本發(fā)明屬于顯微光譜成像技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種透射式共焦cars顯微光譜測(cè)試方法及裝置，可用于快速檢測(cè)被測(cè)透明樣品的幾何形貌并獲得微區(qū)cars光譜，實(shí)現(xiàn)高空間分辨的層析圖譜成像。

技術(shù)背景

傳統(tǒng)的共焦拉曼顯微技術(shù)由于拉曼散射本身特性導(dǎo)致其散射光譜信號(hào)極弱，即便用高強(qiáng)度的激光激發(fā)，要得到一副對(duì)比度好的光譜圖像，依然需要很長的作用時(shí)間。這種長時(shí)間作用限制了拉曼顯微技術(shù)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。基于相干拉曼效應(yīng)的相干反斯托克斯拉曼散射(cars)過程能夠很大程度上增強(qiáng)拉曼信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。相干拉曼效應(yīng)是通過受激激發(fā)的光將分子鎖定在振動(dòng)能級(jí)上，這種方法產(chǎn)生的振動(dòng)信號(hào)的強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度成非線性關(guān)系，可以產(chǎn)生很強(qiáng)的信號(hào)，也稱為相干非線性拉曼光譜。它具有很強(qiáng)的能量轉(zhuǎn)換效率，曝光時(shí)間短，對(duì)樣品的損害也比較小，同時(shí)它的散射具有一定的方向性，容易與雜散光分離。

相干反斯托克斯拉曼散射(cars)的產(chǎn)生是一個(gè)三階非線性光學(xué)過程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探測(cè)光。一般而言，為了減少光源的數(shù)量，簡化過程，常用泵浦光代替探測(cè)光，它們之間的關(guān)系如圖2所示，當(dāng)泵浦光(wp)和斯托克斯光(ws)的頻率之差與拉曼活性分子的振動(dòng)頻率相匹配時(shí)，將激發(fā)出cars光was，其中was＝2wp-ws。cars光的產(chǎn)生過程包含特定的拉曼活性分子的振動(dòng)模式和導(dǎo)致分子從基態(tài)至激發(fā)態(tài)振動(dòng)躍遷的入射光場的相互作用過程，它的能級(jí)示意圖如圖3所示。圖3(a)表示拉曼共振和非共振單光子增強(qiáng)對(duì)cars過程的貢獻(xiàn)，圖3(b)表示拉曼共振和非共振雙光子增強(qiáng)對(duì)cars過程的貢獻(xiàn)；當(dāng)ep和es之間的頻差與拉曼活性分子的振動(dòng)頻率相匹配時(shí)，激發(fā)出的信號(hào)得到共振增強(qiáng)。

現(xiàn)有的cars顯微技術(shù)大多采用兩個(gè)單波長激光器進(jìn)行光譜激發(fā)，因此只能獲得特定頻譜的光譜信息，而且并沒有強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)的定焦能力，導(dǎo)致實(shí)際光譜探測(cè)位置往往處于離焦位置。即便離焦位置也能激發(fā)出樣品的拉曼光譜并被針孔后的光譜儀探測(cè)，但是強(qiáng)度并不能合理表征該點(diǎn)正確的光譜信號(hào)強(qiáng)度。這樣導(dǎo)致cars顯微系統(tǒng)探測(cè)微區(qū)光譜的能力受到很大限制，并制約了其在更精細(xì)微區(qū)光譜測(cè)試與分析場合中的應(yīng)用。

此外，大多數(shù)光譜檢測(cè)技術(shù)及裝置是基于反射式結(jié)構(gòu)，在檢測(cè)透明材料時(shí)效果不佳?；谏鲜銮闆r，本發(fā)明針對(duì)測(cè)量透明樣品提出將系統(tǒng)收集到的樣品中散射的強(qiáng)于樣品拉曼散射光10³～10⁶倍的瑞利光進(jìn)行高精度探測(cè)，使其與光譜探測(cè)系統(tǒng)有機(jī)融合，進(jìn)行空間位置信息和光譜信息的同步探測(cè)，以實(shí)現(xiàn)高空間分辨的、高光譜分辨的共焦cars圖譜成像和探測(cè)。

