本發(fā)明涉及中草藥檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種紫草素手性異構(gòu)體的分離檢測方法。
背景技術(shù)：
：紫草素是一種結(jié)晶性粉末，存在于紫草科植物紫草的根，新疆紫草等植物中。亦可用紫草的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草素。紫草素具有抗癌、抗炎、抗菌等作用，臨床用于治療急、慢性肝炎、肝硬化等，皮肝科用于治療扁平疣、銀屑病，局部應(yīng)用治療燒傷和促進(jìn)傷口愈合，滴眼劑用于治療單皰病毒性角膜炎，對上皮型樹枝狀和淺實(shí)質(zhì)層樹枝狀角膜炎有一定療效，油劑用于治療嬰兒皮炎、濕疹、陰道炎、子宮頸炎等；且含有紫草素的牙膏可防治牙齲和牙齦炎，亦可用于藥物、化妝品及食品的著色劑等。紫草素包括左旋紫草素和右旋紫草素，天然提取的紫草素一般為2種異構(gòu)體的混合物，有些植物來源中左旋紫草素占優(yōu)勢，有些來源中右旋紫草素占優(yōu)勢。因此在實(shí)際的紫草素的應(yīng)用研究過程中，如何對紫草素中這兩種異構(gòu)體進(jìn)行分離檢測從而進(jìn)行不同結(jié)構(gòu)的應(yīng)用研究或作為其他產(chǎn)品合成原料的研究時顯得極為重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提出了一種操作簡單方便、具有良好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，數(shù)據(jù)直觀可靠的紫草素手性異構(gòu)體的分離檢測方法。技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種紫草素手性異構(gòu)體的分離檢測方法，采用高效液相色譜的方法進(jìn)行檢測，具體包括如下步驟：(1)對照品溶液的配制：精密稱取紫草素對照品，用乙腈溶液進(jìn)行溶解，配制成濃度為0.9-1.2mg/ml的對照品溶液；(2)供試品溶液的配制：精密稱取待測紫草素樣品，加入乙腈溶液配制成濃度為0.9-1.1mg/ml的供試品溶液，超聲溶解，放置至室溫，搖勻，即得；(3)液相色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：手性柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動相a，以0.5％的冰醋酸溶液為流動相b，梯度洗脫；室溫，柱溫為30℃，流速0.8-1.0ml/min，進(jìn)樣量20μl；檢測波長為512-520nm；其中流動相梯度為：在0-5min段，乙腈的體積比例為60％-65％，冰醋酸溶液體積比例為35％-40％；在5至15min段，乙腈的體積比例為65％-80％，冰醋酸溶液體積比例為20％-35％；在15至30min段，乙腈的體積比例為80％-90％，冰醋酸溶液體積比例為10％-20％；(4)測定法：將按照步驟(1)和(2)制得的對照品溶液和供試品溶液在步驟(3)的色譜檢測條件下注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，然后計(jì)算紫草素樣品中異構(gòu)體的含量。更為優(yōu)選的，步驟(1)中所述對照品溶液濃度為1mg/ml。更為優(yōu)選的，步驟(2)中所述供試品溶液濃度為1mg/ml。更為優(yōu)選的，步驟(3)中所述流速為1.0ml/min。更為優(yōu)選的，步驟(3)中所述檢測波長為516nm。更為優(yōu)選的，步驟(1)中所述流動相梯度為：在0-5min段，乙腈的體積比例為63％，冰醋酸溶液體積比例為37％；在5至15min段，乙腈的體積比例為75％，冰醋酸溶液體積比為25％；在15至30min段，乙腈的體積比例為85％，冰醋酸溶液體積比為15％。更為優(yōu)選的，步驟(4)中的計(jì)算紫草素樣品中異構(gòu)體的含量具體方法為以對照品同保留時間上出現(xiàn)相同的峰，計(jì)算左旋紫草素和右旋紫草素分別的含量，計(jì)算公式為：c樣＝(c對*a樣)/a對，異構(gòu)體含量＝c樣*v/m樣；計(jì)算樣品中左旋紫草素含量時，c樣表示紫草素樣品中左旋紫草素的濃度；c對表示對照品溶液的濃度；a樣表示紫草素樣品中左旋紫草素相應(yīng)的峰面積；a對表示對照品溶液中跟左旋紫草素相同的峰的峰面積；v為供試品配制時的溶液體積；m樣表示供試品的質(zhì)量；計(jì)算樣品中右旋紫草素含量時，c樣表示紫草素樣品中右旋紫草素的濃度；c對表示對照品溶液的濃度；a樣表示紫草素樣品中右旋紫草素相應(yīng)的峰面積；a對表示對照品溶液中跟右旋紫草素相同的峰的峰面積；v為供試品配制時的溶液體積；m樣表示供試品的質(zhì)量。