本發(fā)明屬于檢測領(lǐng)域，具體涉及一種紅曲米中桔霉素毒素的檢測方法。

背景技術(shù)：

桔霉素主要是由青霉屬、曲霉屬、紅曲霉屬所產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物。桔霉素分布廣泛，主要存在于小麥、玉米、燕麥等谷物產(chǎn)品，以及蘋果、梨等水果的加工制品中。桔霉素具有良好的抑菌性，能抑制枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、灰色鏈霉菌等，在我國古代就被作為一種食品保藏劑涂抹在易腐爛的肉上。但由于桔霉素有很強(qiáng)的腎毒性而沒有受到廣泛應(yīng)用，而且其污染問題越來越受到人們的關(guān)注，并被國際生命科學(xué)院自然毒素檢測委員會歐洲分會列為必須檢測的毒素之一。

中國是世界上紅曲生產(chǎn)與應(yīng)用最早、最廣的國家，早在明朝就利用紅曲霉制作紅曲。而紅曲米主要以大米為原料，由紅曲霉發(fā)酵而來。由于紅曲米不但可以活血化瘀，健脾消食，更可以降低血糖膽固醇，早在《本草綱目》中就有大量記載，并始終受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。紅曲米中桔霉素毒素含量也成為我國紅曲產(chǎn)品出口檢驗(yàn)檢疫的主要內(nèi)容。國內(nèi)外基于不同的檢測方法對農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料中所含的桔霉素毒素含量設(shè)立了不同的限制標(biāo)準(zhǔn)，隨著hplc技術(shù)的不斷完善，檢測工作日趨簡單，而樣品的前處理成了技術(shù)關(guān)鍵和難點(diǎn)。目前對于桔霉素毒素分離純化方法較為復(fù)雜，普遍都是通過濃縮、過柱、萃取實(shí)現(xiàn)桔霉素毒素分離，最后通過tlc或者h(yuǎn)plc進(jìn)行定性定量檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對本領(lǐng)域存在的問題，本發(fā)明的目的是提出一種檢測紅曲米中桔霉素毒素的方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案為：

一種紅曲米中桔霉素毒素的檢測方法，包括步驟：

1)準(zhǔn)確稱取紅曲米樣品，磨碎后過20目篩；

2)將紅曲米樣品與甲醇混勻，反應(yīng)，提取出桔霉素毒素溶液；其中紅曲米樣品和甲醇的質(zhì)量體積比為1g：(2-10ml)；

3)步驟1)提取得到的桔霉素毒素溶液用高效液相色譜檢測。

其中，所述甲醇為色譜級甲醇、或是用色譜級甲醇配置的質(zhì)量濃度為70～90％的溶液。

優(yōu)選地，所述甲醇為色譜級甲醇,紅曲米樣品和甲醇的質(zhì)量體積比為1g：5ml。

其中，步驟2)中，紅曲米樣品與甲醇混勻后，60～70℃下保溫0.5～2小時，保溫期間間歇晃動或顛倒放置樣品的容器。

進(jìn)一步地，步驟2)中，紅曲米樣品與甲醇混勻后保溫，再離心分離，離心的速度為5000～10000rpm，離心時間為5-15min；取上清液即為桔霉素毒素溶液。

其中，步驟3)中，高效液相色譜的條件為：色譜柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流動相為乙腈/異丙醇/0.08mol/l的磷酸溶液，乙腈/異丙醇/磷酸的體積比為35：10：55。

其中，用熒光檢測器進(jìn)行檢測，檢測波長為331nm激發(fā)波長和500nm發(fā)射波長；流速為1.0ml/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量50μl。

其中，步驟3)收集與桔霉素毒素標(biāo)準(zhǔn)品保留時間一致的峰的洗脫液，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量測定，得到紅腐乳樣品中的桔霉素毒素含量，所述保留時間為前后0.05min。