本發(fā)明專利的核心思想是基于檢測(cè)透明樣品的需求，提出透射式共焦cars顯微光譜測(cè)量方法與裝置。其中，選用單波長脈沖激光器和超連續(xù)譜脈沖激光器作為激發(fā)光源，擴(kuò)大激發(fā)光譜范圍，提高光譜激發(fā)強(qiáng)度；將共焦顯微結(jié)構(gòu)與cars光譜結(jié)構(gòu)結(jié)合，利用共焦響應(yīng)曲線的“最大值點(diǎn)”與顯微物鏡焦點(diǎn)位置精確對(duì)應(yīng)這一特性，精確定焦，實(shí)現(xiàn)高空間分辨；精確定焦后，進(jìn)行光譜探測(cè)，獲得最佳光譜分辨能力；將光譜信息和幾何信息融合，實(shí)現(xiàn)層析圖譜探測(cè)與測(cè)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種透射式共焦cars顯微光譜測(cè)試方法及裝置，用于檢測(cè)透明樣品。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。一種激光共焦cars光譜測(cè)試方法，包括以下步驟：

a)在激光發(fā)射單元(1)中，由超連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出超連續(xù)譜激光，經(jīng)過一個(gè)帶通濾光片(4)得到要求譜段的斯托克斯光后，通過一個(gè)二向色鏡(5)與單波長激光器(2)發(fā)出的單波長激光混合，形成混合光束(頻率一致，時(shí)間一致，空間重合)進(jìn)入光譜激發(fā)單元(6)；

b)在光譜激發(fā)單元(6)中，混合光束經(jīng)第一反射鏡(7)反射通過顯微物鏡(8)，聚焦在固定在三維掃描平臺(tái)(9)上的被測(cè)樣品(10)上，激發(fā)出瑞利光和載有被測(cè)樣品(10)光譜特性的反斯托克斯(cars)光，通過樣品后形成的混合光束包含瑞利光、斯托克斯光、cars光；

c)混合光束被顯微物鏡(11)收集，經(jīng)過二向色鏡(12)后分成兩束，其中包含cars光的光束進(jìn)入光譜探測(cè)單元(13)，另一束包含瑞利光的光束進(jìn)入共焦探測(cè)系統(tǒng)(19)；在光譜探測(cè)單元(13)中，包含cars光的光束先經(jīng)過帶通濾光片(14)，濾除光束中的非cars干擾光，然后通過第一聚光鏡(15)會(huì)聚進(jìn)入光譜儀(18)，獲得cars光譜信息；另一束載有瑞利光的光束通過第三聚光鏡(20)后通過位于焦點(diǎn)位置的第二針孔(21)濾除雜散光后被光電探測(cè)器(22)探測(cè)，獲得共焦信號(hào)。三維平移臺(tái)(9)z向移動(dòng)，共焦信號(hào)強(qiáng)度隨之改變，得到共焦響應(yīng)曲線(24)，利用共焦響應(yīng)曲線“最大值”點(diǎn)與顯微物鏡(8)焦點(diǎn)位置精確對(duì)應(yīng)這一特性，得到被測(cè)樣品z向幾何位置，結(jié)合三維平移臺(tái)(9)橫向位置，得到被測(cè)樣品幾何形貌i(x,y,z)。

d)通過三維平移臺(tái)(9)使顯微物鏡精確定焦后，通過光譜探測(cè)單元(13)獲得當(dāng)前測(cè)量點(diǎn)的光譜信息i(λ)；將幾何位置和光譜信息結(jié)合，系統(tǒng)能獲得高空間分辨的微區(qū)圖譜層析圖像，即實(shí)現(xiàn)了透射式共焦cars顯微光譜探測(cè)。

