一、技術領域

本發(fā)明涉及指紋檢測領域，特別涉及一種基于蛋白質(zhì)印記法提取并顯現(xiàn)血潛指紋的方法。

二、

背景技術：

指紋鑒定是進行個人識別的最可靠的方法之一，目前警方利用刑事技術偵破的案件中，指紋識別占七成左右。指紋一度被司法界公認為“物證之首”。但隨著犯罪活動智能化程度的發(fā)展，清晰完整手印的發(fā)現(xiàn)、提取率明顯下降。特別是命案現(xiàn)場上遺留有嫌疑人血指紋的幾率大，但血指紋的發(fā)現(xiàn)及提取難度大，后期檢驗鑒定困難。

申請公布號為“cn103543145a”的中國發(fā)明專利公開了“基于化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析的潛在指紋成像的方法”，該方法在指紋上直接加入手指代謝物的抗體溶液進行孵育，孵育完成后用緩沖液進行沖洗；將所述的指紋樣本干燥，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗進行孵育；孵育后，用緩沖溶液沖洗指紋樣本，干燥后將指紋樣本置于化學發(fā)光反應底物溶液中，采集指紋圖像。該方法雖然簡單快速，但是該方法容易受雜質(zhì)影響(如指紋中的油脂、灰塵)，存在非特異性吸附的問題。

蛋白質(zhì)印跡法是蛋白質(zhì)分析最成熟的技術之一。該方法主要利用抗原抗體的高特異性結(jié)合原理，通過信號放大作用，將基底的蛋白部分以圖像的形式顯現(xiàn)出來，方法直觀、方便。本發(fā)明采用蛋白質(zhì)印跡法提取血潛指紋中的蛋白質(zhì)成分，可避免油脂、灰塵等雜質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，提高檢測結(jié)果的準確性。本發(fā)明為研究血潛指紋中的蛋白質(zhì)成分提供了科學依據(jù)，并可有效地提高公安機關提取鑒別血潛指紋的工作效率。

三、

技術實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有技術的不足，解決現(xiàn)有技術中血指紋的發(fā)現(xiàn)及提取難度大，后期檢驗鑒定困難的問題，本發(fā)明提供了一種基于蛋白質(zhì)印記法提取并顯現(xiàn)血潛指紋的方法。本發(fā)明方法簡單、檢測特異性好、發(fā)光強度高，可對指紋清晰顯現(xiàn)。

本發(fā)明的技術方案為：

一種基于蛋白質(zhì)印記法提取并顯現(xiàn)血潛指紋的方法，包括步驟：

1)將客體上殘留的血潛指紋樣本轉(zhuǎn)移至sds-page膠上；

2)將指紋樣本上的目的蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜上；

3)將步驟2)處理后的pvdf膜浸入脫脂牛奶中封閉0.5-2h，然后清洗pvdf膜上過多的牛奶；

4)向步驟3)處理后的pvdf膜上滴加一抗溶液進行孵育，孵育完成后清洗過多抗體；

5)向步驟4)處理后的pvdf膜上滴加辣根過氧化物酶標記的二抗溶液進行孵育，孵育完成后清洗過多抗體；

6)向步驟5)處理后的pvdf膜上滴加顯影液，暗箱中顯影，得到清晰的指紋圖像。

作為優(yōu)選方案，步驟1)中，sds-page膠的組成如下：4-5ml水、2-3ml30％的丙烯酰胺、2-3ml濃度為1.5mol/lph為8.8的tris溶液、0.05-0.15ml10％的sds溶液、5-7μltemed。指紋中的蛋白質(zhì)分子與sds結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-sds復合物，在電壓作用下轉(zhuǎn)移到pvdf膜上。

作為優(yōu)選方案，步驟2)中采用濕轉(zhuǎn)儀將目的蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜上。

進一步地，濕轉(zhuǎn)時，設定電壓110-130v，轉(zhuǎn)移時間為20-40min?？梢允沟鞍踪|(zhì)充分轉(zhuǎn)移到pvdf膜上。

作為優(yōu)選方案，步驟3)中脫脂牛奶的濃度為4-6％(w/v)。該濃度可以有效地結(jié)合pvdf膜上的非特異性吸附位點。

作為優(yōu)選方案，步驟3)、4)、5)中清洗均采用tbst緩沖液清洗；所述tbst緩沖液為含0.05％tween20的tbs緩沖液，tbs緩沖溶液為0.1mtris.hclph7.5、0.15mnacl。

作為優(yōu)選方案，步驟4)中所述一抗溶液為兔抗人，所述一抗溶液的濃度為0.01-0.03mg/ml。

作為優(yōu)選方案，步驟5)中所述二抗溶液為辣根過氧化物酶標記羊抗兔，所述二抗溶液的濃度為0.005-0.015mg/ml。

作為優(yōu)選方案，步驟6)中所述顯影液為ph為8.5的0.1mtris.hcl含0.4-0.6mm魯米諾和0.2-0.3mm對碘苯酚。

本發(fā)明方法實現(xiàn)了對血潛指紋的高靈敏檢測，主要包括：將客體上殘留的血潛指紋樣本轉(zhuǎn)移至sds-page膠上；利用濕轉(zhuǎn)方式將目標蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜；選擇特異性檢測目標蛋白的一抗與辣根過氧化物酶標記的二抗，利用抗體與目標物的特異性反應，將辣根過氧化物酶連接到目標檢測物上；增強化學發(fā)光底物在辣根過氧化物酶催化下產(chǎn)生化學發(fā)光，從而顯現(xiàn)出指紋并可由此確定待測物的存在。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明在添加檢測試劑前預先提取血潛指紋中的蛋白質(zhì)成分，特異性強，避免了無非特異性吸附問題；

