本發(fā)明屬于微加工及生物檢測領(lǐng)域，涉及一種細胞釋放物的探測器及其探測方法。

背景技術(shù)：

生物傳感器具有靈敏度高，選擇性好，便攜操作性強，成本低，簡單，快捷等優(yōu)點。隨著生活水平不斷提高，人們對健康的追求越來越高，開發(fā)新型檢測裝置成為熱點。微陣列傳感器具有高通量、高選擇性、高靈敏度，微型化，智能化、集成化，低成本，高穩(wěn)定，高壽命等優(yōu)點。

傳統(tǒng)的微電極陣列主要以金屬、玻璃、硅等剛性材料為基底，通過沉積、光刻、腐蝕等微加工手段在其上形成屏幕或者三維結(jié)構(gòu)的微電極陣列。這些微電極雖然在空間分辨率、耐腐蝕性、靈敏度等方面具有各自的優(yōu)勢，但是由于幾乎不具有形變能力，在柔軟度匹配、共形貼附、以及動態(tài)形變匹配等方面很難滿足植入式要求，因此正在逐步被柔性微電極陣列技術(shù)所取代。

基于可穿戴設備的研究，具有靶組織接觸良好，減免機械損傷，降低免疫排斥反應的柔性微陣列傳感器，是當今電子、機械、儀器和醫(yī)學等領(lǐng)域的研究熱點之一，直接關(guān)系到機器人、醫(yī)療設備、可穿戴設備等載體的智能化和多功能化。

石墨烯良好的生物相容性、優(yōu)異的導電性和機械性能，以及良好的電化學活性，使其在柔性生物傳感應用方面展現(xiàn)出極大的優(yōu)勢?；谑└呷犴g性和機械強度，制備的石墨烯柔性電極，可以使電極與靶組織良好接觸，減少電極和生物組織之間的機械強度的不匹配，可以減少臨床應用中產(chǎn)生的機械損傷和免疫反應。此外，在神經(jīng)組織工程中，具有較高電子傳導速率的石墨烯還可以作為細胞的刺激電極，在沒有太多的化學反應下，加強與分化神經(jīng)元的電耦合，這使得石墨烯與活細胞的界面研究成為未來神經(jīng)假體裝置研發(fā)的熱點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種細胞釋放物的探測器及其探測方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：包括柔性基底，所述柔性基底的曲率值為0.18，還包括負載于柔性基底內(nèi)凹面的石墨烯膜，所述石墨烯膜由go基底和嵌于go基底中的rgo陣列組成，所述rgo陣列由直徑為20μm圓柱狀的rgo單元構(gòu)成，相鄰兩個單元的間距為60μm(兩個臨邊之間的距離)。

進一步地，所述石墨烯膜通過以下方法負載于柔性基底上：

(1)以柔性ito/pet為基底，控制三次旋涂的轉(zhuǎn)速和時間分別為1000rpm，8000rpm，1000rpm以及5s，10s，5s，旋涂正性光刻膠，然后在60℃烘膠臺上烘15min，用直徑為20μm，間隔60μm的掩膜曝光20s，后烘10min，顯影液中顯影8s。

(2)在步驟1處理后的基底上繼續(xù)旋涂4mg/ml的氧化石墨烯溶液6次，每次旋涂go過程為800rpm，5s；3000rpm，30s；1000rpm，5s。使得go浸潤到光刻膠凹槽內(nèi)部，旋涂均勻，得到附著go的柔性ito/pet基底。

(3)使用電化學工作站三電極系統(tǒng)還原附著基底表面的go，恒電位-0.9v，還原溶液體系為0.2mpbs(ph7.4)，還原50s。

(4)最后，將電化學還原得到的附著有rgo/go微電極陣列的柔性ito/pet基底放在丙酮溶液中沖洗，將光刻膠洗掉，上面的go薄膜落到柔性ito/pet基底，即得到圖案化rgo/go微電極陣列。

一種探測器檢測細胞釋放雙氧水的方法，使得細胞貼附于石墨烯膜上；然后進行循環(huán)伏安特性的測定，電解液為2.5mmk3fe(cn)6和0.1mkcl的水溶液。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：實現(xiàn)了不同曲率柔性基底go/rgo陣列的電化學性能的研究，和傳統(tǒng)的負載酶和納米催化劑的情況下對雙氧水的低濃度檢測相比，顯示了較高的靈敏度，具有很好的應用前景。