特別的，在本發(fā)明方法中，激光發(fā)射單元中，單波長脈沖激光器(2)與超連續(xù)譜脈沖激光器(3)為重復(fù)頻率一致的脈沖激光器。

特別的，通過匹配不同譜帶的濾光片，選擇不同譜段的斯托克斯光，來實(shí)現(xiàn)不同譜段的光譜探測(cè)。

特別的，在本發(fā)明方法中，激光發(fā)射單元(1)的實(shí)現(xiàn)方式還包括采用一個(gè)單波長脈沖激光器添加光子晶體光纖(26)進(jìn)行超連續(xù)譜擴(kuò)展后與單波長激光進(jìn)行混合輸出。

特別的，在本發(fā)明方法中，激發(fā)cars光的方式還包括反向激發(fā)的方式。

一種透射式共焦cars顯微光譜測(cè)試裝置，包括以下五個(gè)部分：激光發(fā)射單元(1)、光譜激發(fā)單元(6)、光譜探測(cè)單元(13)、共焦探測(cè)單元(19)、計(jì)算機(jī)(33)。激光發(fā)射單元(1)由單波長脈沖激光器(2)、超連續(xù)譜脈沖激光器(3)、帶通濾光片(4)和二向色鏡(5)組成；光譜激發(fā)單元由第一反射鏡(7)、第一顯微物鏡(8)、三維平移臺(tái)(9)、被測(cè)樣品(10)、第二顯微物鏡(11)、二向色鏡(12)組成；光譜探測(cè)單元(13)由帶通濾光片(14)、第一聚光鏡(15)、第一針孔(16)、第二聚光鏡(17)、光譜儀(18)組成；共焦探測(cè)單元(19)由第三聚光鏡(20)、第一針孔(21)、第一光電探測(cè)器(22)組成。

在本發(fā)明裝置中，光譜探測(cè)單元(13)位于二向色鏡(12)透射方向，共焦探測(cè)單元(19)位于二向色鏡(12)反射方向，計(jì)算機(jī)(33)與三維平移臺(tái)(9)、光譜探測(cè)單元(13)、共焦探測(cè)單元(19)連接，用于融合并處理光譜數(shù)據(jù)和位置信息。

在本發(fā)明裝置中，光譜探測(cè)單元(13)還可以是由帶通濾光片(14)、第一聚光鏡(15)、光譜儀(18)構(gòu)成的普通光譜探測(cè)單元。

在本發(fā)明裝置中，cars光激發(fā)模式包括：當(dāng)單波長激光器(2)發(fā)出的光作為泵浦光和探測(cè)光時(shí)，連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出的連續(xù)譜激光作為斯托克斯光；當(dāng)單波長激光器(2)發(fā)出的光作為斯托克斯光和探測(cè)光時(shí)，連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出的連續(xù)譜激光作為泵浦光。

在本發(fā)明裝置中，在激光發(fā)射單元(1)和光譜激發(fā)單元(6)之間添加偏振調(diào)制器形成偏振光束以提高光譜激發(fā)信號(hào)信噪比，或添加光瞳濾波器(32)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光束以提高幾何分辨力；

有益效果

本發(fā)明方法，對(duì)比已有技術(shù)具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明融合透射式共焦顯微技術(shù)和cars光譜探測(cè)技術(shù)，通過共焦顯微技術(shù)實(shí)現(xiàn)高精度幾何測(cè)量和定焦，定焦后對(duì)樣品進(jìn)行cars光譜激發(fā)和測(cè)量，大幅提高現(xiàn)有cars光譜顯微鏡的微區(qū)光譜探測(cè)能力；

2、本發(fā)明采用雙對(duì)稱顯微物鏡，可通過計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)同步切換，提高了儀器的操作性能；

3、本發(fā)明采用的兩個(gè)激光器為啟動(dòng)時(shí)間一致、重復(fù)頻率一致的窄脈沖飛秒激光器，光路穩(wěn)定，激發(fā)效率高。

4、本發(fā)明即可實(shí)現(xiàn)微區(qū)三維形貌測(cè)量與成像，也可實(shí)現(xiàn)微區(qū)光譜測(cè)量與成像，還可以將兩者結(jié)合實(shí)現(xiàn)高空間分辨的圖譜層析成像；