有益效果：本發(fā)明提供的一種紫草素手性異構(gòu)體的分離檢測方法，采用高效液相色譜的檢測方法，以乙腈為流動相a，0.5％的冰醋酸為流動相b進(jìn)行梯度洗脫，控制0.8-1.2ml/min的流速，30℃的柱溫，在512-520nm的波長下進(jìn)行檢測并計(jì)算紫草素中兩種異構(gòu)體的含量。本發(fā)明的檢測方法，操作簡單方便、具有良好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，能夠很好的分離檢測出左旋紫草素和右旋紫草素，且數(shù)據(jù)直觀可靠，適用于高純度紫草素的分離檢測，為紫草素手性異構(gòu)體的分離檢測以及應(yīng)用研究提供了理論基礎(chǔ)和有效檢測方法。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明：下述實(shí)施例中所用檢測儀器和藥品如下：島津高效液相色譜儀，包括lc20at二元泵，spd10avpplus紫外檢測器，lc-solution色譜工作站。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。實(shí)施例1：一種紫草素手性異構(gòu)體的分離檢測方法，采用高效液相色譜的方法進(jìn)行檢測，具體包括如下步驟：(1)對照品溶液的配制：精密稱取紫草素對照品9.82mg于10ml容量瓶，用乙腈溶液進(jìn)行溶解，配制成濃度為0.982mg/ml的對照品溶液；(2)供試品溶液的配制：精密稱取待測紫草素樣品25.03mg于25ml容量瓶，加入乙腈溶液配制成濃度為1.001mg/ml的供試品溶液，超聲溶解，放置至室溫，搖勻，即得；(3)液相色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：手性柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動相a，以0.5％的冰醋酸溶液為流動相b，梯度洗脫；室溫，柱溫為30℃，流速0.8ml/min，進(jìn)樣量20μl；檢測波長為512nm；其中流動相梯度以表1的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫：表1流動相洗脫梯度時間(分鐘)流動相a(％)流動相b(％)0-560405-15653515-308020(4)測定法以及測定結(jié)果：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，在步驟(3)的色譜檢測條件下注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，在對照品同保留時間上樣品出現(xiàn)相同的峰，計(jì)算左旋紫草素和右旋紫草素分別的含量，計(jì)算公式為：c樣＝(c對*a樣)/a對，異構(gòu)體含量＝c樣*v/m樣；計(jì)算樣品中左旋紫草素含量時，c樣表示紫草素樣品中左旋紫草素的濃度；c對表示對照品溶液的濃度0.982mg/ml；a樣表示紫草素樣品中左旋紫草素相應(yīng)的峰面積；a對表示對照品溶液中跟左旋紫草素相同的峰的峰面積；v為25ml；m樣表示供試品的質(zhì)量25.03mg；計(jì)算樣品中右旋紫草素含量時，c樣表示紫草素樣品中右旋紫草素的濃度；c對表示對照品溶液的濃度0.982mg/ml；a樣表示紫草素樣品中右旋紫草素相應(yīng)的峰面積；a對表示對照品溶液中跟右旋紫草素相同的峰的峰面積；v為25ml；m樣表示供試品的質(zhì)量25.03mg；測定結(jié)果為：左旋紫草素含量為71.45％，右旋紫草素為28.55％，兩者的分離度較好。實(shí)施例2：一種紫草素手性異構(gòu)體的分離檢測方法，采用高效液相色譜的方法進(jìn)行檢測，具體包括如下步驟：(1)對照品溶液的配制：精密稱取紫草素對照品10.32mg于10ml容量瓶，用乙腈溶液進(jìn)行溶解，配制成濃度為1.032mg/ml的對照品溶液；(2)供試品溶液的配制：精密稱取待測紫草素樣品25.17mg于25ml容量瓶，加入乙腈溶液配制成濃度為1.007mg/ml的供試品溶液，超聲溶解，放置至室溫，搖勻，即得；(3)液相色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：手性柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動相a，以0.5％的冰醋酸溶液為流動相b，梯度洗脫；室溫，柱溫為30℃，流速0.8ml/min，進(jìn)樣量20μl；檢測波長為516nm；其中流動相梯度以表2的