本發(fā)明涉及的是一種分子印跡傳感器的制備方法及快速檢測(cè)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)山奈素分子印跡傳感器的制備方法，具體是基于分子印跡特異性識(shí)別作用，用于檢測(cè)藥品、食品、生物樣品中的山奈素。

背景技術(shù)：

山柰素（學(xué)名為3,5,7-三羥基-4'-甲氧基黃酮）其分子式為c16h12o6，相對(duì)分子質(zhì)量為300.26，是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類(lèi)黃酮，具有多種藥理活性。山柰素是黃色結(jié)晶狀粉體，微溶于水，溶于熱乙醇，乙醚和堿。山奈素能夠激活melan-a黑素細(xì)胞酪氨酸酶的活性,促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖,使黑素合成量增加等作用，具有抗癌、抑制生育、抗癲癇、抗炎、抗氧化劑、解痙、抗?jié)?、利膽利尿劑、止咳。氧自由基毒性是誘發(fā)多種疾病的重要原因之一，缺氧、老化、動(dòng)脈硬化甚至腫瘤等疾病的發(fā)生均與氧自由基的毒性有關(guān)。山奈素具有很強(qiáng)的去除氧自由基能力。山柰素還具有很強(qiáng)的抗病毒作用

目前，檢測(cè)山柰素的方法主要有高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜，色譜法的準(zhǔn)確度受到一定限制、而且儀器比較貴需要專(zhuān)業(yè)人員操作，也限制了其應(yīng)用。另外，由于山柰素與其它黃酮類(lèi)分子結(jié)構(gòu)十分相近很難分開(kāi)，測(cè)定時(shí)互相干擾，準(zhǔn)確檢測(cè)山柰素很困難。因此，找到一種選擇性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便用于的檢測(cè)山柰素的方法很重要。

分子印跡技術(shù)是當(dāng)前開(kāi)發(fā)具有分子識(shí)別功能的高選擇性材料的主要方法之一，它是通過(guò)在模板分子周?chē)纬梢粋€(gè)高度交聯(lián)的剛性高分子，除去模板分子后在分子印跡聚合物的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中留下具有結(jié)合能力的識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)模板分子表現(xiàn)出高選擇識(shí)別性能的一種技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)以其構(gòu)效預(yù)定性和特異識(shí)別性越來(lái)越受到人們的關(guān)注，已經(jīng)成功用于固相萃取或微固相萃取，親和色譜或毛細(xì)管電泳及傳感器等領(lǐng)域。

依據(jù)此技術(shù)制備的分子印跡傳感器，應(yīng)用于藥物分析、環(huán)境保護(hù)及生命科學(xué)研究中起著十分重要的作用。將功能分子以適當(dāng)方式修飾到電極上，制備選擇性好、靈敏度高、有一定使用壽命可再生的電化學(xué)傳感器成為分析科學(xué)工作者努力探索的課題。但是傳統(tǒng)的印跡方法所制備的印跡膜厚度難以控制，高交聯(lián)度使得電子傳遞速度和響應(yīng)慢、檢測(cè)下限高而且再生和可逆性差，影響分子印跡技術(shù)在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用。因此，建立一種靈敏、快速、簡(jiǎn)便、特異性高、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì)使用的檢測(cè)方法，對(duì)研究人員、生產(chǎn)企業(yè)、質(zhì)控人員、進(jìn)出口商檢、政府管理部門(mén)等的迫切需要的，對(duì)食品、藥品、生物樣品中的山柰素含量準(zhǔn)確定量測(cè)定十分必要，對(duì)于山柰素生產(chǎn)和藥理研究也具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是將分子印跡與電化學(xué)傳感器相結(jié)合，提供了一種山柰素分子印跡傳感器的制備方法，主要是以山柰素為模板，在玻碳電極表面通過(guò)氧化石墨烯、納米金粒子的修飾，提高了傳感器的靈敏度，采用滴涂法制制備山柰素分子印跡傳感器。

儀器與試劑

chi660b電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），實(shí)驗(yàn)采用三電極體系：鉑絲電極為輔助電極，ag/agcl為參比電極（sce），玻碳電極（gce）為工作電極；kq-250e型超聲波清洗器（坤峰超聲儀器有限公司）。

氧化石墨烯；二甲基丙烯酸乙二醇酯、苯乙烯；1-乙烯基-3-丁基六氟磷酸鹽，偶氮二異丁腈，無(wú)水乙醇；山柰素；氯金酸；動(dòng)物膠；磷酸緩沖溶液；所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種用于檢測(cè)山奈素分子印跡傳感器的制備方法，特征在于，該方法具有以下工藝步驟：