5、本發(fā)明采用的是透射結(jié)構(gòu)，彌補(bǔ)了反射式光譜測(cè)量方法在測(cè)量透明樣品信號(hào)強(qiáng)度弱、不易采集等不足；

附圖說明

圖1為摘要附圖，即本發(fā)明基本實(shí)施圖；

圖2為相干反斯托克斯(cars)光激發(fā)原理圖；

圖3為cars光與泵浦光、斯托克斯光的能級(jí)關(guān)系圖；

圖4為透射式共焦cars顯微光譜測(cè)量方法示意圖；

圖5為改進(jìn)光譜探測(cè)的透射式共焦cars顯微光譜測(cè)量方法示意圖；

圖6為多層樣品測(cè)量示意圖

圖7為單激光器實(shí)現(xiàn)的透射式共焦cars顯微光譜測(cè)量方法示意圖；

圖8為時(shí)域掃描的透射式共焦cars顯微光譜測(cè)量方法示意圖；

圖9為反向激發(fā)的透射式共焦cars顯微光譜測(cè)試方法示意圖；

圖10為加光瞳濾波器的透射式共焦cars顯微光譜測(cè)試方法示意圖；

圖11為透射式共焦cars顯微光譜測(cè)試裝置示意圖,即實(shí)施例用圖；

其中，1-激光發(fā)射單元、2-單波長激光光源、3-超連續(xù)譜激光光源、4-帶通濾光片、5-二向色鏡、6-光譜激發(fā)單元、7-第一反射鏡、8-第一顯微物鏡、9-三維平移臺(tái)、10-被測(cè)樣品、11-第二顯微物鏡、12-二向色鏡、13-光譜探測(cè)單元、14-帶通濾光片、15-第一聚光鏡、16-第一針孔、17-第二聚光鏡、18-光譜儀、19-共焦探測(cè)單元、20-第三聚光鏡、21-第二針孔、22-光電探測(cè)器、23-聚焦光斑、24-多層共焦曲線、25-偏振分光棱鏡、26-光子晶體光纖、27-第二反射鏡、28-光學(xué)延時(shí)器、29-第三反射鏡、30-偏振片、31-光電點(diǎn)探測(cè)器、32-光瞳濾波器、33-計(jì)算機(jī)；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

如圖4所示，激光發(fā)射單元(1)產(chǎn)生空間重合、時(shí)間一致的混合光束(斯托克斯光和泵浦光)，進(jìn)入光譜激發(fā)單元(6)；在光譜激發(fā)單元(6)中，光束經(jīng)第一反射鏡(7)反射至顯微物鏡(8)，由高倍顯微物鏡(8)緊聚焦在被測(cè)樣品(10)上，激發(fā)出瑞利光和載有被測(cè)樣品光譜特性的cars光；cars光、瑞利光和殘余的斯托克斯光被第二顯微物鏡(11)收集，經(jīng)二向色鏡(12)分光，其中cars光和斯托克斯光進(jìn)入光譜探測(cè)單元(13)進(jìn)行光譜探測(cè)，瑞利光進(jìn)入共焦探測(cè)單元(19)進(jìn)行幾何位置測(cè)量；

在光譜探測(cè)單元(13)中添加第一針孔(16)過濾雜散光提高光譜探測(cè)的信噪比，即構(gòu)成圖5；

圖6為本方法探測(cè)透明多層樣品示意圖，三維平移臺(tái)(9)沿z向移動(dòng)，使顯微物鏡(8)聚焦在被測(cè)多層樣品(10)上的光斑(23)大小改變，相應(yīng)的光譜探測(cè)單元和共焦探測(cè)單元收集到的cars光譜信號(hào)和瑞利信號(hào)強(qiáng)度改變，z向位置和共焦信號(hào)強(qiáng)度變化構(gòu)成共焦曲線(24)，當(dāng)顯微物鏡(8)聚焦在不同層時(shí)，得到多層共焦曲線(24)，得到多層共焦曲線(24)的多個(gè)峰值點(diǎn)位置，實(shí)現(xiàn)對(duì)被測(cè)樣品(10)的分層聚焦探測(cè)；