附圖說明

圖1為go/rgo微陣列電極片的制備流程圖；

圖2為石墨烯微陣列的形貌結(jié)構(gòu)；

圖3為不同曲率的伏安特性曲線；

圖4為k<0細胞對雙氧水的檢測曲線；

圖5為內(nèi)凹面和外凸面示意圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了提供一種基于柔性基底go/rgo陣列電極的彎曲曲率對細胞釋放物的探測器的制備方法。包括以下內(nèi)容：

柔性基底上rgo/go微陣列的制備：以柔性ito/pet為基底，控制三次旋涂的轉(zhuǎn)速和時間分別為1000rpm，8000rpm，1000rpm以及5s，10s，5s，旋涂正性光刻膠，然后在60℃烘膠臺上烘15min，紫外光刻機掩膜曝光20s，后烘10min，顯影液中顯影8s，得到光刻膠微陣列。接著，在步驟1得到的光刻膠微陣列的基底上繼續(xù)旋涂4mg/ml的氧化石墨烯溶液6次，每次旋涂go的轉(zhuǎn)速和時間分別為800rpm，3000rpm，1000rpm以及5s，30s，5s。每次旋涂都將go在光刻膠表面輕輕吹打，使得go浸潤到光刻膠凹槽內(nèi)部，旋涂均勻，得到附著go的柔性ito/pet基底。使用電化學工作站三電極系統(tǒng)還原附著基底表面的go，恒電位-1v，還原溶液體系為0.2mpbs(ph7.4)，還原50s。最后，將電化學還原得到的附著有rgo/go微電極陣列的柔性ito/pet基底放在丙酮溶液中沖洗，將光刻膠洗掉，上面的go薄膜落到柔性ito/pet基底，即得到圖案化rgo/go微電極陣列。

將電極片置于十二孔板內(nèi)，石墨烯膜所在的活性面朝上，滅菌后，放置到十二孔板內(nèi)，依次用pbs，dmem清洗，然后使用10％含血清培養(yǎng)液37℃孵化30min，最后接種細胞，接種密度約6000個/ml，37℃，5％co2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

取電極片兩片進行彎曲，彎曲呈曲率0.18，一片的活性面(貼附有細胞的石墨烯面)位于內(nèi)凹面，另一片位于外凸面。使用藥物pma(15μl0.5μg/l)刺激兩個微電極的表面細胞，通過觀察電流的變化，實現(xiàn)go/rgo電極對細胞釋放物的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同刺激條件下，內(nèi)凹面細胞負載具有更高的靈敏度，推測其原因，內(nèi)凹面更傾向于形成三維環(huán)繞，增加接收電信號的能力。

將負載有細胞的電極片彎曲，使得石墨烯膜位于電極片的內(nèi)凹面，曲率分別為0.06、0.08、0.10、0.12、0.18、0.25。分別進行電極的循環(huán)伏安特性的測定，電解質(zhì)為2.5mmk3fe(cn)6和0.1mkcl的混合溶液。圖3為不同曲率的伏安特性曲線。

將負載有細胞的電極片彎曲，使得石墨烯膜位于電極片的內(nèi)凹面，曲率分別為0.06、0.1、0.18、0.25，進行釋放物檢測：使用藥物pma(15μl0.5μg/l)刺激不同曲率的微電極表面細胞，通過觀察電流的變化，實現(xiàn)go/rgo電極對細胞釋放物的檢測。測定結(jié)果表明，k<0.18情況下，曲率增大效果增強，當k>0.18時，檢測效果減弱。分析其中原因，在彎曲情況下，電極表面電場分部發(fā)生變化，導致測定結(jié)果差異；圖4為曲率值k為0.06、0.1、0.18、0.25情況下細胞對雙氧水的檢測曲線，檢測限降低，靈敏度增加，而當k>0.18時，隨著曲率值的增大，靈敏度降低。

上述實例用來解釋說明本發(fā)明，然而并非限定本發(fā)明。在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。