本發(fā)明屬于輸血檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種血小板抗體檢測(cè)試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
隨著腫瘤、血液系統(tǒng)疾病患者的顯著增加及臨床輸血醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，血小板輸用量逐年攀升。血小板輸血作為提升血小板計(jì)數(shù)，防止出血，保障患者生命安全的有效措施，其安全、科學(xué)、有效的輸注已成為臨床輸血技術(shù)發(fā)展的必然要求。然而，目前我國(guó)大多數(shù)血小板輸血仍然采用隨機(jī)輸注(即“盲輸”)，不相合的血小板輸入患者體內(nèi)后迅速被機(jī)體免疫系統(tǒng)破壞清除，導(dǎo)致血小板輸注無(wú)效癥頻繁發(fā)生，不僅浪費(fèi)了寶貴的血小板資源，而且延誤了患者的最佳治療時(shí)機(jī)，還增加了患者痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前血小板抗體主要有血小板同種異體抗體，包括hla抗體，hpa抗體及其它血小板反應(yīng)性抗體。血小板自身抗體，包括患者自身血小板結(jié)合抗體和自身游離抗體。血小板抗體主要在腫瘤患者、白血病、再生障礙性貧血、溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少癥、新生兒血小板減少癥、骨髓異常綜合癥﹑妊娠史等血小板輸注無(wú)效疾病患者中存在，同時(shí)會(huì)存在各種血小板抗體產(chǎn)生的臨床綜合癥。
為改善這一現(xiàn)狀，提高患者血小板輸血效果，國(guó)內(nèi)部分臨床醫(yī)院新增開(kāi)展了血小板抗體檢測(cè)項(xiàng)目。目前已存在的血小板血型檢測(cè)技術(shù)有：血小板免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸咐試驗(yàn)；混合被動(dòng)血凝技術(shù)、混合細(xì)胞粘附試驗(yàn)(固相技術(shù))、特異的單克隆抗體對(duì)血小板抗原固定試驗(yàn)等，但這些試驗(yàn)的操作程序都比較復(fù)雜，需要時(shí)間長(zhǎng)，有的所需設(shè)備儀器昂貴，所以血小板血型配型到目前還沒(méi)有成為臨床血小板輸血的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，部分項(xiàng)目在臨床開(kāi)展過(guò)程中因準(zhǔn)確性和靈敏度達(dá)不到安全輸血要求，操作過(guò)于繁瑣，逐漸被臨床淘汰。目前臨床常用的固相紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)技術(shù)(solid-phaseredcelladherence,sprca)和單克隆特異的血小板抗原固定試驗(yàn)(monoclonalantibody-specificimmobilizationofplateletantigensassay,maipa)，sprca技術(shù)原理為在反應(yīng)板中包被抗血小板單克隆抗體，血小板懸液經(jīng)離心洗滌后可在反應(yīng)孔底部形成血小板單層。加入血清或血漿，在孔中經(jīng)過(guò)孵育后，若該血清或血漿中含有血小板抗體，則該抗體與反應(yīng)孔中的血小板單層結(jié)合，未結(jié)合的成分通過(guò)洗滌被去除。加入抗人igg及人igg致敏紅細(xì)胞(指示紅細(xì)胞)，經(jīng)離心后指示紅細(xì)胞通過(guò)抗人igg的橋連與血小板單層上的血小板抗體結(jié)合，因此陽(yáng)性反應(yīng)為指示紅細(xì)胞平鋪在反應(yīng)孔底部表面。而陰性反應(yīng)為指示紅細(xì)胞在離心力的作用下聚集于反應(yīng)孔底部中央；maipa技術(shù)原理為血小板先結(jié)合人的同種抗體，然后與不同的抗血小板膜糖蛋白的(抗gpib、gpiib、gpiiia、gpix、hla等)鼠抗人血小板單克隆抗體孵育。經(jīng)洗滌后裂解血小板，將產(chǎn)物移至包被的羊抗鼠igg微孔板內(nèi)，通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗人igg，經(jīng)酶底物顯色可以檢測(cè)血小板膜糖蛋白特異的同種抗體。