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫：表2流動相洗脫梯度時間(分鐘)流動相a(％)流動相b(％)0-565355-15802015-309010(4)測定法以及測定結(jié)果：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，在步驟(3)的色譜檢測條件下注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，在對照品同保留時間上樣品出現(xiàn)相同的峰，計(jì)算左旋紫草素和右旋紫草素分別的含量，計(jì)算公式為：c樣＝(c對*a樣)/a對，異構(gòu)體含量＝c樣*v/m樣；計(jì)算樣品中左旋紫草素含量時，c樣表示紫草素樣品中左旋紫草素的濃度；c對表示對照品溶液的濃度1.032mg/ml；a樣表示紫草素樣品中左旋紫草素相應(yīng)的峰面積；a對表示對照品溶液中跟左旋紫草素相同的峰的峰面積；v為25ml；m樣表示供試品的質(zhì)量25.17mg；計(jì)算樣品中右旋紫草素含量時，c樣表示紫草素樣品中右旋紫草素的濃度；c對表示對照品溶液的濃度1.032mg/ml；a樣表示紫草素樣品中右旋紫草素相應(yīng)的峰面積；a對表示對照品溶液中跟右旋紫草素相同的峰的峰面積；v為25ml；m樣表示供試品的質(zhì)量25.17mg；測定結(jié)果為：計(jì)算左旋紫草素含量為70.89％，右旋紫草素為29.11％，兩者的分離度較好。實(shí)施例3：一種紫草素手性異構(gòu)體的分離檢測方法，采用高效液相色譜的方法進(jìn)行檢測，具體包括如下步驟：(1)對照品溶液的配制：精密稱取紫草素對照品10.43mg于10ml容量瓶，用乙腈溶液進(jìn)行溶解，配制成濃度為1.043mg/ml的對照品溶液；(2)供試品溶液的配制：精密稱取待測紫草素樣品25.36mg于25ml容量瓶，加入乙腈溶液配制成濃度為1.014mg/ml的供試品溶液，超聲溶解，放置至室溫，搖勻，即得；(3)液相色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：手性柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動相a，以0.5％的冰醋酸溶液為流動相b，梯度洗脫；室溫，柱溫為30℃，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量20μl；檢測波長為520nm；其中流動相梯度以表3的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫：表3流動相洗脫梯度時間(分鐘)流動相a(％)流動相b(％)0-565355-15851515-309010(4)測定法以及測定結(jié)果：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，在步驟(3)的色譜檢測條件下注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，在對照品同保留時間上樣品出現(xiàn)相同的峰，計(jì)算左旋紫草素和右旋紫草素分別的含量，計(jì)算公式為：c樣＝(c對*a樣)/a對，異構(gòu)體含量＝c樣*v/m樣；計(jì)算樣品中左旋紫草素含量時，c樣表示紫草素樣品中左旋紫草素的濃度；c對表示對照品溶液的濃度1.043mg/ml；a樣表示紫草素樣品中左旋紫草素相應(yīng)的峰面積；a對表示對照品溶液中跟左旋紫草素相同的峰的峰面積；v為25ml；m樣表示供試品的質(zhì)量25.36mg；計(jì)算樣品中右旋紫草素含量時，c樣表示紫草素樣品中右旋紫草素的濃度；c對表示對照品溶液的濃度1.043mg/ml；a樣表示紫草素樣品中右旋紫草素相應(yīng)的峰面積；a對表示對照品溶液中跟右旋紫草素相同的峰的峰面積；v為25ml；m樣表示供試品的質(zhì)量25.36mg；測定結(jié)果為：計(jì)算左旋紫草素含量為70.45％，右旋紫草素為29.55％，兩者的分離度較好。