將圖4中由雙激光器組成的激光發(fā)射單元換成單激光器與光子晶體光纖組合結(jié)構(gòu)，即構(gòu)成圖7；在圖7中，單波長脈沖激光器(2)發(fā)出單波長脈沖激光，經(jīng)過偏振分光棱鏡(25)分光，一半光經(jīng)過光子晶體光纖(26)進(jìn)行超連續(xù)譜擴(kuò)展獲得超連續(xù)譜激光，通過帶通濾光片(4)選擇需要特定波長的激光后，與另一半單波長激光在二向色鏡(5)處重合，通過調(diào)整光學(xué)延時(shí)器(28)保證兩束激光時(shí)序重合，從而滿足cars光激發(fā)的空間重合、時(shí)間一致的要求。

在圖7中的偏振分光棱鏡(25)和光子晶體光纖(26)之間添加偏振片(30)，并將光譜探測(cè)單元(13)中的光譜儀換成響應(yīng)迅速、探測(cè)靈敏的光電點(diǎn)探測(cè)器(31)，即構(gòu)成圖8；這樣通過旋轉(zhuǎn)偏振片(30)，改變?nèi)肷涔庾泳w光纖(26)的激光偏振態(tài)，使輸出的連續(xù)譜激光的波長變換，實(shí)現(xiàn)光譜的時(shí)域掃描輸出，結(jié)合光電點(diǎn)探測(cè)器(31)可實(shí)現(xiàn)cars光譜的時(shí)域掃描探測(cè)，這是本發(fā)明方法激發(fā)探測(cè)cars光譜的方法之一。

在本發(fā)明方法中，除了采用上述同向激發(fā)、反向探測(cè)的方法激發(fā)cars光，還可以采用反向激發(fā)、反向探測(cè)的方法。如圖9所示，單波長激光器(2)發(fā)出的單波長激光通過二向色鏡(5)反射通過第二顯微物鏡(11)會(huì)聚在樣品上，而超連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出的連續(xù)譜激光通過反射鏡(7)反射通過第一顯微物鏡(8)會(huì)聚在樣品(10)上；兩束光會(huì)聚在樣品上的位置一樣，保證兩束脈沖激光到達(dá)樣品位置時(shí)序一致，激發(fā)出瑞利光和載有被測(cè)樣品光譜特性的cars光，分別進(jìn)入光譜探測(cè)單元(13)和共焦探測(cè)單元(19)進(jìn)行幾何位置探測(cè)。

基于本發(fā)明基本實(shí)施方法，在激光發(fā)射單元(1)和光譜激發(fā)單元(6)間添加光瞳濾波器(32)，即構(gòu)成圖10；此時(shí)，通過引入結(jié)構(gòu)光束，使系統(tǒng)的空間分辨力能得到提高；

實(shí)施例

在本實(shí)施例中，采用波長為800nm的飛秒激光器作為泵浦光源和探測(cè)光源，采用重復(fù)頻率與之一致的超連續(xù)譜(400～2000nm)皮秒激光器作為斯托克斯光源。

如圖11所示,透射式共焦cars顯微光譜測(cè)試裝置，其測(cè)試步驟如下：

在激光發(fā)射單元(1)中，單波長脈沖激光器(2)與超連續(xù)譜脈沖激光器(3)同時(shí)發(fā)出脈沖激光，超連續(xù)譜激光通過帶通濾光片(4)選擇出合適的斯托克斯光(810～950nm)與單波長激光(900nm)在二向色鏡(5)處匯合，保證兩束激光匯合后，空間重合(單波長激光包絡(luò)于連續(xù)譜激光)、時(shí)間一致(兩束激光到達(dá)分光片的光程一致)；

