本發(fā)明屬于免疫檢測領(lǐng)域，具體涉及一種微流控芯片熒光免疫快速檢測試劑盒及其制備和檢測方法。

背景技術(shù)：

近年來微流控芯片(microfluidicchips)技術(shù)發(fā)展迅速,在醫(yī)學、生命科學等領(lǐng)域的應(yīng)用得到不斷擴展。微流控芯片是指采用微細加工技術(shù),將微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及其他功能元件集成在數(shù)平方厘米的基片上,通過對微通道中的流體進行控制,以實現(xiàn)進樣、稀釋、混合、反應(yīng)、分離、檢測等多種功能的微全分析系統(tǒng),具有微型化、集成化、分析速度快、試劑消耗少等顯著優(yōu)點。

免疫標記技術(shù)是以抗原抗體特異性反應(yīng)為基本原理，采用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)標記抗體(或抗原)進行抗原-抗體反應(yīng)，通過對免疫復合物中的標記物的測定，達到對免疫反應(yīng)進行檢測的目的。

免疫標記技術(shù)按檢測反應(yīng)體系的物理狀態(tài)分為均相免疫反應(yīng)和非均相免疫反應(yīng)。

非均相免疫反應(yīng)是指將抗原或抗體固定在固相載體（微孔板或濾紙）表面,通過特異性免疫反應(yīng),將所需檢測的抗體或抗原結(jié)合在固相表面,繼經(jīng)清洗,即可實現(xiàn)抗原抗體復合物與游離的抗原、抗體之間的物理分離。通常使用的免疫層析法、酶聯(lián)免疫法、板式化學發(fā)光法均為非均相免疫分析方法。

“微流控芯片免疫分析抗體固定方法比較”（《中國醫(yī)藥生物技術(shù)》2015年第1期）、“微流控芯片免疫分析技術(shù)及其研究進展”（《檢驗醫(yī)學》2007第22卷第4期）等文獻報道利用微流控芯片通道壁為固相載體來包被抗體（或抗原）的方法，就是一種簡便的微流控芯片與微孔板免疫技術(shù)相結(jié)合的非均相免疫分析方法。

專利“雙層微流控芯片器件及其在免疫檢測中的用途”（cn102749433）使用了微流控技術(shù)與傳統(tǒng)的免疫標記技術(shù)（非均相）相結(jié)合。使用上下兩個微流控芯片，分別通入抗原和抗體，通過抽真空，使抗原和抗體分別富集在聚酯膜上并發(fā)生免疫反應(yīng)。該專利有以下不足：（1）所用的抗原和抗體試劑仍需分別保存在試劑瓶中（與傳統(tǒng)方法相同），試驗過程中通過抽真空驅(qū)動液體流動、混合、反應(yīng)，不能使反應(yīng)集成化；（2）所用固相載體—聚酯膜代替微孔板（或試紙），成本高；（3）聚酯膜孔徑影響抗原或抗體的富集；（3）非均相反應(yīng)是在固相載體的表面進行反應(yīng)，反應(yīng)不充分，靈敏度和重復性受到限制。

均相免疫反應(yīng)是指抗原和抗體在同一介質(zhì)（液態(tài)體系）中進行的免疫反應(yīng)。目前應(yīng)用較廣的磁微?；瘜W發(fā)光免疫方法就是均相免疫反應(yīng)，即將抗體（或抗原）偶聯(lián)在包裹了磁微粒的微球上，在反應(yīng)過程中將這種偶聯(lián)了抗體（或抗原）的磁微球懸浮在反應(yīng)液中，使得這種磁微球抗體（或抗原）與溶液中待測物質(zhì)充分接觸，使免疫反應(yīng)更加充分、完全。在外加磁場作用下，將免疫反應(yīng)形成的復合物與未結(jié)合的其它物質(zhì)分離。該方法由于采用了均相反應(yīng)體系，使反應(yīng)的精密度和重復性進一步提高。但該技術(shù)需要匹配大型檢測儀器，檢測費用大，耗時時間長，試劑和樣品用量大。

“基于磁珠技術(shù)的微流控生物芯片系統(tǒng)的研究”（《上海交通大學》2007年）是將免疫磁珠置于微流控通道中，由于受流體流動速度以及抗原和抗體只有一過性接觸的影響，抗原和抗體不能保證充分、徹底反應(yīng)。