所述外標(biāo)法具體包括，用桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶于色譜級甲醇，配制成0.01～10μg/g系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。采用高效液相色譜法對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液進(jìn)行高效液相色譜(hplc)定量檢測，并以桔霉素濃度作橫坐標(biāo)，以保留時間前后0.05min處的峰面積作縱坐標(biāo)，根據(jù)濃度與峰面積的關(guān)系進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于外標(biāo)法測定。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提出的方法，利用桔霉素易溶于乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑的理化性質(zhì)，提出了一種更為簡便的提取紅曲米中桔霉素毒素的方法，有利于推動紅曲以及紅曲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。經(jīng)試驗(yàn)證明，本發(fā)明的方法能夠快速提取紅曲米中桔霉素毒素，且效率高、耗時少、成本低、回收率高(0.1-1μg/g，回收率范圍在80-110％；1-100μg/g，回收率范圍在90-110％)，符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范-食品理化檢測標(biāo)準(zhǔn)(gb/t27404)，另外，此方法也極大簡便了紅曲及其相關(guān)產(chǎn)品中桔霉素毒素的提取，具有極高的推廣和應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為桔霉素毒素含量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜。

圖2為2μg/g桔霉素毒素標(biāo)準(zhǔn)品的hplc圖譜。

圖3為提取紅曲米樣品a中桔霉素毒素含量為21.34μg/g的hplc圖譜；

圖4為利用免疫親和柱提取紅曲米樣品a中桔霉素毒素含量為24.31μg/g的hplc圖譜。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)以以下實(shí)施例來說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中使用的手段，如無特別說明，均使用本領(lǐng)域常規(guī)的手段。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品是sigma公司(美國)的產(chǎn)品。色譜級的甲醇、乙腈、異丙醇和磷酸是fisher公司(美國)的產(chǎn)品。

桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法如下：

用1ml色譜級甲醇溶1mg固體桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品，配制成1mg/g桔霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用色譜級甲醇分別配制成2μg/g，1μg/g，0.5μg/g，0.1μg/g，0.05μg/g，0.01μg/g標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。采用高效液相色譜法對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液進(jìn)行hplc定量檢測，并以桔霉素濃度作橫坐標(biāo)，以保留時間前后0.05min處的峰面積作縱坐標(biāo)，根據(jù)濃度與峰面積的關(guān)系進(jìn)行線性回歸，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

高效液相色譜法條件：色譜柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流動相：乙腈/異丙醇/磷酸(磷酸濃度0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；熒光檢測器：安捷倫g1321；檢測波長：331nm和500nm；流速：1.0ml/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量：50μl。

繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝206.631416x+0.6943595(y為峰面積，x為桔霉素毒素含量)，r2＝0.99924。圖2為2μg/g桔霉素毒素標(biāo)準(zhǔn)品的hplc圖譜。

利用免疫親和柱提取紅曲米樣品中桔霉素毒素含量步驟如下：

取1g粉碎后的樣品，加入20ml70％甲醇，65℃水浴30min(每10min上下顛倒30s)，用定性濾紙過濾；取1ml濾液至50ml離心管，加入39mlpbs緩沖液，用微纖維濾紙過濾；取10ml上述濾液過柱，并用10ml0.1％吐溫-20-pbs洗柱，最后用1ml洗脫液(甲醇：0.1％磷酸＝7：3)過柱將桔霉素洗脫至劑量瓶中；進(jìn)行hplc定量檢測，以外標(biāo)法定量進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。紅曲米樣品重復(fù)3次，取平均值。

實(shí)施例1：

分別利用2種方法對紅曲米樣品a進(jìn)行桔霉素毒素提取，然后進(jìn)行hplc定量檢測。具體步驟如下：

1、利用本方法提取紅曲米中桔霉素毒素含量

準(zhǔn)確稱取1g已磨碎篩分(過20目篩)的紅曲米樣品a，置于50ml離心管內(nèi)，加入5ml色譜級甲醇，65℃水浴60min，期間每10min上下顛倒30s，8000rpm離心10min之后，靜置取上清至2ml微量進(jìn)樣瓶中，采用高效液相色譜法(hplc)對樣品液進(jìn)行高效液相色譜分析，以外標(biāo)法定量進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。紅曲米樣品a重復(fù)3次，取平均值。