以上方法進(jìn)行血小板抗體定性檢測(cè)時(shí)，其靈敏度和特異性僅有30％-40％，結(jié)果判讀存在人為誤差，約幾個(gè)小時(shí)才能完成檢測(cè)，不能滿足了臨床醫(yī)生的快速需求，同時(shí)該技術(shù)也沒(méi)有相應(yīng)的質(zhì)控技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)只有少部分臨床開(kāi)展了該方法的血小板抗體檢測(cè)，部分也只是試用階段。為了克服臨床上其他血小板抗體檢測(cè)方法靈敏度低，特異性差，臨床操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，結(jié)果判讀困難、缺乏相應(yīng)的試劑質(zhì)控等實(shí)際問(wèn)題；現(xiàn)有微柱凝膠法進(jìn)行的血小板抗體檢測(cè)指示紅細(xì)胞一般會(huì)采用化學(xué)試劑(如戊二醛)將紅細(xì)胞醛化處理，然后包被抗人igg來(lái)指示反應(yīng)結(jié)果，該方法不僅技術(shù)要求高，操作時(shí)間長(zhǎng)(需靜置過(guò)夜)，且醛化紅細(xì)胞破壞抗原結(jié)構(gòu)，容易造成漏檢，因此限制了使用，難以達(dá)到臨床快速安全配血要求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種血小板抗體檢測(cè)試劑盒及其使用方法。
為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
本發(fā)明提供一種血小板抗體檢測(cè)試劑盒，所述血小板抗體檢測(cè)試劑盒包括檢測(cè)板(1)、凝膠管(2)和封口膜(3)，所述凝膠管(2)有六個(gè)，呈左右排列設(shè)置在檢測(cè)板(1)的頂端，所述封口膜(3)設(shè)置在檢測(cè)板(1)的上方，且覆蓋在六個(gè)凝膠管(2)的頂端，所述六個(gè)凝膠管(2)中包含抗人球蛋白試劑和葡聚糖凝膠，其中第一和第六凝膠管分別為陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管，第二到第四凝膠管作為反應(yīng)管。
優(yōu)選地，所述每個(gè)凝膠管(2)從上到下均包括管口(2.1)、緩沖腔(2.2)和反應(yīng)腔(2.3)，所述管口(2.1)的開(kāi)口朝上。
優(yōu)選地，所述每個(gè)凝膠管(2)的外壁還設(shè)有兩塊支撐板(2.4)，所述兩塊支撐板(2.4)分別設(shè)置于每個(gè)凝膠管(2)的前后方。
優(yōu)選地，所述檢測(cè)板(1)為聚丙烯塑料透明板。
優(yōu)選地，所述六個(gè)凝膠管中葡聚糖凝膠的體積為凝膠管體積的2/3。
優(yōu)選地，所述葡聚糖凝膠為g-25、g-50、g-100、s-100或s-200。
優(yōu)選地，所述六個(gè)凝膠管中還含有咪唑緩沖液、牛血清白蛋白、氯化鈉、疊氮鈉和吐溫-20中的任意一種或至少兩種的組合。
優(yōu)選地，所述咪唑緩沖液中咪唑的摩爾濃度為0.1-1m，例如0.1m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m或1m。
優(yōu)選地，所述牛血清白蛋白在每個(gè)凝膠管中的質(zhì)量體積終濃度為1-10％，例如1％、1.3％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。
優(yōu)選地，所述氯化鈉在每個(gè)凝膠管中的質(zhì)量體積終濃度為0.5-1％，例如0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。
