本發(fā)明涉及熒光生物傳感器，尤其是涉及一種檢測(cè)核酸外切酶i(exoi)的熒光傳感方法。

背景技術(shù)：

核酸外切酶(exonucleases)是一類從多核苷酸鏈的一頭開始按序催化降解核苷酸的酶。核酸外切酶分為：核酸外切酶i(exoi)和核酸外切酶iii(exoiii)。exoi是一種僅能從單鏈dna(ssdna)的3’端到5’端，按照堿基順序，逐個(gè)催化水解堿基間的磷酸二酯鍵，逐漸降解ssdna的酶。exoi水解ssdna后，最終產(chǎn)物是逐個(gè)脫氧核糖核苷酸。exoi對(duì)ssdna的堿基序列是沒有要求的，不具有水解雙鏈dna的能力。核酸外切酶在生物學(xué)的很多過程中起著重要的作用，如dna復(fù)制、重組、修復(fù)等。其中最重要的功能就是維持生物體內(nèi)的基因突變幾率，從而維持遺傳信息的穩(wěn)定性。近年來，相繼報(bào)道了exoiii的定量檢測(cè)，然而exoi的研究還很少。

目前對(duì)exoi的活性檢測(cè)普遍缺乏定量描述，因?yàn)閭鹘y(tǒng)檢測(cè)exoi活性的方法是將標(biāo)準(zhǔn)的dna與核酸外切酶反應(yīng)，凝膠電泳觀察酶切效果，這種方法最多給出半定量結(jié)果，而且操作麻煩、重現(xiàn)性差，更不能實(shí)時(shí)給出不同條件下的酶活性變化。因此，發(fā)展一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的定量檢測(cè)exoi活性的方法，將有重要價(jià)值。

銥配合物具有發(fā)光效率高、較大的stokes位移、發(fā)光顏色可以通過改變配體結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)節(jié)以及良好的光穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)而成為研究的熱點(diǎn)。根據(jù)報(bào)道，銥配合物在生物傳感器方面的應(yīng)用越來越廣泛。陽(yáng)離子共軛聚合物(ccp)作為一種新型的水溶性熒光分子，具有摩爾吸光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，共軛聚合物具有分子導(dǎo)線的功能，能夠?qū)崿F(xiàn)熒光信號(hào)的放大。銥配合物和ccp可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)現(xiàn)象。

本發(fā)明基于銥配合物和ccp的fret現(xiàn)象，構(gòu)建一種簡(jiǎn)單、高靈敏、快速的分析傳感方法，用于定量檢測(cè)exoi，過程及其簡(jiǎn)單，為臨床應(yīng)用提供了一種很有前景的檢測(cè)手段。目前，基于銥配合物和ccp的fret現(xiàn)象檢測(cè)exoi活性的熒光傳感器尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性好、靈敏度高、檢測(cè)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)exoi的熒光傳感方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種檢測(cè)exoi的熒光傳感方法，具體步驟如下：

(1)將85～95μl濃度為3～4μmccp與0.5～2μl濃度為0.5～2mm銥配合物混合，然后加入相應(yīng)體積的10×exoi緩沖液，得到100μl用于檢測(cè)exoi的基于ccp與銥配合物fret效應(yīng)的熒光傳感器體系。檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值。

(2)加入1～3μl5～15μm的ssdna到步驟(1)中的體系，檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值。

(3)不同濃度的exoi加入到步驟(2)中，然后加入相應(yīng)體積的10×exoi緩沖液，30～40℃下溫育25～35min，檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值，獲得一系列不同濃度的exoi對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度比值，建立熒光強(qiáng)度比值與exoi濃度之間的定量關(guān)系；根據(jù)這個(gè)定量關(guān)系可以檢測(cè)樣品中exoi的活性。

利用上述基于銥配合物和ccp的熒光生物傳感器檢測(cè)exoi的方法，進(jìn)行熒光分析，設(shè)置狹縫寬度為：10nm，激發(fā)波長(zhǎng)是380nm，掃描電壓是700v，檢測(cè)ccp/ssdna/銥配合物體系對(duì)不同活性的exoi的檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度(i415)與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值(i530)。