混合后的光束通過高倍顯微物鏡(8)緊聚焦在被測(cè)樣品(10)上，此時(shí)滿足相位匹配條件，激發(fā)出瑞利光和波長范圍在690～790nm的載有被測(cè)樣品光譜特性的反斯托克斯光(cars)。其中cars光進(jìn)入光譜探測(cè)單元(13)探測(cè)，瑞利光進(jìn)入共焦探測(cè)單元(19)進(jìn)行幾何位置探測(cè)。

在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量模式下，計(jì)算機(jī)控制三維平移臺(tái)(9)在x-y方向移動(dòng)實(shí)現(xiàn)橫向掃描，測(cè)量單點(diǎn)時(shí)，計(jì)算機(jī)控制三維平移臺(tái)z向移動(dòng)，此時(shí)被測(cè)樣品(10)上的光斑(23)大小改變，相應(yīng)的共焦探測(cè)單元(19)獲得的共焦信號(hào)強(qiáng)度i(z)改變，根據(jù)共焦強(qiáng)度響應(yīng)曲線(24)最大值點(diǎn)對(duì)應(yīng)顯微物鏡(8)焦點(diǎn)位置，獲得被測(cè)點(diǎn)的幾何位置信息i(x,y,z)；此時(shí)，通過三維平移臺(tái)(9)使被測(cè)樣品(10)移動(dòng)到物鏡焦點(diǎn)位置，通過光譜探測(cè)單元(13)測(cè)量此時(shí)的光譜信號(hào)i(λ)，結(jié)合三維平移臺(tái)位置獲得光譜信息i(x,y,λ)，通過計(jì)算機(jī)(33)將幾何位置信息i(x,y,z)和光譜信息i(x,y,λ)融合，獲得高空間分辨的光譜圖像信息i(x,y,z,λ)。三者之間的聯(lián)系如下：

微區(qū)圖譜層析成像

通過對(duì)幾何位置信息i(x,y,z)和光譜信息i(x,y,λ)融合處理，能夠?qū)崿F(xiàn)微區(qū)圖譜成像i(x,y,z,λ)。

如圖11所示，透射式共焦cars顯微光譜測(cè)試裝置包括激光發(fā)射單元1、光譜激發(fā)單元(6)、光譜探測(cè)單元(13)、共焦探測(cè)單元(19)、計(jì)算機(jī)(33)；其中激光發(fā)射單元(1)包括單波長激光光源(2)、超連續(xù)譜激光光源(3)、帶通濾光片(4)、二向色鏡(5)；光譜激發(fā)單元(6)包括第一反射鏡(7)、第一顯微物鏡(8)、三維平移臺(tái)(9)、被測(cè)樣品(10)、第二顯微物鏡(11)、二向色鏡(12)；光譜探測(cè)單元(13)包括帶通濾光片(14)、第一聚光鏡(15)、第一針孔(16)、第二聚光鏡(17)、光譜儀(18)；共焦探測(cè)單元(19)包括第三聚光鏡(20)、第二針孔(21)、光電探測(cè)器(22)；

其中，光譜激發(fā)單元(1)位于光譜激發(fā)單元(6)中反射鏡(7)的入射方向，光譜探測(cè)單元位于光譜激發(fā)單元(6)中二向色鏡(12)的透射方向，共焦探測(cè)單元(19)位于二向色鏡(12)的反射方向；

在整個(gè)系統(tǒng)中，單波長激光光源(2)、超連續(xù)譜激光光源(3)、三維平移臺(tái)(9)、光譜儀(18)、光電探測(cè)器(22)均受計(jì)算機(jī)(33)控制，系統(tǒng)得到的三維位置信息和光譜信息也由計(jì)算機(jī)(33)進(jìn)行融合處理。

以上結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作了說明，但這些說明不能被理解為限制了本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍由隨附的權(quán)利要求書限定，任何在本發(fā)明權(quán)利要求基礎(chǔ)上進(jìn)行的改動(dòng)都是本發(fā)明的保護(hù)范圍。