微流控技術(shù)、磁微粒免疫技術(shù)與熒光免疫技術(shù)相結(jié)合技術(shù)研究目前還沒有更多的文獻報道。

因此，研制一種方便、快捷、高通量、靈敏度高、集成化高、適合工業(yè)化生產(chǎn)的微流控芯片均（液）相熒光免疫快速檢測試劑盒是目前亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種微流控芯片熒光免疫快速檢測試劑盒，該試劑盒以熒光物質(zhì)為標記物，以磁性微球為捕獲物，試劑用量少，集成化高，所有試劑均事先固化于芯片中；標記熒光微球和捕獲磁珠固化簡便、易復溶、易懸??；可在相對閉合的空間內(nèi)進行抗原抗體反應(yīng)，無交叉污染，不污染環(huán)境。具有高效率、高通量、高靈敏度、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一種微流控芯片熒光免疫快速檢測試劑盒,其特征在于：該試劑盒含有微流控芯片，所述微流控芯片包括一條或多條檢測單元，所述檢測單元位于微流控芯片的半徑軸上，以微流控芯片中心點發(fā)散排列，所述檢測單元自芯片中心點向邊緣依次排列有加樣槽、熒光探針槽、反應(yīng)檢測槽和廢液槽，以及相互連接的微通道；所述熒光探針槽底部固化有熒光探針，該熒光探針是聚苯乙烯熒光（flu）微球偶聯(lián)抗體（或抗原或二抗）的復合物；所述反應(yīng)檢測槽中固化有捕獲磁珠微球，該捕獲磁珠微球是聚苯乙烯磁珠微球偶聯(lián)抗體（或抗原或二抗）的復合物。

所述微流控芯片只有加樣槽通過加樣孔與外界相通，其余槽均是封閉的。

所述加樣槽、熒光探針槽、反應(yīng)檢測槽和廢液槽的容積相等或不相等，相鄰兩個槽的間距相等或不相等。

所述微流控芯片的驅(qū)動力為離心力。

所述的聚苯乙烯熒光微球的直徑為10～300nm，優(yōu)選50～200nm；聚苯乙烯熒光微球內(nèi)包裹熒光物質(zhì)，所述熒光物質(zhì)包括羅丹明、異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白、鑭系元素（釤sm、銪eu、釓gd、鋱tb等）、量子點等；所述聚苯乙烯磁珠微球的直為1～10um，優(yōu)選2um～5um，微球內(nèi)包裹超順磁四氧化三鐵微粒(mag)，微粒平均直徑10nm。

所述微流控芯片是由上下兩塊板（a板、b板）鍵合而成，所述微流控芯片的材料為石英、玻璃或pdms、pmma、ps、pc、coc、cop等高聚物，所述微流控芯片的形狀為圓形或外接圓的多邊形。

所述微流控芯片中心位置有一與離心機轉(zhuǎn)軸相匹配的固定孔，所述微流控芯片的厚度為4mm～10mm，直徑為50～200mm，優(yōu)選80～100mm，所述槽表面可以是圓形、橢圓形、水滴形或其他不規(guī)則形，槽的容積為5～200ul。

所述檢測試劑盒的檢測樣本為全血、血清、血漿、唾液、痰液、淚液、尿液或其他人體分泌物，以及上述液體的提取液或稀釋液或洗脫液；所述檢測試劑盒可同時進行1個樣品的多因子分別檢測，也可同時進行多個樣品的1個或多個因子的分別檢測。

一種微流控芯片熒光免疫快速檢測試劑盒的制備方法,該方法包括如下步驟。

（1）制備a板和b板。

a板和b板含有相互對應(yīng)的一條或多條檢測單元，a板上的檢測單元含有加樣孔、熒光探針槽上部分、反應(yīng)檢測槽上部分和廢液槽上部分，以及相互連接的通道，b板上的檢測單元含有與a板相對應(yīng)的的加樣槽、熒光探針槽下部分、反應(yīng)檢測槽下部分和廢液槽下部分。

（2）熒光探針聚苯乙烯熒光微球的制備。

取包裹熒光物質(zhì)的聚苯乙烯熒光微球經(jīng)洗滌、超聲、攪拌處理后,與抗體1（或抗原1或二抗）偶聯(lián)，加入bsa緩沖液對熒光微球作封閉處理，即得“抗體（或抗原或二抗）-熒光微球”[ab1（ag1）-flu]。

（3）捕獲抗體2（或抗原2或二抗）磁性微球的制備。

取聚苯乙烯磁性微球經(jīng)洗滌、超聲、攪拌處理后,與抗體2（或抗原2或二抗）混合，加入bsa緩沖液對微球作封閉處理,即得“捕獲抗體（或抗原或二抗）-磁性微球”[ab2(ag2)-mag]。

（4）將“抗體1（或抗原1或二抗）-熒光微球”與“捕獲抗體2（或抗原2或二抗）-磁性微球””各1～20ul分別加入到b板的熒光探針槽和反應(yīng)檢測槽中，37°c干燥固化。