發(fā)明原理：本發(fā)明基于ssdna干擾ccp與銥配合物之間的fret發(fā)展了一種無標(biāo)記、簡(jiǎn)單便利的傳感器用于檢測(cè)exoi的活性。由于ccp帶正電，與帶有負(fù)電的銥配合物之間通過靜電作用發(fā)生fret，加入ssdna時(shí)，二者的熒光強(qiáng)度比值減少；當(dāng)有exoi存在時(shí)，由于exoi水解ssdna，使得二者的熒光強(qiáng)度比值增大。exoi濃度越大，二者的熒光強(qiáng)度比值i530/i415越大，熒光強(qiáng)度比值與exoi濃度的對(duì)數(shù)之間呈線性關(guān)系。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明構(gòu)建了一種檢測(cè)exoi的熒光傳感方法。首先，利用ssdna干擾ccp與銥配合物之間的fret。其次，exoi存在時(shí)，利用exoi水解ssdna，使得i530/i415增大。exoi濃度越大，二者的熒光強(qiáng)度比值i530/i415越大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光強(qiáng)度比值與exoi濃度的對(duì)數(shù)之間呈線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)exoi的檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)高靈敏度。在0.01-2u/ml濃度范圍內(nèi)，i530/i415值與exoi濃度(c)的對(duì)數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為i530/i415＝1.29+0.45×1gc(u/ml)，線性相關(guān)系數(shù)r²＝0.9926，表示曲線具有很好的擬合度，檢測(cè)限為0.01u/ml。這些結(jié)果表明，該傳感器對(duì)exoi的檢測(cè)具有較低檢測(cè)限和較高靈敏度。

(2)高特異性。核酸外切酶(exoiii)、限制內(nèi)切酶(hindiii)、核酸外切酶(λ-exo)、限制內(nèi)切酶(ecori)作為對(duì)照物質(zhì)，均為0.1u/ml，檢測(cè)均無干擾。

(3)結(jié)果準(zhǔn)確。在10％尿液和10％血清環(huán)境中，回收率均在90％～110％之間。

(4)制備與檢測(cè)方法試劑用量少、檢測(cè)速度快、成本低。本發(fā)明只需消耗少量材料和試劑就可實(shí)現(xiàn)對(duì)exoi的高靈敏檢測(cè)。

綜上所述，本發(fā)明是基于ssdna干擾ccp與銥配合物之間的fret構(gòu)建一種無標(biāo)記、簡(jiǎn)單便利的傳感器用于檢測(cè)exoi的活性，具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單、分析快速、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)低濃度exoi的檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明傳感器的可行性實(shí)驗(yàn)圖；

圖2為本發(fā)明傳感器對(duì)不同濃度exoi的熒光響應(yīng)圖；

圖3為本發(fā)明傳感器對(duì)不同濃度exoi的校準(zhǔn)曲線圖；

圖4為本發(fā)明傳感器對(duì)exoi的選擇性實(shí)驗(yàn)圖；

圖5為本發(fā)明傳感器對(duì)exoi的抗干擾實(shí)驗(yàn)圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

一、具體實(shí)施例

實(shí)施例1

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種檢測(cè)exoi的熒光傳感方法，具體步驟如下：

(1)將90μl濃度為3.28μmccp與1μl濃度為1mm銥配合物混合，然后加入相應(yīng)體積的10×exoi緩沖液，得到100μl用于檢測(cè)exoi的基于ccp與銥配合物fret效應(yīng)的熒光傳感器體系。檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值。

(2)加入2μl10μm的ssdna到步驟(1)中的體系，檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值。

(3)不同濃度的exoi加入到步驟(2)中，然后相應(yīng)體積的10×exoi緩沖液，37℃下溫育30min，檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值，獲得一系列不同濃度的exoi對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度比值，建立熒光強(qiáng)度比值與exoi濃度之間的定量關(guān)系；根據(jù)這個(gè)定量關(guān)系可以檢測(cè)樣品中exoi的活性。

實(shí)施例2

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種檢測(cè)exoi的熒光傳感方法，具體步驟如下：

(1)將85μl濃度為4μmccp與2μl濃度為1mm銥配合物混合，然后加入相應(yīng)體積的10×exoi緩沖液，得到100μl用于檢測(cè)exoi的基于ccp與銥配合物fret效應(yīng)的熒光傳感器體系。檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值。

(2)加入1μl15μm的ssdna到步驟(1)中的體系，檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值。

(3)不同濃度的exoi加入到步驟(2)中，然后相應(yīng)體積的10×exoi緩沖液，34℃下溫育30min，檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值，獲得一系列不同濃度的exoi對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度比值，建立熒光強(qiáng)度比值與exoi濃度之間的定量關(guān)系；根據(jù)這個(gè)定量關(guān)系可以檢測(cè)樣品中exoi的活性。

實(shí)施例3

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種檢測(cè)exoi的熒光傳感方法，具體步驟如下：

(1)將95μl濃度為3μmccp與0.5μl濃度為2mm銥配合物混合，然后加入相應(yīng)體積的10×exoi緩沖液，得到100μl用于檢測(cè)exoi的基于ccp與銥配合物fret效應(yīng)的熒光傳感器體系。檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值。

(2)加入3μl5μm的ssdna到步驟(1)中的體系，檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值。

(3)不同濃度的exoi加入到步驟(2)中，然后相應(yīng)體積的10×exoi緩沖液，32℃下溫育30min，檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值，獲得一系列不同濃度的exoi對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度比值，建立熒光強(qiáng)度比值與exoi濃度之間的定量關(guān)系；根據(jù)這個(gè)定量關(guān)系可以檢測(cè)樣品中exoi的活性。