2、本發(fā)明使用pvdf膜作為蛋白質(zhì)載體，蛋白質(zhì)的附著力強；

3、本發(fā)明的方法使蛋白質(zhì)信號放大，靈敏度高，且發(fā)光試劑造價低；

4、本發(fā)明操作簡單，采用傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡方法，可靠，穩(wěn)定；

5、本發(fā)明方法不受雜質(zhì)影響，檢測可信度高。

四、附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明基于蛋白質(zhì)印記法提取并顯現(xiàn)血潛指紋的方法檢測血潛指紋示意圖；

圖2為實施例1基于蛋白質(zhì)印記法提取并顯現(xiàn)血潛指紋的方法檢測血潛指紋的發(fā)光圖像。

五、具體實施方式

試劑：

rabbitanti-humanigg(兔抗人)購自北京博奧森生物有限公司，貨號bs-0297r；

goatanti-rabbitigg/hrp(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔)購自北京博奧森生物有限公司，貨號bs-0295g-hrp；

pvdf膜購自碧云天生物技術有限公司，貨號ffp24。

實施例1

基于蛋白質(zhì)印記法提取并顯現(xiàn)血潛指紋的方法，包括：

1)用彈簧采血針在指尖采集一滴血液，涂到手指上，干燥；

2)將指紋按捺在無孔玻璃基底上；玻璃基底分別用無水乙醇，水超聲清洗20min；

3)將基底上的指紋樣本轉(zhuǎn)移到8％的sds-page膠上；

8％的sds-page膠的配制如下：

水：4.6ml；30％的丙烯酰胺：2.7ml；1.5mtris(ph8.8)：2.5ml；10％的sds：0.1ml；temed：6μl。

4)使用濕轉(zhuǎn)儀，設定電壓120v，轉(zhuǎn)移時間30min，將sds-page膠上指紋樣本的目的蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf膜上；

5)轉(zhuǎn)移完成后，將pvdf膜浸入5％(w/v)的脫脂牛奶中封閉1h；

6)用tbst清洗膜上過多的牛奶，清洗3次，每次5min；

7)向步驟6)處理后的pvdf膜上滴加0.02mg/ml一抗(兔抗人)，4℃過夜孵育一抗溶液進行孵育；

8)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min，

9)向步驟8)處理后的pvdf膜上滴加辣根過氧化物酶標記的二抗(羊抗兔)常溫孵育1h，二抗?jié)舛葹?.01mg/ml；

10)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min；

11)配制顯影液(顯影液為ph為8.5的0.1mtrishcl含0.5mm魯米諾和0.23mm對碘苯酚)，將其均勻滴到步驟10)處理后的pvdf膜上，暗箱中顯影，得到清晰指紋圖像。在辣根過氧化物酶的作用下，過氧化氫與魯米諾反應產(chǎn)生波長為425nm的光，從而顯現(xiàn)出指紋。

其中，步驟6)、8)、10)中的tbst為含0.05％tween-20的tbs緩沖液，tbs緩沖溶液為0.1mtrishclph7.5、0.15mnacl。

本發(fā)明基于蛋白質(zhì)印記法提取并顯現(xiàn)血潛指紋的方法檢測血潛指紋示意圖如圖1所示，選擇特異性檢測目標蛋白的一抗與辣根過氧化物酶標記的二抗，利用抗體與目標物的特異性反應，將辣根過氧化物酶連接到目標檢測物上；增強化學發(fā)光底物在辣根過氧化物酶催化下產(chǎn)生化學發(fā)光，從而顯現(xiàn)出指紋并可由此確定待測物的存在。

本實施例基于蛋白質(zhì)印記法提取并顯現(xiàn)血潛指紋的方法檢測血潛指紋的發(fā)光圖像如圖2所示，可見本發(fā)明方法可獲得的指紋圖像，指紋紋線非常清晰。

實施例2

基于蛋白質(zhì)印記法提取并顯現(xiàn)血潛指紋的方法，包括：

1)用彈簧采血針在指尖采集一滴血液，涂到手指上，干燥；

2)將指紋按捺在多孔紙質(zhì)基底上；紙質(zhì)基底為普通的a4紙；

3)將基底上的指紋樣本轉(zhuǎn)移到10％的sds-page膠上；

10％的sds-page膠的配制如下：

水：4.1ml；30％的丙烯酰胺：3.3ml；1.5mtris(ph8.8)：2.5ml；10％的sds：0.1ml；temed：6μl。

4)使用濕轉(zhuǎn)儀，設定電壓110v，轉(zhuǎn)移時間30min，將sds-page膠上指紋樣本的目的蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf膜上；

5)轉(zhuǎn)移完成后，將pvdf膜浸入4％(w/v)的脫脂牛奶中封閉1.5h；

6)用tbst清洗膜上過多的牛奶，清洗3次，每次5min；

7)向步驟6)處理后的pvdf膜上滴加0.03mg/ml一抗(兔抗人)，4℃過夜孵育一抗溶液進行孵育；

8)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min，

9)向步驟8)處理后的pvdf膜上滴加辣根過氧化物酶標記的二抗(羊抗兔)常溫孵育1h，二抗?jié)舛葹?.02mg/ml；

10)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min；

11)配制顯影液(顯影液為ph為8.5的0.1mtrishcl含0.5mm魯米諾和0.23mm對碘苯酚)，將其均勻滴到步驟10)處理后的pvdf膜上，暗箱中顯影，得到清晰指紋圖像。在辣根過氧化物酶的作用下，過氧化氫與魯米諾反應產(chǎn)生波長為425nm的光，從而顯現(xiàn)出指紋。

其中，步驟6)、8)、10)中的tbst為含0.05％tween-20的tbs緩沖液，tbs緩沖溶液為0.1mtrishclph7.5、0.15mnacl。