優(yōu)選地，所述疊氮鈉在每個(gè)凝膠管中的質(zhì)量體積終濃度為0.1-1％，例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。
優(yōu)選地，所述吐溫-20在每個(gè)凝膠管中的體積濃度為0.1-2％，例如0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％或2％。
在本發(fā)明中，所述在每個(gè)凝膠管中各組分的質(zhì)量體積終濃度是指每個(gè)組分的質(zhì)量與每個(gè)凝膠管中總物質(zhì)的體積之比，吐溫-20在每個(gè)凝膠管中的體積濃度是指吐溫-20的體積與每個(gè)凝膠管中總物質(zhì)的體積之比。
另一方面，本發(fā)明提供一種利用如上所述的血小板抗體檢測(cè)試劑盒的使用方法，所述方法為：
在所述小板抗體檢測(cè)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照管中加入含有抗人血小板抗體的陽(yáng)性質(zhì)控、血小板指示紅細(xì)胞、血小板抗原進(jìn)行陽(yáng)性反應(yīng)；在陰性對(duì)照管中加入不含有抗人血小板抗體的陰性質(zhì)控、血小板指示紅細(xì)胞、血小板抗原進(jìn)行陰性反應(yīng)；在反應(yīng)管中加入血小板指示紅細(xì)胞、血小板抗原和待檢血清樣本進(jìn)行反應(yīng)。
優(yōu)選地，所述血小板指示紅細(xì)胞由以下方法制備得到：采集新鮮o型rh(d)陽(yáng)性edta抗凝的壓積紅細(xì)胞，將抗血小板糖蛋白ib/ix單克隆抗體與紅細(xì)胞混勻，0-4℃(例如0℃、0.5℃、1℃、1.5℃、2℃、2.5℃、3℃、3.5℃或4℃)過(guò)夜，生成igg致敏紅細(xì)胞，洗滌去除未結(jié)合的igg，用紅細(xì)胞保存液配制成0.8％的指示紅細(xì)胞懸液。
優(yōu)選地，所述抗血小板糖蛋白ib/ix單克隆抗體與紅細(xì)胞的體積比為(1-3):1，例如但不限于1:1、1.5:1、2:1、2.5:1或3:1。
優(yōu)選地，所述0.8％指示紅細(xì)胞懸液的鑒定方法為:1)直接抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)陽(yáng)性；2)紅細(xì)胞igg結(jié)合量檢測(cè):將抗igg試劑倍比稀釋?zhuān)尤?滴0.8％指示紅細(xì)胞，離心后顯微鏡下觀察至不凝集管的前1管作為滴度，以此滴度作為igg結(jié)合量滴度；保存期檢測(cè):直接抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果肉眼觀察凝集強(qiáng)度﹥3+，igg結(jié)合量滴度﹥32。
優(yōu)選地，所述血小板指示紅細(xì)胞用低離子強(qiáng)度鹽溶液進(jìn)行稀釋。
優(yōu)選地，所述低離子強(qiáng)度鹽溶液為包括質(zhì)量體積終濃度如下的組分的的混合溶液：0.1％-0.9％(例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％或0.9％)氯化鈉、1％-10％(例如1％、1.3％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％)甘氨酸、0.23-0.25g/l(例如0.23g/l、0.24g/l或0.25g/l)磷酸二氫鉀、0.4-0.5g/l(例如0.4g/l、0.42g/l、0.45g/l、0.48g/l或0.5g/l)磷酸氫二鈉、0.1％-1％(例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)疊氮鈉。
在本發(fā)明中，所述血小板指示紅細(xì)胞用低離子強(qiáng)度鹽溶液稀釋的倍數(shù)根據(jù)測(cè)定時(shí)的要求，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需求確定。