二、可行性實(shí)驗(yàn)

測(cè)定ccp/銥配合物體系的熒光強(qiáng)度；加入66個(gè)堿基的ssdna組成ccp/ssdna/銥配合物體系，測(cè)定其熒光強(qiáng)度；加入exoi(10u/ml，1μl)，37℃下培養(yǎng)30min，測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度。另外在只有ccp/銥配合物的體系中加入加入exoi(10u/ml，1μl)，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。同時(shí)利用化學(xué)發(fā)光熒光成像系得到各溶液的熒光圖像(具體實(shí)施示例1)。當(dāng)體系中存在ccp和銥配合物時(shí)發(fā)生高效的fret；加入ssdna后，fret效率急劇減??；由于exoi存在時(shí)水解ssdna，530nm處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，體系中的ccp和銥配合物重新發(fā)生fret(如圖1)。所以我們?cè)O(shè)計(jì)的基于ccp和銥配合物fret效應(yīng)的熒光傳感器可以檢測(cè)exoi的活性，而且可定量檢測(cè)exoi的濃度，有一定的應(yīng)用潛能。

三、exoi檢測(cè)應(yīng)用

1、利用上述具體實(shí)施例1制備的熒光生物傳感器檢測(cè)exoi的方法

利用熒光分析，設(shè)置狹縫寬度為：10nm，激發(fā)波長(zhǎng)是380nm，掃描電壓是700v，檢測(cè)ccp/ssdna/銥配合物體系中ccp(415nm)的熒光強(qiáng)度與銥配合物(530nm)的熒光強(qiáng)度比值i530/i415對(duì)不同濃度exoi的定量關(guān)系，根據(jù)兩者之間的定量關(guān)系，確定待測(cè)樣品中exoi的含量(具體實(shí)施示例1)。圖2在530nm處的熒光強(qiáng)度隨exoi濃度的增加而增強(qiáng)，這就意味著ccp與銥配合物重新發(fā)生高效的fret，因此fret效率增大。

2、靈敏度試驗(yàn)

利用熒光分析，設(shè)置狹縫寬度為：10nm，激發(fā)波長(zhǎng)是380nm，掃描電壓是700v，上述具體實(shí)施例1制備的ccp/ssdna/銥配合物體系的熒光強(qiáng)度比值i530/i415，exoi濃度的范圍為0～2u/ml(具體實(shí)施示例1)。試驗(yàn)結(jié)果說明，如圖3所示，說明隨著exoi濃度的增大，i530/i415越明顯；傳感器i530/i415對(duì)exoi濃度的對(duì)數(shù)的線性相關(guān)方程為i530/i415＝1.29+0.45×igc(u/ml)，r²＝0.9926，線性范圍為0.01～2.0u/ml，根據(jù)s/n計(jì)算得知，檢測(cè)限為0.01u/ml。說明傳感器對(duì)exoi可實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)。

3、特異性實(shí)驗(yàn)

選擇性實(shí)驗(yàn)與抗干擾實(shí)驗(yàn)如圖4和5所示，其中exoi及其他酶的濃度均為0.1u/ml，所用到的其他酶如下：核酸外切酶(exoiii)、限制內(nèi)切酶(hindiii)、核酸外切酶(λ-exo)、限制內(nèi)切酶(ecori)。

(1)選擇性實(shí)驗(yàn)

利用熒光分析，設(shè)置狹縫寬度為：10nm，激發(fā)波長(zhǎng)是380nm，掃描電壓是700v，上述具體實(shí)施例1制備的ccp/ssdna/銥配合物體系分別檢測(cè)濃度為0.1u/ml的核酸外切酶(exoiii)、限制內(nèi)切酶(hindiii)、核酸外切酶(λ-exo)、限制內(nèi)切酶(ecori)。如圖4，與exoi對(duì)比，傳感器對(duì)其他酶的響應(yīng)非常小，基本接近空白信號(hào)，說明傳感器對(duì)于exoi的檢測(cè)有很好的選擇性。

(2)抗干擾實(shí)驗(yàn)，

利用熒光分析，設(shè)置狹縫寬度為：10nm，激發(fā)波長(zhǎng)是380nm，掃描電壓是700v，上述具體實(shí)施例1制備的ccp/ssdna/銥配合物體系，在0.1u/ml存在下分別檢測(cè)濃度為0.1u/ml的核酸外切酶(exoiii)、限制內(nèi)切酶(hindiii)、核酸外切酶(λ-exo)、限制內(nèi)切酶(ecori)，比較傳感器對(duì)四個(gè)體系及僅exoi存在時(shí)的熒光響應(yīng)，如圖5，觀察到i530/i415的大小與僅有exoi存在時(shí)的i530/i415基本沒有差異，說明傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)exoi的特異性檢測(cè)。

當(dāng)然，上述說明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。