（5）采用超聲鍵合機將芯片a、b板鍵合成一塊完整的芯片。

（6）用特殊粘合封口膜將樣品孔封閉，封鋁箔袋中，即得。

一種微流控芯片熒光免疫快速檢測試劑盒的檢測方法,該方法包括如下步驟。

(1)待測物質(zhì)溶液加入到加樣孔中，通過離心驅(qū)動待測溶液到達至熒光探針槽并溶解探針微球，待測物質(zhì)與相應(yīng)的抗體1(或抗原1或二抗)特異性結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光微球(flu-ab-ag)復合物。

（2）在離心驅(qū)動下，繼續(xù)將熒光探針槽中的復合物等溶液全部輸送至反應(yīng)檢測槽中，并溶解反應(yīng)檢測槽中捕獲抗體磁珠微球，溶液中的抗原-抗體-熒光微球1(flu-ab-ag)復合物與捕獲抗體2（或抗原2或二抗）-磁性微球發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，形成“熒光微球-抗體1-抗原-抗體2-磁珠微球”的雙抗體夾心磁性復合物(flu–ab1-ag–ab2-mag)或“熒光微球-抗原1-抗體-抗原2-磁珠微球”的雙抗原夾心磁性復合物(flu–ag1-ab-ag2-mag)，并懸浮在溶液中。

（3）在外加磁場的作用下，磁性復合物被吸附在反應(yīng)檢測槽的底部，在離心驅(qū)動下，將不含磁性微球的溶液輸送到廢液槽，磁性熒光復合物則留在檢測槽的底部。

（4）通過加樣孔加入清洗緩沖液，離心，清洗反應(yīng)檢測槽中的磁性熒光復合物，加入外磁場，離心去除清洗液，反復操作。

（5）通過熒光檢測儀檢測，以一定波長的光照射反應(yīng)檢測槽中的磁性熒光復合物，檢測熒光微球的發(fā)光強度，熒光強度與待測物濃度呈相關(guān)性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點。

（1）以熒光物質(zhì)為標記物，以磁性微球為捕獲物，試劑用量少，集成化高。

（2）所有試劑均事先固化于芯片中，省卻傳統(tǒng)試劑盒大量試管的使用，并省卻反復取樣操作。

（3）固化的聚苯乙烯熒光微球和聚苯乙烯磁珠微球當樣品溶液或清洗緩沖液流經(jīng)時易復溶并懸浮于液體中。

（4）樣品需樣量極少，單個指標僅需要10ul。

（5）檢測時間短，操作簡單。加入樣品后，放入檢測儀，5～10分鐘即可完成全部自動檢測。

（6）全封閉系統(tǒng)，可以進行最少1個樣本的檢測，不污染其余的檢測單元。

（7）可以進行多樣本或多因子同時檢測，實現(xiàn)檢測的高通量。

（8）均相反應(yīng)體系使檢測結(jié)果靈敏度高（10^-15mol/ml）、精密度高（cv＜5%）、重復性更高（cv＜5%）。

附圖說明

附圖1為微流控芯片熒光免疫試劑盒的檢測單元結(jié)構(gòu)示意圖。

圖中，1:加樣孔，2:加樣槽，3:熒光探針槽，4:反應(yīng)檢測槽，5：廢液槽，

6：微通道。

附圖2為微流控芯片熒光免疫試劑盒的微流控芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

附圖3為3樣本、4因子微流控芯片熒光免疫試劑盒的微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖。

附圖4為微流控芯片熒光免疫試劑盒的熒光免疫檢測原理示意圖。

附圖5為本發(fā)明與羅氏磁微粒電化學發(fā)光試劑盒一致性的比較結(jié)果圖。

具體實施方式

以下是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：n端腦鈉肽前體（nt-probnp）微流控芯片熒光免疫試劑盒試劑（多種樣本，1項指標檢測試劑盒）的制備及檢測。

1、制備a板和b板。

制備a板和b板，二者均含有相互對應(yīng)12條檢測單元，a板上的檢測單元含有加樣孔、熒光探針槽上部分、反應(yīng)檢測槽上部分和廢液槽上部分，以及相互連接的通道，b板上的檢測單元含有與a板相對應(yīng)的的加樣槽、熒光探針槽下部分、反應(yīng)檢測槽下部分和廢液槽下部分。

2、標記抗體熒光微球的制備。

取直徑為100nm的聚苯乙烯包裹量子點（qd，熒光探針）的熒光微球經(jīng)洗滌、超聲、攪拌處理后,與nt-probnp單克隆抗體1偶聯(lián)，偶聯(lián)反應(yīng)后形成“標記抗體1-熒光微球”,加入bsa緩沖液對熒光微球作封閉處理，得“熒光標記的nt-probnp單克隆抗體1微球”(qd-ab1)。