2、利用免疫親和柱作為對照提取紅曲米中桔霉素毒素含量

準(zhǔn)確稱取1g已充分混勻的紅曲米樣品a，置于50ml離心管內(nèi)，加入20ml70％甲醇，65℃水浴30min(每10min上下顛倒30s)，用定性濾紙過濾。取1ml濾液至50ml離心管，加入39mlpbs緩沖液，用微纖維濾紙過濾。取10ml上述濾液過柱，并用10ml0.1％吐溫-20-pbs洗柱，最后用1ml洗脫液(甲醇：0.1％磷酸＝7：3)過柱將桔霉素洗脫至劑量瓶中。采用高效液相色譜法(hplc)對樣品液進(jìn)行高效液相色譜分析，以外標(biāo)法定量進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。紅曲米樣品a重復(fù)3次，取平均值。

高效液相色譜法條件：色譜柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流動相：乙腈/異丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；熒光檢測器：安捷倫g1321；檢測波長：331nm和500nm；流速：1.0g/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量：50μl。

收集與桔霉素毒素標(biāo)準(zhǔn)品保留時間(保留時間約0.05min)一致的峰的洗脫液，得到紅曲米樣品a中的桔霉素毒素含量。參見圖3和圖4。

檢測結(jié)果如表1所示。其中，處理樣品1-3為利用本方法提取1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量；處理對照1-3為利用免疫親和柱提取1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量；桔霉素毒素含量(μg/g)為1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量的實(shí)際檢測值；平均值(μg/g)為1g紅曲米樣品中3次重復(fù)檢測桔霉素毒素含量的平均值；回收率(％)為樣品檢測平均值(μg/g)/對照檢測平均值(μg/g)*100％。

利用本方法提取1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量平均值為22.04μg/g；利用免疫親和柱提取1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量平均值為24.12μg/g，回收率為91.40％(22.04μg/g/24.12μg/g)。以上回收率均符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范-食品理化檢測標(biāo)準(zhǔn)(gb/t27404)(0.1-1μg/g，回收率范圍在80-110％；1-100μg/g，回收率范圍在90-110％)，說明本發(fā)明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且該方法更加簡便。

表1紅曲米樣品a中桔霉素毒素含量檢測

實(shí)施例2、紅曲米中桔霉素毒素的檢測

分別利用2種方法對紅曲米樣品b進(jìn)行桔霉素毒素提取，然后進(jìn)行hplc定量檢測。具體步驟如下：

1、利用本方法提取紅曲米中桔霉素毒素含量

準(zhǔn)確稱取1g已充分混勻的紅曲米樣品b，置于50ml離心管內(nèi)，加入5ml色譜級甲醇，65℃水浴60min，期間每10min上下顛倒30s，8000rpm離心10min之后，靜置取上清至2ml微量進(jìn)樣瓶中，采用高效液相色譜法(hplc)對樣品液進(jìn)行高效液相色譜分析，以外標(biāo)法定量進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。紅曲米樣品b重復(fù)3次，取平均值。

2、利用免疫親和柱作為對照提取紅曲米中桔霉素毒素含量

準(zhǔn)確稱取1g已充分混勻的紅曲米樣品b，置于50ml離心管內(nèi)，加入20ml70％甲醇，65℃水浴30min(每10min上下顛倒30s)，用定性濾紙過濾。取1ml濾液至50ml離心管，加入39mlpbs緩沖液，用微纖維濾紙過濾。取10ml上述濾液過柱，并用10ml0.1％吐溫-20-pbs洗柱，最后用1ml洗脫液(甲醇：0.1％磷酸＝7：3)過柱將桔霉素洗脫至劑量瓶中。采用高效液相色譜法(hplc)對樣品液進(jìn)行高效液相色譜分析，以外標(biāo)法定量進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。紅曲米樣品b重復(fù)3次，取平均值。

高效液相色譜法條件：色譜柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流動相：乙腈/異丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；熒光檢測器：安捷倫g1321；檢測波長：331nm和500nm；流速：1.0g/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量：50μl。