在本發(fā)明中，所述血小板抗原由以下制備方法制備得到：提取o型健康志愿者血小板，然后用西林瓶進(jìn)行分裝，血小板濃度在(50-150)×109/l(例如50×109/l、55×109/l、60×109/l、65×109/l、70×109/l、75×109/l、85×109/l、95×109/l、100×109/l、125×109/l、150×109/l)，o型志愿者血小板分裝體積0.5ml/瓶，而后將血小板抗原低溫冷凍干燥，真空條件下進(jìn)行密封包裝，備用。
優(yōu)選地，所述冷凍干燥時(shí)凍干機(jī)的真空度為1-15pa(例如1pa、3pa、5pa、7pa、9pa、10pa、12pa或15pa)，凍干溫度為-40℃至35℃(例如-40℃、-30℃、-10℃、-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或35℃)。
優(yōu)選地，所述冷凍干燥工藝曲線包括但不限于以下的一種或幾種：曲線1：-40℃、2h—-20℃、2h—-10℃、2h—0℃、2h—10℃、2h—20℃、2h—30℃、2h—35℃、4h以上—真空壓蓋密封。曲線2：-40℃、2h—-30℃、2h—-20℃、2h—-10℃、2h—0℃、2h—10℃、2h—20℃、2h—30℃、4h以上—真空壓蓋密封。曲線3：-40℃、2h—-35℃、2h—-30℃、2h—-25℃、2h—-20℃、2h—-15℃、2h—-10℃、2h—-5℃、2h—0℃、2h—5℃、2h—10℃、2h—15℃、2h—20℃、2h—25℃、2h—30℃-35℃、4h以上—真空壓蓋密封。
優(yōu)選地，所述含有抗人血小板抗體的陽(yáng)性質(zhì)控含有抗人血小板抗體及質(zhì)量體積濃度0.1％的疊氮鈉。
優(yōu)選地，所述不含有抗人血小板抗體的陰性質(zhì)控含有質(zhì)量體積濃度0.1％的疊氮鈉。
在本發(fā)明中，所述溶液的質(zhì)量體積終濃度(例如質(zhì)量體積濃度0.1％的疊氮鈉)是指溶質(zhì)質(zhì)量/溶液體積。
在本發(fā)明中，將低離子強(qiáng)度鹽溶液，血小板抗原、待檢患者樣本、血小板指示紅細(xì)胞一次加入血小板抗體檢測(cè)卡中，如果待測(cè)樣本中存在血小板抗體，則結(jié)合了血小板抗原的血小板指示紅細(xì)胞將會(huì)與血小板抗體結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物(血小板抗體-血小板抗原-指示紅細(xì)胞復(fù)合物)。如待測(cè)血清中無(wú)血小板抗體，離心后指示紅細(xì)胞沉于微柱管凝膠尖底部，呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。
在本發(fā)明中，在于對(duì)血小板抗體檢測(cè)試劑進(jìn)行質(zhì)控測(cè)試，將低離子強(qiáng)度鹽溶液，血小板抗原、陽(yáng)性質(zhì)控/陰性質(zhì)控、血小板指示紅細(xì)胞一次加入血小板抗體檢測(cè)卡中，結(jié)合了血小板抗原的血小板指示紅細(xì)胞將會(huì)與陽(yáng)性質(zhì)控結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物(陽(yáng)性質(zhì)控-血小板抗原-指示紅細(xì)胞復(fù)合物)。如檢測(cè)質(zhì)控為陰性質(zhì)控，離心后指示紅細(xì)胞沉于微柱管凝膠尖底部，呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。
在本發(fā)明中，制備血小板抗體檢測(cè)卡(微柱凝膠法)，血小板抗體檢測(cè)卡中含有特定效價(jià)的抗人球蛋白試劑、并包含有適量的牛血清白蛋白、疊氮鈉、吐溫-20。血小板抗體檢測(cè)卡陽(yáng)性孔臨床用于加入含有抗人血小板抗體質(zhì)控、血小板指示紅細(xì)胞、血小板抗原進(jìn)行陽(yáng)性反應(yīng)；血小板抗體檢測(cè)卡陰性孔臨床用于加入不含有抗人血小板抗體的陰性質(zhì)控、血小板指示紅細(xì)胞、血小板抗原進(jìn)行陰性反應(yīng)；血小板抗體檢測(cè)卡的反應(yīng)管中主要加入血小板指示紅細(xì)胞、血小板抗原、待檢血清樣本。
