本發(fā)明涉及一種檢測(cè)用質(zhì)控品及其配制方法，特別涉及氨基酸與酰基肉堿干血斑質(zhì)控品及其制備方法。

背景技術(shù)：

遺傳代謝病是指由于基因突變使合成的酶、受體、載體等蛋白功能缺陷，導(dǎo)致體內(nèi)生化物質(zhì)在合成、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存等方面出現(xiàn)各種異常。它屬于單基因遺傳病的一部分，絕大多數(shù)屬常染色體隱性遺傳，少數(shù)為常染色體顯性遺傳、x連鎖伴性遺傳，或者線粒體遺傳；遺傳代謝病病種繁多，常見500-600種，總數(shù)可能達(dá)數(shù)千余種；單病發(fā)病率低，但總體發(fā)病率較高，有報(bào)道患病率在0.5％以上。

新生兒疾病篩查是預(yù)防出生缺陷行之有效的三級(jí)預(yù)防措施，對(duì)提高出生人口素質(zhì)有著重要的意義。串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的遺傳代謝病項(xiàng)目在2分鐘內(nèi)可檢測(cè)18種氨基酸和45種酰基肉堿，上述遺傳代謝病可檢測(cè)超過45種遺傳代謝病，目前已廣泛應(yīng)用于各種高端實(shí)驗(yàn)室，可更有效、更早地檢出遺傳性代謝性疾病，為針對(duì)性治療提供有效依據(jù)。隨著該技術(shù)越來越多地應(yīng)用于臨床的輔助診斷，體內(nèi)氨基酸和酰基肉堿測(cè)定的準(zhǔn)確性顯得越來越重要。

質(zhì)控品是專門用于室內(nèi)質(zhì)量控制的、穩(wěn)定的、與待測(cè)樣品近似的材料，是保證準(zhǔn)確測(cè)定的重要基礎(chǔ)，并可對(duì)方法穩(wěn)定性進(jìn)行一個(gè)長(zhǎng)期有效的監(jiān)控，隨著串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)越來越多地應(yīng)用于臨床的輔助診斷，相關(guān)質(zhì)控品的需求量也逐漸增大。

由于串聯(lián)質(zhì)譜一次檢測(cè)的化合物種類繁多，一般而言，為保證其質(zhì)控效果，其質(zhì)控品中也需要添加多種組分，而因?yàn)楦鹘M分的特性不同，難以制備得到均一穩(wěn)定的質(zhì)控品。因此，目前，商品化氨基酸和?；鈮A干血斑質(zhì)控品來源少，且產(chǎn)品價(jià)格昂貴，到貨周期長(zhǎng)，同一批號(hào)無穩(wěn)定性來源。因此，研發(fā)穩(wěn)定性、均一性都符合要求的質(zhì)控品制備方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種成份相對(duì)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性、均一性均符合要求的氨基酸與?；鈮A干血斑質(zhì)控品及其制備方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種氨基酸與?；鈮A干血斑質(zhì)控品，主要由氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、酰基肉堿標(biāo)準(zhǔn)品和紅細(xì)胞干固于載體上形成，其中，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品包括丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、精氨酸、酪氨酸共8種氨基酸。

作為上述氨基酸與?；鈮A干血斑質(zhì)控品的進(jìn)一步改進(jìn)，?；鈮A標(biāo)準(zhǔn)品包括游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、葵酰肉堿、月桂酰肉堿、肉豆蔻酰肉堿、棕櫚酰肉堿、十八碳酰肉堿、3-羥基異戊酰肉堿、戊二酰肉堿、丙二酰肉堿共15種?；鈮A。

作為上述氨基酸與?；鈮A干血斑質(zhì)控品的進(jìn)一步改進(jìn)，質(zhì)控品中各氨基酸按照以下述終摩爾比配合：

作為上述氨基酸與?；鈮A干血斑質(zhì)控品的進(jìn)一步改進(jìn)，質(zhì)控品中各?；鈮A按下述終摩爾比配合：

作為上述氨基酸與酰基肉堿干血斑質(zhì)控品的進(jìn)一步改進(jìn)，載體為濾紙。濾紙可以是國(guó)際903濾紙片等本領(lǐng)域常用的濾紙。

一種上述的氨基酸與酰基肉堿干血斑質(zhì)控品的制備方法，包括如下步驟：

1)制備紅細(xì)胞液：收集健康人源全血，分離得到紅細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)整紅細(xì)胞比容至預(yù)定值，得到紅細(xì)胞液，并測(cè)定其中各氨基酸和?；鈮A本底值；