（1）納米金石墨烯修飾液制備：在反應(yīng)器中，按如下組成質(zhì)量百分濃度加入，去離子水：90~95%，氯金酸：1.0~3.0%，氧化石墨烯：2.5~8%，各組分含量之和為百分之百，室溫下超聲15min，分散均勻，得到納米金石墨烯修飾液；

（2）納米金石墨烯修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后分別用二次蒸餾水超聲清洗，乙醇洗滌，吹干，在玻碳電極表面滴加18~20μl納米金石墨烯修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得納米金石墨烯修飾玻碳電極；

（3）山奈素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，按如下組成質(zhì)量百分濃度加入，乙醇：44~50%，二甲基丙烯酸乙二醇酯：10~14%，苯乙烯：5~8%，1-乙烯基-3-丁基六氟磷酸鹽：30~35%，偶氮二異丁腈：1.0~2.0%，山柰素：2.0~5.0%，各組分含量之和為百分之百，攪拌溶解，通惰性氣體除氧10min，無(wú)氧氛圍，55±2℃攪拌反應(yīng)28~30h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為10:1混合溶液浸泡12~15h，除去模板分子，干燥，即得山奈素分子印跡聚合物；

（4）山奈素分子印跡傳感器的制備方法：取適量的山奈素分子印跡聚合物分散于1%的動(dòng)物膠溶液中，制得22g/l的山奈素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液12~15μl滴加到步驟（2）制備的納米金石墨烯修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得山奈素分子印跡傳感器。

在步驟（1）中所述的氯金酸與氧化石墨烯的質(zhì)量比為1：2.5~3.0最優(yōu)。

在步驟（3）中所述的二甲基丙烯酸乙二醇酯與苯乙烯與1-乙烯基-3-丁基六氟磷酸鹽摩爾比為1：1：1最優(yōu)。

在步驟（3）中所述的惰性氣體為氖氣或氬氣。

在步驟（3）中所述的無(wú)氧氛圍為聚合反應(yīng)過(guò)程一直通入惰性氣體。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果是：

本發(fā)明將印跡技術(shù)、層層自組裝法和滴涂法相結(jié)合，在氧化石墨烯與納米金修飾玻碳電極表面成功地研制了一種具有特異選擇性的山奈素印跡電化學(xué)傳感器。通過(guò)與無(wú)氧化石墨烯納米金修飾的分子印跡電極那個(gè)的響應(yīng)進(jìn)行比較，本發(fā)明制備的山奈素分子印跡傳感器的響應(yīng)大大提高。該印跡傳感器對(duì)山奈素表現(xiàn)出較高的親和性和選擇性，響應(yīng)電流與山奈素的濃度在1.0×10^-7~2.0×10^-4mol/l范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為4.21×10^-8mol/l將本發(fā)明制備的山奈素分子印跡傳感器成功用于藥品、食品、生物樣品中山奈素的檢測(cè)中，回收率在95.32~104.26%之間，因此本發(fā)明制備的分子印跡傳感器可廣泛應(yīng)用于化工、生物醫(yī)藥、食品、環(huán)保檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

（1）納米金石墨烯修飾液制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：92ml，氯金酸：2g，氧化石墨烯：6g，室溫下超聲15min，分散均勻，得到納米金石墨烯修飾液；

（2）納米金石墨烯修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后分別用二次蒸餾水超聲清洗，乙醇洗滌，吹干，在玻碳電極表面滴加19μl納米金石墨烯修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得納米金石墨烯修飾玻碳電極；

（3）山奈素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，乙醇：60ml，二甲基丙烯酸乙二醇酯：12g，苯乙烯：6g，1-乙烯基-3-丁基六氟磷酸鹽：32g，偶氮二異丁腈：1g，山柰素：2g，攪拌溶解，通惰性氣體除氧10min，無(wú)氧氛圍，55±2℃攪拌反應(yīng)29h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為10:1混合溶液浸泡13h，除去模板分子，干燥，即得山奈素分子印跡聚合物；

（4）山奈素分子印跡傳感器的制備方法：取適量的山奈素分子印跡聚合物分散于1%的動(dòng)物膠溶液中，制得22g/l的山奈素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液13μl滴加到步驟（2）制備的納米金石墨烯修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得山奈素分子印跡傳感器。

實(shí)施例2

（1）納米金石墨烯修飾液制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：9.5ml，氯金酸：0.1g，氧化石墨烯：0.4g，室溫下超聲15min，分散均勻，得到納米金石墨烯修飾液；