收集與桔霉素毒素標(biāo)準(zhǔn)品保留時間(保留時間約0.05min)一致的峰的洗脫液，得到紅曲米樣品b中的桔霉素毒素含量。

檢測結(jié)果如表2所示。其中，處理樣品1-3為利用本方法提取1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量；處理對照1-3為利用免疫親和柱提取1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量；桔霉素毒素含量(μg/g)為1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量的實(shí)際檢測值；平均值(μg/g)為1g紅曲米樣品中3次重復(fù)檢測桔霉素毒素含量的平均值；回收率(％)為樣品檢測平均值(μg/g)/對照檢測平均值(μg/g)*100％。

利用本方法提取1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量平均值為0.40μg/g；利用免疫親和柱提取1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量平均值為0.41μg/g，回收率為98.46％(0.40μg/g/0.41μg/g)。以上回收率均符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范-食品理化檢測標(biāo)準(zhǔn)(gb/t27404)(0.1-1μg/g，回收率范圍在80-110％；1-100μg/g，回收率范圍在90-110％)，說明本發(fā)明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且該方法更加簡便。

表2紅曲米樣品b中桔霉素毒素含量檢測

實(shí)施例3、紅曲米中桔霉素毒素的檢測

分別利用2種方法對紅曲米樣品c進(jìn)行桔霉素毒素提取，然后進(jìn)行hplc定量檢測。具體步驟如下：

1、利用本方法提取紅曲米中桔霉素毒素含量

準(zhǔn)確稱取1g已充分混勻的紅曲米樣品c，置于50ml離心管內(nèi)，加入5ml色譜級甲醇，65℃水浴60min，期間每10min上下顛倒30s，8000rpm離心10min之后，靜置取上清至2ml微量進(jìn)樣瓶中，采用高效液相色譜法(hplc)對樣品液進(jìn)行高效液相色譜分析，以外標(biāo)法定量進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。紅曲米樣品c重復(fù)3次，取平均值。

2、利用免疫親和柱作為對照提取紅曲米中桔霉素毒素含量

準(zhǔn)確稱取1g已充分混勻的紅曲米樣品c，置于50ml離心管內(nèi)，加入20ml70％甲醇，65℃水浴30min(每10min上下顛倒30s)，用定性濾紙過濾。取1ml濾液至50ml離心管，加入39mlpbs緩沖液，用微纖維濾紙過濾。取10ml上述濾液過柱，并用10ml0.1％吐溫-20-pbs洗柱，最后用1ml洗脫液(甲醇：0.1％磷酸＝7：3)過柱將桔霉素洗脫至劑量瓶中。采用高效液相色譜法(hplc)對樣品液進(jìn)行高效液相色譜分析，以外標(biāo)法定量進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。紅曲米樣品c重復(fù)3次，取平均值。

高效液相色譜法條件：色譜柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流動相：乙腈/異丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；熒光檢測器：安捷倫g1321；檢測波長：331nm和500nm；流速：1.0g/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量：50μl。

收集與桔霉素毒素標(biāo)準(zhǔn)品保留時間(保留時間約0.05min)一致的峰的洗脫液，得到紅曲米樣品c中的桔霉素毒素含量。

檢測結(jié)果如表3所示。其中，處理樣品1-3為利用本方法提取1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量；處理對照1-3為利用免疫親和柱提取1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量；桔霉素毒素含量(μg/g)為1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量的實(shí)際檢測值；平均值(μg/g)為1g紅曲米樣品中3次重復(fù)檢測桔霉素毒素含量的平均值；回收率(％)為樣品檢測平均值(μg/g)/對照檢測平均值(μg/g)*100％。

利用本方法提取1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量平均值為5.53μg/g；利用免疫親和柱提取1g紅曲米樣品中桔霉素毒素含量平均值為5.35μg/g，回收率為103.35％(5.53μg/g/5.35μg/g)。以上回收率均符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范-食品理化檢測標(biāo)準(zhǔn)(gb/t27404)(0.1-1μg/g，回收率范圍在80-110％；1-100μg/g，回收率范圍在90-110％)，說明本發(fā)明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且該方法更加簡便。

表3紅曲米樣品c中桔霉素毒素含量檢測

以上的實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變型和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。