2)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液：使用水性溶劑將氨基酸和/或水溶性酰基肉堿溶解；使用醇類溶劑溶解脂溶性?；鈮A，得到氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和/或酰基肉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液；

3)制備血斑質(zhì)控品：在上述紅細(xì)胞液中添加氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和/或?；鈮A標(biāo)準(zhǔn)溶液至設(shè)定值，得到工作液；取上述工作液滴加在載體上，干燥得到氨基酸與酰基肉堿干血斑質(zhì)控品。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，水性溶劑為生理鹽水，所述氨基酸為：丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、精氨酸、亮氨酸和酪氨酸；所述水溶性?；鈮A為：游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、葵酰肉堿、3-羥基異戊酰肉堿、戊二酰肉堿和丙二酰肉堿；醇類溶劑為甲醇，所述脂溶性酰基肉堿為：月桂酰肉堿、肉豆蔻酰肉堿、棕櫚酰肉堿、十八碳酰肉堿。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，制備紅細(xì)胞液步驟中，紅細(xì)胞比容的預(yù)定值為45～55％。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，工作液中，各氨基酸的濃度分別為：丙氨酸350～650μm、苯丙氨酸120～300μm、亮氨酸150～450μm、甲硫氨酸50～170μm、纈氨酸200～400μm、瓜氨酸40～150μm、精氨酸60～200μm、酪氨酸180～370μm；各?；鈮A的濃度分別為：游離肉堿30～70μm、乙酰肉堿20～40μm、丙酰肉堿5～12μm、丁酰肉堿1～3.5μm、異戊酰肉堿0.5～2.0μm、己酰肉堿0.4～1.2μm、辛酰肉堿0.4～1.2μm、葵酰肉堿0.4～1.2μm、月桂酰肉堿0.3～1.0μm、肉豆蔻酰肉堿0.4～1.4μm、棕櫚酰肉堿4.0～12.0μm、十八碳酰肉堿1.5～6.0μm、3-羥基異戊酰肉堿0.4～1.2μm、戊二酰肉堿1.0～3.0μm、丙二酰肉堿0.2～1.0μm。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，制備血斑質(zhì)控品步驟中，取70～100μl工作液滴加在載體上。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的氨基酸與?；鈮A干血斑質(zhì)控品，通過精心設(shè)計(jì)組份，綜合考慮檢測(cè)方法的特點(diǎn)和18種氨基酸與45種?；鈮A檢測(cè)指標(biāo)的重要性之后選出，最具代表性，在大幅減少標(biāo)準(zhǔn)品使用的情況下，獲得了穩(wěn)定性、均一性都符合要求的氨基酸與?；鈮A干血斑質(zhì)控品。

并且，該質(zhì)控指標(biāo)的濃度也是非常關(guān)鍵的，同樣是綜合考慮檢測(cè)方法的特點(diǎn)和各檢測(cè)指標(biāo)的特點(diǎn)之后選出，具有最佳的代表性和穩(wěn)定性。

該質(zhì)控品制備方法成本低，操作簡(jiǎn)單，能夠較大量的進(jìn)行配制，使用周期較長(zhǎng)，不需頻繁更換質(zhì)控批號(hào)，方便日常質(zhì)控分析，從而滿足臨床和日常檢測(cè)對(duì)質(zhì)控品的需求。

采用本發(fā)明提供的制備方法制得的氨基酸與?；鈮A干血斑質(zhì)控品在-20℃的條件下可保存4個(gè)月以上，從-20℃條件取出恢復(fù)常溫后的均一性、穩(wěn)定性都能符合質(zhì)控品要求。

具體實(shí)施方式

一種氨基酸與?；鈮A干血斑質(zhì)控品，主要由氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、酰基肉堿標(biāo)準(zhǔn)品和紅細(xì)胞干固于載體上形成，其中，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品包括丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、精氨酸、酪氨酸共8種氨基酸。

作為上述氨基酸與酰基肉堿干血斑質(zhì)控品的進(jìn)一步改進(jìn)，?；鈮A標(biāo)準(zhǔn)品包括游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、葵酰肉堿、月桂酰肉堿、肉豆蔻酰肉堿、棕櫚酰肉堿、十八碳酰肉堿、3-羥基異戊酰肉堿、戊二酰肉堿、丙二酰肉堿共15種?；鈮A。

