fnip之間也沒(méi)有明顯差異。但在6～12小時(shí)范圍內(nèi)，mip熒光變化小幅度增加，其原理是吸附在fmips上的宿主菌開(kāi)始逐漸死亡。以上結(jié)果說(shuō)明本方法更適合用于可裂解宿主細(xì)胞的烈性病毒的快速檢測(cè)。

實(shí)施例12利用不同大腸桿菌的fmip檢測(cè)病毒活性

分別以e.coli285、e.colitg1、e.colibl21為宿主靶細(xì)胞，制備三種fmip，分別為285-fmip、tg1-fmip、bl21-fmip；分別加入f2、m13、t4的活噬菌體和滅活噬菌體去侵染相應(yīng)的宿主菌。

圖6a為不同大腸桿菌fmips對(duì)相應(yīng)噬菌體的熒光響應(yīng)(p<0.05)；圖6a可見(jiàn)，與活性噬菌體相比，滅活噬菌體沒(méi)有引起fmips的明顯響應(yīng)。說(shuō)明本方法對(duì)活性噬菌體和滅活噬菌體有很好的特異性，可用于病毒活性的檢測(cè)。

圖6b為e.coli285-fmip對(duì)不同噬菌體的熒光響應(yīng)(p<0.05)；在吸附了相應(yīng)宿主菌的大腸桿菌285、tg1、bl21三種fmips中，每種fmip均加入f2、m13、t4三種噬菌體，分析該方法對(duì)不同大腸桿菌病毒的檢測(cè)特異性。圖6b顯示，f2和t4噬菌體均可以侵染大腸桿菌285(f2噬菌體的宿主菌)，引起285-fmip的熒光變化，即大腸桿菌285-fmip可以測(cè)定f2和t4噬菌體的活性。

圖6c為e.colitg1-fmip對(duì)不同噬菌體的熒光響應(yīng)(p<0.05)；圖6c顯示f2和m13噬菌體可引起tg1-fmip熒光發(fā)生明顯改變(tg1為m13的宿主菌)，因m13為溫和噬菌體，引起tg1-fmip熒光變化低于f2噬菌體，表明tg1-fmips可以同時(shí)測(cè)定f2和m13活性。

圖6d為e.colibl21-fmip對(duì)不同噬菌體的熒光響應(yīng)(p<0.05)；圖6d可以看出只有t4噬菌能引起bl21-fmip(t4噬菌體宿主菌)的熒光變化，f2、m13不能引起bl21-fmip熒光變化。可見(jiàn)，大腸桿菌fmip可用于對(duì)該菌有侵染性的噬菌體活性檢測(cè)，若噬菌體不能侵染該菌則不會(huì)產(chǎn)生明顯的熒光變化，證明此方法的特異性良好。

實(shí)施例13不同大腸桿菌的fmip病毒感染能力的測(cè)定

在吸附了相應(yīng)宿主菌的285-fmip、tg1-fmip、bl21-fmip中，分別加入活的或滅活的f2、m13、t4活噬菌體；

圖7a為fmip對(duì)不同種類(lèi)活噬菌體及滅活噬菌體的熒光響應(yīng)(p<0.05)；圖7a顯示活性噬菌體可導(dǎo)致fmips熒光發(fā)生明顯改變，而滅活噬菌體則不能引起fmip的明顯響應(yīng)。該方法對(duì)活性噬菌體和滅活噬菌體有很好的特異性，可用于病毒活性的檢測(cè)。

圖7b為不同感染復(fù)數(shù)引起的熒光響應(yīng)(p<0.05)，分析不同的感染復(fù)數(shù)(moi)對(duì)fmips熒光改變的影響，圖7b可看出當(dāng)moi≥1時(shí)，即可導(dǎo)致fmips的熒光發(fā)生明顯的改變，差異經(jīng)t檢驗(yàn)，p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明1個(gè)噬菌體侵染1個(gè)大腸桿菌后，可在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)繁殖引起大腸桿菌破裂死亡，使結(jié)合fmip的大腸桿菌數(shù)量減少，引起明顯的熒光變化。這一數(shù)值明顯低于病毒活性金標(biāo)準(zhǔn)：噬菌斑形成實(shí)驗(yàn)(moi＝20)，表明本方法檢測(cè)病毒活性的靈敏度遠(yuǎn)高于噬菌斑形成實(shí)驗(yàn)法。

實(shí)施例14fmips檢測(cè)人類(lèi)病毒活性

為探討本方法在檢測(cè)人類(lèi)病毒上的應(yīng)用，首先利用優(yōu)化的fmips制備條件，以雞胚cek細(xì)胞為模板，制備了可特異性吸附雞胚細(xì)胞-fmips。配制不同濃度的cek細(xì)胞懸液，分別加入到雞胚細(xì)胞fmip和fnip中，吸附平衡后，用mtt法測(cè)定上清液中cek細(xì)胞的滴度，并繪制吸附等溫線。從圖8a可見(jiàn)當(dāng)起始細(xì)胞滴度小于360個(gè)/ml時(shí)，吸附容量隨著細(xì)胞液的濃度增加而增加，大于360個(gè)/ml時(shí)，曲線趨于平緩，說(shuō)明此時(shí)雞胚細(xì)胞-fmip上的識(shí)別位點(diǎn)均已與cek細(xì)胞板結(jié)合，達(dá)到吸附飽和狀態(tài)。

將100個(gè)/ml的雞胚cek細(xì)胞加入到雞胚細(xì)胞-fmip和對(duì)應(yīng)的fnip中，分別在0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h時(shí)間點(diǎn)用mtt法測(cè)上清細(xì)胞滴度，繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。圖8b顯示，在1個(gè)小時(shí)內(nèi)，隨時(shí)間增加，吸附量明顯增加，吸附速率較快，吸附在1h后達(dá)到平衡。

分別在fmips、fnips中加入活雞胚cek細(xì)胞、高壓滅活雞胚cek細(xì)胞、酒精滅活雞胚cek細(xì)胞，待吸附平衡后，測(cè)定熒光變化i0/i-1。圖8c顯示雞胚細(xì)胞-fmips可以特異性識(shí)別活細(xì)胞，對(duì)不同方法滅活的宿主細(xì)胞均可以有效識(shí)別。

利用cek細(xì)胞制備的雞胚細(xì)胞-fmips，檢測(cè)了活的流感病毒和死的流感病毒，結(jié)果(圖8d)顯示雞胚細(xì)胞-fmips可以特異性檢測(cè)活流感病毒，對(duì)死病毒無(wú)明顯的熒光改變。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。