實(shí)施例4：一種紫草素手性異構(gòu)體的分離檢測方法，采用高效液相色譜的方法進(jìn)行檢測，具體包括如下步驟：(1)對照品溶液的配制：精密稱取紫草素對照品10.19mg于10ml容量瓶，用乙腈溶液進(jìn)行溶解，配制成濃度為1.019mg/ml的對照品溶液；(2)供試品溶液的配制：精密稱取待測紫草素樣品25.41mg于25ml容量瓶，加入乙腈溶液配制成濃度為1.016mg/ml的供試品溶液，超聲溶解，放置至室溫，搖勻，即得；(3)液相色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：手性柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動相a，以0.5％的冰醋酸溶液為流動相b，梯度洗脫；室溫，柱溫為30℃，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量20μl；檢測波長為520nm；其中流動相梯度以表4的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫：表4流動相洗脫梯度時間(分鐘)流動相a(％)流動相b(％)0-560405-15752515-308515(4)測定法以及測定結(jié)果：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，在步驟(3)的色譜檢測條件下注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，在對照品同保留時間上樣品出現(xiàn)相同的峰，計(jì)算左旋紫草素和右旋紫草素分別的含量，計(jì)算公式為：c樣＝(c對*a樣)/a對，異構(gòu)體含量＝c樣*v/m樣；計(jì)算樣品中左旋紫草素含量時，c樣表示紫草素樣品中左旋紫草素的濃度；c對表示對照品溶液的濃度1.019mg/ml；a樣表示紫草素樣品中左旋紫草素相應(yīng)的峰面積；a對表示對照品溶液中跟左旋紫草素相同的峰的峰面積；v為25ml；m樣表示供試品的質(zhì)量25.41mg；計(jì)算樣品中右旋紫草素含量時，c樣表示紫草素樣品中右旋紫草素的濃度；c對表示對照品溶液的濃度1.019mg/ml；a樣表示紫草素樣品中右旋紫草素相應(yīng)的峰面積；a對表示對照品溶液中跟右旋紫草素相同的峰的峰面積；v為25ml；m樣表示供試品的質(zhì)量25.41mg；測定結(jié)果為：計(jì)算左旋紫草素含量為71.33％，右旋紫草素為28.67％，兩者的分離度較好。實(shí)施例5：一種紫草素手性異構(gòu)體的分離檢測方法，采用高效液相色譜的方法進(jìn)行檢測，具體包括如下步驟：(1)對照品溶液的配制：精密稱取紫草素對照品10.15mg于10ml容量瓶，用乙腈溶液進(jìn)行溶解，配制成濃度為1.015mg/ml的對照品溶液；(2)供試品溶液的配制：精密稱取待測紫草素樣品25.07mg于25ml容量瓶，加入乙腈溶液配制成濃度為1.002mg/ml的供試品溶液，超聲溶解，放置至室溫，搖勻，即得；(3)液相色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：手性柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動相a，以0.5％的冰醋酸溶液為流動相b，梯度洗脫；室溫，柱溫為30℃，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量20μl；檢測波長為516nm；其中流動相梯度以表5的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫：表5流動相洗脫梯度時間(分鐘)流動相a(％)流動相b(％)0-563375-15752515-308515(4)測定法以及測定結(jié)果：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，在步驟(3)的色譜檢測條件下注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，在對照品同保留時間上樣品出現(xiàn)相同的峰，計(jì)算左旋紫草素和右旋紫草素分別的含量，計(jì)算公式為：c樣＝(c對*a樣)/a對，異構(gòu)體含量＝c樣*v/m樣；計(jì)算樣品中左旋紫草素含量時，c樣表示紫草素樣品中左旋紫草素的濃度；c對表示對照品溶液的濃度1.015mg/ml；a樣表示紫草素樣品中左旋紫草素相應(yīng)的峰面積；a對表示對照品溶液中跟左旋紫草素相同的峰的峰面積；v為25ml；m樣表示供試品的質(zhì)量25.07mg；計(jì)算樣品中右旋紫草素含量時，c樣表示紫草素樣品中右旋紫草素的濃度；c對表示對照品溶液的濃度1.015mg/ml；a樣表示紫草素樣品中右旋紫草素相應(yīng)的峰面積；a對表示對照品溶液中跟右旋紫草素相同的峰的峰面積；v為25ml；m樣表示供試品的質(zhì)量25.07mg；測定結(jié)果為：計(jì)算左旋紫草素含量為71.28％，右旋紫草素為28.72％，兩者的分離度較好。應(yīng)當(dāng)指出，以上具體實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。當(dāng)前第1頁12