作為上述氨基酸與?；鈮A干血斑質(zhì)控品的進(jìn)一步改進(jìn)，質(zhì)控品中各氨基酸按照以下述終摩爾比配合：

作為上述氨基酸與酰基肉堿干血斑質(zhì)控品的進(jìn)一步改進(jìn)，質(zhì)控品中各?；鈮A按下述終摩爾比配合：

作為上述氨基酸與酰基肉堿干血斑質(zhì)控品的進(jìn)一步改進(jìn)，載體為濾紙。濾紙可以是國(guó)際903濾紙片等本領(lǐng)域常用的濾紙。

一種上述的氨基酸與?；鈮A干血斑質(zhì)控品的制備方法，包括如下步驟：

1)制備紅細(xì)胞液：收集健康人源全血，分離得到紅細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)整紅細(xì)胞比容至預(yù)定值，得到紅細(xì)胞液，并測(cè)定其中各氨基酸和?；鈮A本底值；

2)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液：使用水性溶劑將氨基酸和/或水溶性?；鈮A溶解；使用醇類溶劑溶解脂溶性酰基肉堿，得到氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和/或?；鈮A標(biāo)準(zhǔn)溶液；

3)制備血斑質(zhì)控品：在上述紅細(xì)胞液中添加氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和/或?；鈮A標(biāo)準(zhǔn)溶液至設(shè)定值，得到工作液；取上述工作液滴加在載體上，干燥得到氨基酸與?；鈮A干血斑質(zhì)控品。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，水性溶劑為生理鹽水，所述氨基酸為：丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、精氨酸、亮氨酸和酪氨酸；所述水溶性?；鈮A為：游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、葵酰肉堿、3-羥基異戊酰肉堿、戊二酰肉堿和丙二酰肉堿；醇類溶劑為甲醇，所述脂溶性?；鈮A為：月桂酰肉堿、肉豆蔻酰肉堿、棕櫚酰肉堿、十八碳酰肉堿。

醇類溶劑也包括醇的水溶液。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，制備紅細(xì)胞液步驟中，紅細(xì)胞比容的預(yù)定值為45～55％。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，工作液中，各氨基酸的濃度分別為：丙氨酸350～650μm、苯丙氨酸120～300μm、亮氨酸150～450μm、甲硫氨酸50～170μm、纈氨酸200～400μm、瓜氨酸40～150μm、精氨酸60～200μm、酪氨酸180～370μm；各?；鈮A的濃度分別為：游離肉堿30～70μm、乙酰肉堿20～40μm、丙酰肉堿5～12μm、丁酰肉堿1～3.5μm、異戊酰肉堿0.5～2.0μm、己酰肉堿0.4～1.2μm、辛酰肉堿0.4～1.2μm、葵酰肉堿0.4～1.2μm、月桂酰肉堿0.3～1.0μm、肉豆蔻酰肉堿0.4～1.4μm、棕櫚酰肉堿4.0～12.0μm、十八碳酰肉堿1.5～6.0μm、3-羥基異戊酰肉堿0.4～1.2μm、戊二酰肉堿1.0～3.0μm、丙二酰肉堿0.2～1.0μm。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，制備血斑質(zhì)控品步驟中，取70～100μl工作液滴加在載體上。

氨基酸、?；鈮A既可以單獨(dú)溶解配置成為相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，也可以根據(jù)需要將多種標(biāo)準(zhǔn)品一并溶解，或分成多組溶解。優(yōu)選的，根據(jù)不同氨基酸、?；鈮A的溶解特性差異進(jìn)行分組溶解，這樣可以大大減少標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制量，降低配制的難度。

配制時(shí)，可以參考美國(guó)cdc質(zhì)控品濃度、實(shí)驗(yàn)室臨床參考值和紅細(xì)胞液中的目標(biāo)氨基酸及酰基肉堿本底濃度，加入目標(biāo)氨基酸及?；鈮A標(biāo)準(zhǔn)品，將濃度調(diào)節(jié)至目標(biāo)濃度，具體如下：

計(jì)算所需配制濃度質(zhì)控品所需標(biāo)準(zhǔn)品用量

n(理論物質(zhì)的量)＝c(需要加強(qiáng)的濃度)×v(配制的質(zhì)控總體積)

m(實(shí)際稱取量)＝n(理論物質(zhì)的量)*m(相對(duì)分子質(zhì)量)

計(jì)算所需加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的總體積，計(jì)算所需加入生理鹽水體積，即得50％紅細(xì)胞比容質(zhì)控基質(zhì)；

v(生理鹽水體積)＝v1(紅細(xì)胞體積)-v2(加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液總體積)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以使用其他為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的手段進(jìn)行配制。

濃度單位μm指μmol/l。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1

1)紅細(xì)胞的分離：

收集健康人源肝素抗凝全血，要求無明顯溶血、黃疸、脂肪或污染，以3000r/min的速度離心5min，離心后分出上清液及白膜，加入約紅細(xì)胞量等量的生理鹽水，使用混勻器充分混勻5-7min，3000r/min離心5min后分出上清液及白膜，重復(fù)此步驟3次，即得紅細(xì)胞。使用生理鹽水調(diào)整紅細(xì)胞比容為50％，得到紅細(xì)胞液，測(cè)定紅細(xì)胞液中氨基酸及?；鈮A本底濃度。