3、捕獲抗體磁性微球的制備。

取直徑為5um的聚苯乙烯磁性微球經(jīng)洗滌、超聲、攪拌處理后,與nt-probnp單克隆抗體2混合，偶聯(lián)反應(yīng)形成“捕獲抗體2-磁性微球”,加入bsa緩沖液對微球作封閉處理,得到用于捕獲的“nt-probnp單克隆抗體2-磁性微球”（ab2-mag）。

4、將“量子點標記的nt-probnp單克隆抗體1微球”與“nt-probnp單克隆抗體2-磁性微球”各10ul分別加到b板的熒光探針槽和反應(yīng)檢測槽中，37°c干燥固化1小時。

5、采用超聲鍵合機將芯片a、b板鍵合成一塊完整的芯片，芯片結(jié)構(gòu)如圖2；芯片直徑80mm，厚度6mm，每個芯片上有12組相同的檢測單元。

6、封口，用特殊粘合封口膜將樣品孔封閉，封鋁箔袋中，貯存。

7、檢測，取出包裝完好的微流控芯片試劑盒，撕開樣品孔的封口膜，放入自制的全自動液相微流控芯片熒光分析檢測儀的芯片室內(nèi)，機器自動采集全血樣品加入微流控芯片的加樣槽中，自動離心、清洗、檢測、打印結(jié)果，全部檢測10分鐘完成。

8、檢測結(jié)果與重復，見下表。

檢測結(jié)果與羅氏磁微粒電化學發(fā)光試劑盒一致性的比較結(jié)果。

對兩種方法的檢測結(jié)果進行線性回歸分析，建立線性回歸方程：y=a+bx。相關(guān)系數(shù)r值＞0.90。由結(jié)果可知，兩種方法的檢測結(jié)果有很好的相關(guān)性，見圖5。

實施例2：術(shù)前4項（乙肝表面抗原/丙肝抗體/人類免疫缺陷病毒抗體/梅毒螺旋體抗體）聯(lián)檢試劑盒（3份樣本、4項指標聯(lián)檢試劑盒）的制備及檢測。

1、標記抗體（或抗原）熒光微球的制備:取直徑為200nm的聚苯乙烯包裹銪金屬螯合物（eu，熒光探針）的熒光微球經(jīng)洗滌、超聲、攪拌處理后,分別與①乙肝表面抗體1②丙肝重組抗原1③人類免疫缺陷病毒重組抗原1④梅毒螺旋體重組抗原1進行偶聯(lián)，偶聯(lián)反應(yīng)后分別形成4種熒光微球標記物，備用。

2、捕獲抗體（或抗原）微球的制備:取直徑為3um的聚苯乙烯磁性微球經(jīng)洗滌、超聲、攪拌處理后,分別與①乙肝表面抗體2②丙肝重組抗原2③人類免疫缺陷病毒重組抗原2④梅毒螺旋體重組抗原2進行偶聯(lián)，偶聯(lián)反應(yīng)后形成4種捕獲抗體（或抗原）磁性微球，備用。

3、以聚甲基丙烯酸甲酯（pmma）為材料，芯片直徑100mm，a、b板均由3組結(jié)構(gòu)相同的微通道組成3組檢測單元，每組檢測單元又由4組結(jié)構(gòu)相同的微結(jié)構(gòu)組成，可以同時、分別進行3樣本的各4種指標的同時檢測，芯片結(jié)構(gòu)如圖3所示。

4、分別將4種標記抗體（或抗原）熒光微球固化于b板的每組相對應(yīng)的熒光探針槽底部，37°c干燥固化40分鐘。

5、分別將4種捕獲抗體（或抗原）磁珠微球固化于b板的每組相對應(yīng)的反應(yīng)檢測槽底部，37°c干燥固化40分鐘。

6、采用超聲鍵合機將芯片a、b板鍵合成一塊完整的芯片，芯片厚度5mm。

7、封口，用特殊粘合封口膜將各樣品孔封閉，封鋁箔袋中，貯存。

8、檢測，取出包裝完好的微流控芯片試劑盒，撕開樣品孔的封口膜，放入自制的全自動液相微流控芯片熒光分析檢測儀的芯片室內(nèi)，機器自動采集全血樣品加入微流控芯片的加樣孔中，自動離心、清洗、檢測、打印結(jié)果。全部檢測10分鐘完成。

結(jié)果比較:本試劑盒與雅培architect-i2000system微粒子化學發(fā)光試劑盒（乙肝表面抗原、丙肝抗體、人類免疫缺陷病毒抗體、梅毒螺旋體抗體4種）比較，見表2。

表2熒光免疫法和化學發(fā)光法檢測檢測結(jié)果比較。

由結(jié)果可知，hbsag、anti-tp、anti-hiv、anti-hcv比對結(jié)果為陽性符合率為100%，陰性符合率為100%，k=1。兩種方法檢測結(jié)果具有高度的一致性。