（2）納米金石墨烯修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后分別用二次蒸餾水超聲清洗，乙醇洗滌，吹干，在玻碳電極表面滴加18μl納米金石墨烯修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得納米金石墨烯修飾玻碳電極；

（3）山奈素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，乙醇：6.3ml，二甲基丙烯酸乙二醇酯：1.0g，苯乙烯：0.5g，1-乙烯基-3-丁基六氟磷酸鹽：3.0g，偶氮二異丁腈：0.2g，山柰素：0.3g，攪拌溶解，通惰性氣體除氧10min，無(wú)氧氛圍，55±2℃攪拌反應(yīng)28h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為10:1混合溶液浸泡14h，除去模板分子，干燥，即得山奈素分子印跡聚合物；

（4）山奈素分子印跡傳感器的制備方法：取適量的山奈素分子印跡聚合物分散于1%的動(dòng)物膠溶液中，制得22g/l的山奈素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液14μl滴加到步驟（2）制備的納米金石墨烯修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得山奈素分子印跡傳感器。

實(shí)施例3

（1）納米金石墨烯修飾液制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：9ml，氯金酸：0.3g，氧化石墨烯：0.7g，室溫下超聲15min，分散均勻，得到納米金石墨烯修飾液；

（2）納米金石墨烯修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后分別用二次蒸餾水超聲清洗，乙醇洗滌，吹干，在玻碳電極表面滴加20μl納米金石墨烯修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得納米金石墨烯修飾玻碳電極；

（3）山奈素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，乙醇：5.6ml，二甲基丙烯酸乙二醇酯：1.3g，苯乙烯：0.7g，1-乙烯基-3-丁基六氟磷酸鹽：3.1g，偶氮二異丁腈：0.1g，山柰素：0.4g，攪拌溶解，通惰性氣體除氧10min，無(wú)氧氛圍，55±2℃攪拌反應(yīng)30h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為10:1混合溶液浸泡12h，除去模板分子，干燥，即得山奈素分子印跡聚合物；

（4）山奈素分子印跡傳感器的制備方法：取適量的山奈素分子印跡聚合物分散于1%的動(dòng)物膠溶液中，制得22g/l的山奈素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液12μl滴加到步驟（2）制備的納米金石墨烯修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得山奈素分子印跡傳感器。

實(shí)施例4

（1）納米金石墨烯修飾液制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：9.4ml，氯金酸：0.2g，氧化石墨烯：0.5g，室溫下超聲15min，分散均勻，得到納米金石墨烯修飾液；

（2）納米金石墨烯修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后分別用二次蒸餾水超聲清洗，乙醇洗滌，吹干，在玻碳電極表面滴加20μl納米金石墨烯修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得納米金石墨烯修飾玻碳電極；

（3）山奈素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，乙醇：5.7ml，二甲基丙烯酸乙二醇酯：1.1g，苯乙烯：0.5g，1-乙烯基-3-丁基六氟磷酸鹽：3.5g，偶氮二異丁腈：0.1g，山柰素：0.5g，攪拌溶解，通惰性氣體除氧10min，無(wú)氧氛圍，55±2℃攪拌反應(yīng)30h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為10:1混合溶液浸泡15h，除去模板分子，干燥，即得山奈素分子印跡聚合物；

（4）山奈素分子印跡傳感器的制備方法：取適量的山奈素分子印跡聚合物分散于1%的動(dòng)物膠溶液中，制得22g/l的山奈素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液15μl滴加到步驟（2）制備的納米金石墨烯修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得山奈素分子印跡傳感器。

實(shí)施例5

將上述實(shí)施例1~4所制備的山奈素分子印跡傳感器，用于山奈素的檢測(cè)，步驟如下：

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的山奈素標(biāo)準(zhǔn)溶液，底液為ph7.0的磷酸鹽緩沖溶液；

（2）工作曲線繪制：將ag/agcl為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，本發(fā)明制備的電極為工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接chi660b電化學(xué)工作站，在k3[fe(cn)6]溶液中，采用循環(huán)伏安法在-0.20~1.0v電位范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流記為i0，含有不同濃度的山奈素標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)電流即為ii，響應(yīng)電流降低的差值為△i=i0-ii，△i與山奈素標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度c之間呈線性關(guān)系，繪制△i~c工作曲線；

（3）山奈素的檢測(cè)：用待測(cè)樣品代替步驟（1）中的山奈素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟（2）的方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)響應(yīng)電流降低的差值△i和工作曲線，得到待測(cè)樣品中山奈素的含量；

所述k3[fe(cn)6]溶液的濃度為10mmol/l；

所述ph7.0的磷酸鹽緩沖溶液的濃度在80mmol/l。