在檢測(cè)時(shí)指示紅細(xì)胞需分別加入到血小板檢測(cè)卡中的各檢測(cè)孔中，用于陰陽(yáng)結(jié)果指示，低離子強(qiáng)度鹽溶液用于稀釋指示紅細(xì)胞。
在本發(fā)明中，利用血小板抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行待檢血清或血漿血小板抗體檢測(cè)以及交叉配型檢測(cè)。
在本發(fā)明中，所述血小板抗體檢測(cè)包括以下步驟：
1、將凍干的血小板抗原用生理鹽水0.5ml/瓶復(fù)溶，18-25℃靜置5min，使其充分溶解，溶解后的血小板濃度約為(50-150)×109/l。
2、將鼠單克隆抗體包被的紅細(xì)胞用低離子鹽溶液稀釋成0.8％-1％的紅細(xì)胞懸液。
3、將血小板抗原和致敏紅細(xì)胞各50μl加入血小板抗體檢測(cè)卡的樣品檢測(cè)管中，然后在檢測(cè)管中加入待檢患者血清50μl；
4、37℃孵育15min，將血小板檢測(cè)卡放入血型卡專(zhuān)用離心機(jī)中，900rpm離心2min，2500rpm離心3min，紅細(xì)胞位于凝膠的表面，為4+強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；紅細(xì)胞懸浮在凝膠中則為1+～3+陽(yáng)性反應(yīng)，越靠近凝膠底部效價(jià)愈??；紅細(xì)胞全部沉積在凝膠的底部則為陰性。
在本發(fā)明中，所述血小板交叉配型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟；
(1)制備與受血者abo同型的供者血小板懸液：將有效期內(nèi)機(jī)采血小板用生理鹽水進(jìn)行5-10倍稀釋?zhuān)换虿捎卯?dāng)天8小時(shí)內(nèi)edta或枸櫞酸鈉抗凝的全血經(jīng)200×g離心10min，取上層2/3富血小板血漿。血小板懸液的適宜濃度為50-150×109/l。
(2)將鼠單克隆抗體包被的紅細(xì)胞用低離子鹽溶液稀釋成0.8％-1％的紅細(xì)胞懸液。
(3)將供者血小板懸液和致敏紅細(xì)胞各50μl加入血小板抗體檢測(cè)卡的樣品檢測(cè)管中，然后在檢測(cè)管中加入待檢受血者血清50μl
(4)37℃孵育15min,將血小板檢測(cè)卡放入血型卡專(zhuān)用離心機(jī)中，900rpm離心2min,2500rpm離心3min,紅細(xì)胞位于凝膠的表面，為4+強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；紅細(xì)胞懸浮在凝膠中則為1+～3+陽(yáng)性反應(yīng)，越靠近凝膠底部效價(jià)愈?。患t細(xì)胞全部沉積在凝膠的底部則為陰性。
相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明的血小板抗體檢測(cè)試劑盒中采用抗人igg及igg致敏紅細(xì)胞作為指示系統(tǒng)，以取代抗人igg包被的醛化紅細(xì)胞，簡(jiǎn)化了指示紅細(xì)胞的制備方法，提高了指示紅細(xì)胞的igg抗體的包被量和效價(jià)，提高血小板抗體檢測(cè)試劑盒的靈敏度及準(zhǔn)確性，血小板指示紅細(xì)胞可保存時(shí)間長(zhǎng)，一般可保存2年，使臨床檢驗(yàn)時(shí)操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，樣本用量少，一般只需要50μl血清即可，檢測(cè)結(jié)果清晰準(zhǔn)確，可重復(fù)性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果同時(shí)達(dá)到肉眼和自動(dòng)化機(jī)器準(zhǔn)確判讀的效果，檢測(cè)結(jié)果易于標(biāo)準(zhǔn)化。同時(shí)在進(jìn)行血小板抗體檢測(cè)卡實(shí)驗(yàn)時(shí)增加了血小板抗體陰性和陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性和質(zhì)量控制。