2)氨基酸和?；鈮A的配制：

使用生理鹽水溶解丙氨酸ala、苯丙氨酸phe、亮氨酸lue、甲硫氨酸met、纈氨酸val、瓜氨酸cit、精氨酸arg、酪氨酸t(yī)yr共8種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，得到氨基酸溶液；

使用生理鹽水溶解游離肉堿c0、乙酰肉堿c2、丙酰肉堿c3、丁酰肉堿c4、異戊酰肉堿c5、己酰肉堿c6、辛酰肉堿c8、葵酰肉堿c10、3-羥基異戊酰肉堿c5-oh、戊二酰肉堿c5dc、丙二酰肉堿c3dc，得到水溶性?；鈮A溶液；

使用40v/v％甲醇水溶解月桂酰肉堿c12、肉豆蔻酰肉堿c14、棕櫚酰肉堿c16、十八碳酰肉堿c18，得到脂溶性?；鈮A溶液。

將氨基酸溶液和水溶性?；鈮A溶液與紅細(xì)胞液混合，之后滴加脂溶性?；鈮A溶液，充分混勻，得到混合液。根據(jù)紅細(xì)胞液中氨基酸及酰基肉堿本底濃度，通過調(diào)節(jié)氨基酸溶液和?；鈮A溶液的添加量以及生理鹽水的添加量，控制氨基酸和?；鈮A溶液在混合液中的終濃度如表1所示：

表1、目標(biāo)氨基酸與肉堿配置濃度范圍

3)干血斑質(zhì)控品的制備

使用移液器吸取上一步驟中的混合液85μl，滴加于國(guó)際903#濾紙片上，室溫下過夜晾干，得到氨基酸和酰基肉堿干血斑質(zhì)控品。

氨基酸和酰基肉堿干血斑質(zhì)控品使用自封袋密封，置于-20℃以下，濕度30rh％以下的條件下保存。

下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步展示本發(fā)明方法制得的氨基酸和酰基肉堿干血斑質(zhì)控品的優(yōu)勢(shì)。

氨基酸和?；鈮A質(zhì)控干血斑均一性評(píng)估

隨機(jī)抽取氨基酸和?；鈮A干血斑質(zhì)控各20個(gè)血斑，按照日常檢測(cè)流程處理樣品，使用lc-ms/ms進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算rsd。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2～表5所示：

表2氨基酸干血斑質(zhì)控(low)均一性評(píng)估數(shù)據(jù)

表3氨基酸干血斑質(zhì)控(high)均一性評(píng)估數(shù)據(jù)

表4?；鈮A干血斑質(zhì)控(low)均一性評(píng)估數(shù)據(jù)

表5?；鈮A干血斑質(zhì)控(high)均一性評(píng)估數(shù)據(jù)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：質(zhì)控品中氨基酸的rsd均在4.00％～15.00％之間，?；鈮A的rsd均在5.00％～20.00％之間，說明質(zhì)控基質(zhì)均勻，均一性良好。

氨基酸和?；鈮A質(zhì)控干血斑穩(wěn)定性評(píng)估

血斑晾干保存后，每次實(shí)驗(yàn)采用3天的結(jié)果，每天檢測(cè)4組質(zhì)控，每隔60天，重復(fù)此操作，計(jì)算其均值、rsd，并進(jìn)行趨勢(shì)性分析，以初始3天均值為初始值，計(jì)算回收率。結(jié)果如表6～9所示：

表6、氨基酸干血斑質(zhì)控(low)穩(wěn)定性評(píng)估數(shù)據(jù)

表7、氨基酸干血斑質(zhì)控(high)穩(wěn)定性評(píng)估數(shù)據(jù)

表8、酰基肉堿干血斑質(zhì)控(low)穩(wěn)定性評(píng)估數(shù)據(jù)

表9、?；鈮A干血斑質(zhì)控(high)穩(wěn)定性評(píng)估數(shù)據(jù)

使用lc-ms/ms對(duì)氨基酸和酰基肉堿干血斑質(zhì)控長(zhǎng)期穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，其中氨基酸回收率均在80％～110％之間，?；鈮A回收率均在80％～120之間，氨基酸和酰基肉堿干血斑質(zhì)控品在-20℃以下，濕度30rh％以下的條件下，可穩(wěn)定保存4個(gè)月。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。