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明血小板抗體檢測(cè)試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為檢測(cè)板，2為凝膠管，其中從左至右包括第一至第六共六個(gè)凝膠管，2.1為管口，2.2為緩沖腔，2.2.1為緩沖柱，2.3為反應(yīng)腔，2.4為支撐板，3為封口膜。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。
實(shí)施例1
如圖1所示，所述血小板抗體檢測(cè)試劑盒包括檢測(cè)板(1)、凝膠管(2)和封口膜(3)，所述凝膠管(2)有六個(gè)，呈左右排列設(shè)置在檢測(cè)板(1)的頂端，所述封口膜(3)設(shè)置在檢測(cè)板(1)的上方，且覆蓋在六個(gè)凝膠管(2)的頂端，所述每個(gè)凝膠管(2)從上到下均包括管口(2.1)、緩沖腔(2.2)和反應(yīng)腔(2.3)，所述管口(2.1)的開(kāi)口朝上，所述每個(gè)凝膠管(2)的外壁還設(shè)有兩塊支撐板(2.4)，所述兩塊支撐板(2.4)分別設(shè)置于每個(gè)凝膠管(2)的前后方，所述檢測(cè)板(1)為聚丙烯塑料透明板。所述六個(gè)凝膠管(2)中包含效價(jià)為64-128的抗人球蛋白試劑igg、并包含有0.1-1m咪唑緩沖液、1％-10％的牛血清白蛋白、0.5％-1％的氯化鈉、0.1％-1％的疊氮鈉、0.1％-2％的吐溫-20；含有2/3體積的g-25，調(diào)ph值為7.2-7.4，其中第一和第六凝膠管分別為陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管，第二到第四凝膠管作為反應(yīng)管。
所述血小板抗體檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步驟：
制備血小板抗體檢測(cè)卡(微柱凝膠法)，血小板抗體檢測(cè)卡中含有特定效價(jià)的抗人球蛋白試劑、并包含有適量的牛血清白蛋白、疊氮鈉、吐溫-20；
(1)凝膠的洗滌
將葡聚糖凝膠用20倍體積的純水進(jìn)行浸泡，沉淀后倒出上清液體，重復(fù)洗滌3-4次，然后用生理鹽水洗滌3-4次，棄出上清待用。
(2)抗體溶液及凝膠配制
配制咪唑緩沖液，分別加入牛血清白蛋白、氯化鈉、疊氮鈉、吐溫-20；將抗人球蛋白(igg)試劑按照64-128的效價(jià)比例與緩沖液咪唑混合；將葡聚糖凝膠與抗體溶液按照體積比2:1混合。
(3)凝膠灌裝
將配制好的凝膠抗體溶液按照25-35μl/管進(jìn)行灌裝。
其中，在s1中的血小板抗體檢測(cè)卡中含有效價(jià)為64-128的抗人球蛋白試劑igg、并包含有0.1-1m咪唑緩沖液、1％-10％的牛血清白蛋白、0.5％-1％的氯化鈉、0.1％-1％的疊氮鈉、0.1％-2％的吐溫-20；含有2/3體積的g-25、g-50、g-100、s-100、s-200葡聚糖凝膠的之一或其混合，ph值為7.2-7.4。
實(shí)施例2
利用實(shí)施例1的血小板抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行血小板抗體檢測(cè)的方法，所述方法包括以下步驟：在所述小板抗體檢測(cè)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照管中加入含有抗人血小板抗體的陽(yáng)性質(zhì)控、血小板指示紅細(xì)胞、血小板抗原進(jìn)行陽(yáng)性反應(yīng)；在陰性對(duì)照管中加入不含有抗人血小板抗體的陰性質(zhì)控、血小板指示紅細(xì)胞、血小板抗原進(jìn)行陰性反應(yīng)；在反應(yīng)管中加入血小板指示紅細(xì)胞、血小板抗原和待檢血清樣本進(jìn)行反應(yīng)。
其中：具體包括以下操作：
s1、包被鼠抗人血小板單克隆抗體的指示紅細(xì)胞的制備方法，并將指示紅細(xì)胞分裝后置于西林瓶?jī)?nèi)；
包被鼠抗人血小板單克隆抗體的指示紅細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
采集新鮮o型rh(d)陽(yáng)性edta抗凝的壓積紅細(xì)胞,用抗血小板糖蛋白ib/ix單克隆抗體按試劑與紅細(xì)胞按照以下體積比但不限于1:1、2:1、3:1比例混勻，4℃過(guò)夜，生成igg致敏紅細(xì)胞，洗滌去除未結(jié)合的igg，用特制的紅細(xì)胞保存液配制成0.8％的指示紅細(xì)胞懸液。0.8％指示紅細(xì)胞懸液的鑒定:1)直接抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)陽(yáng)性；2)紅細(xì)胞igg結(jié)合量檢測(cè):將抗igg試劑倍比稀釋?zhuān)尤?滴0.8％指示紅細(xì)胞，離心后顯微鏡下觀察至不凝集管的前1管作為滴度，以此滴度作為igg結(jié)合量滴度；保存期檢測(cè):直接抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果肉眼觀察凝集強(qiáng)度﹥3+，igg結(jié)合量滴度﹥32。
s2、低離子強(qiáng)度鹽溶液的配制，包括但不限于0.1％-0.9％氯化鈉、1％-10％甘氨酸、0.23g/l磷酸二氫鉀、0.47g/l磷酸氫二鈉、0.1％-1％疊氮鈉的混合溶液，調(diào)ph7.2-7.4。并將配制好的低離子溶液分裝后置于西林瓶?jī)?nèi)；
s3、血小板抗原試劑制備；
具體為：提取o型健康志愿者血小板，或?qū)⒂行趦?nèi)機(jī)采血小板用生理鹽水進(jìn)行5-10倍稀釋?zhuān)换虿捎卯?dāng)天8小時(shí)內(nèi)edta或枸櫞酸鈉抗凝的全血經(jīng)200×g離心10min，取上層2/3富血小板血漿。血小板懸液的適宜濃度為50-150×109/l，o型志愿者血小板分裝體積0.5ml/瓶。
s4、將制備的血小板抗原試劑置于西林瓶進(jìn)行低溫冷凍干燥，真空條件下進(jìn)行真空密封包裝；
具體為：將分裝好的樣品杯與西林瓶直接放置在凍干機(jī)托盤(pán)中，設(shè)定凍干機(jī)真空度1-15pa，設(shè)定凍干機(jī)的凍干曲線，溫度范圍從-40℃至35℃，凍干曲線的設(shè)定為：首先，溫度為-40℃，保存時(shí)間2小時(shí)；然后溫度為-20℃，保存時(shí)間2小時(shí)；然后溫度為-10℃，保存時(shí)間2小時(shí)；然后溫度為0℃，時(shí)間為2小時(shí)；然后溫度為10℃，時(shí)間為2小時(shí)；然后溫度為20℃，時(shí)間為2小時(shí)；然后溫度為30℃，時(shí)間為2小時(shí)；然后溫度為35℃，保存至取出。
將凍干后的西林瓶在真空條件下做壓蓋密封操作，使樣品杯處于真空環(huán)境；凍干后，在真空條件下對(duì)西林瓶進(jìn)行壓蓋處理，保證了凍干后的試劑與外界環(huán)境分離，避免了試劑因接觸空氣中的氧氣和水分而失效，提高了試劑的穩(wěn)定性。
s5、血小板抗體陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控的制備，血小板抗體陰性對(duì)照質(zhì)控的制備；
具體為：血小板抗體陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控含有抗人血小板抗體及0.1％的疊氮鈉，血小板抗體陰性對(duì)照質(zhì)控不含有抗人血小板抗體，含有0.1％的疊氮鈉；
s6、按照血小板抗體及血小板交叉配型檢測(cè)步驟將上述試劑用于檢測(cè)待檢血清或血漿血小板抗體檢測(cè)、交叉配型實(shí)驗(yàn)；
血小板抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟如下：
1、將凍干的血小板抗原用生理鹽水0.5ml/瓶復(fù)溶，18-25℃靜置5min，使其充分溶解，溶解后的血小板濃度約為50-150×109/l。
2、將s1中的鼠單克隆抗體包被的紅細(xì)胞用低離子鹽溶液稀釋成0.8％-1％的紅細(xì)胞懸液。
3、將血小板抗原和致敏紅細(xì)胞各50μl加入血小板抗體檢測(cè)卡的樣品檢測(cè)管中，然后在檢測(cè)管中加入待檢患者血清50μl；
4、37℃孵育15min，將血小板檢測(cè)卡放入血型卡專(zhuān)用離心機(jī)中，900rpm離心2min,2500rpm離心3min，紅細(xì)胞位于凝膠的表面，為4+強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；紅細(xì)胞懸浮在凝膠中則為1+～3+陽(yáng)性反應(yīng)，越靠近凝膠底部效價(jià)愈??；紅細(xì)胞全部沉積在凝膠的底部則為陰性。
其中血小板交叉配型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟；
(1)制備與受血者abo同型的供者血小板懸液：將有效期內(nèi)機(jī)采血小板用生理鹽水進(jìn)行5-10倍稀釋?zhuān)换虿捎卯?dāng)天8小時(shí)內(nèi)edta或枸櫞酸鈉抗凝的全血經(jīng)200×g離心10min，取上層2/3富血小板血漿。血小板懸液的適宜濃度為50-150×109/l。
(2)將s1中的鼠單克隆抗體包被的紅細(xì)胞用低離子鹽溶液稀釋成0.8％-1％的紅細(xì)胞懸液。
(3)將供者血小板懸液和致敏紅細(xì)胞各50μl加入血小板抗體檢測(cè)卡的樣品檢測(cè)管中，然后在檢測(cè)管中加入待檢受血者血清50μl
(4)37℃孵育15min,將血小板檢測(cè)卡放入血型卡專(zhuān)用離心機(jī)中，900rpm離心2min,2500rpm離心3min,紅細(xì)胞位于凝膠的表面，為4+強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；紅細(xì)胞懸浮在凝膠中則為1+～3+陽(yáng)性反應(yīng)，越靠近凝膠底部效價(jià)愈?。患t細(xì)胞全部沉積在凝膠的底部則為陰性。
綜上所述，本發(fā)明提供了一種血小板抗體檢測(cè)試劑盒制備方法，該方法應(yīng)用包被鼠抗人血小板單克隆抗體的指示紅細(xì)胞進(jìn)行微柱凝膠抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)血小板抗體，實(shí)驗(yàn)將低離子強(qiáng)度鹽溶液、血小板抗原、待檢樣本/質(zhì)控、血小板指示紅細(xì)胞依次加入血小板抗體檢測(cè)卡中，進(jìn)行血小板抗體檢測(cè)和質(zhì)控檢測(cè)。采用抗人igg及igg致敏紅細(xì)胞作為指示系統(tǒng)，以取代抗人igg包被的醛化紅細(xì)胞，簡(jiǎn)化了指示紅細(xì)胞的制備方法，提高了指示紅細(xì)胞的igg抗體的包被量和效價(jià)，該試劑盒中血小板指示紅細(xì)胞可保存時(shí)間長(zhǎng)，一般可保存2年，使臨床檢驗(yàn)時(shí)操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，樣本用量少，一般只需要50μl血清即可，檢測(cè)結(jié)果清晰準(zhǔn)確，可重復(fù)性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果同時(shí)達(dá)到肉眼和自動(dòng)化機(jī)器準(zhǔn)確判讀的效果，檢測(cè)結(jié)果易于標(biāo)準(zhǔn)化。同時(shí)在進(jìn)行血小板抗體檢測(cè)卡實(shí)驗(yàn)時(shí)增加了血小板抗體陰性和陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性和質(zhì)量控制。
申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的血小板抗體檢測(cè)試劑盒及其使用方法，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴(lài)上述實(shí)施例才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。