本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及細(xì)胞檢測技術(shù)，具體涉及一種基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。其中，間期又分為三期、即dna合成前期（g1期）、dna合成期（s期）與dna合成后期（g2期）。分裂期（m期）分為前期、中期、后期和末期。

癌癥是一種細(xì)胞周期疾病，細(xì)胞周期是抗腫瘤藥物分類的主要依據(jù)。細(xì)胞周期理論為研制抗腫瘤藥物提供新的靶點(diǎn)。精準(zhǔn)的抗腫瘤藥物可以直接針對不同周期的癌細(xì)胞，直接滅殺，從而達(dá)到治療的目的。但是能夠精確殺滅癌細(xì)胞的前提是能夠?qū)?yīng)細(xì)胞的周期進(jìn)行檢測。因此，利用相關(guān)技術(shù)對不同周期的癌細(xì)胞進(jìn)行分析測量對癌癥的治療診斷具有重要意義。

目前較為常用的細(xì)胞周期檢測方法主要是流式細(xì)胞術(shù)，其方法是在對細(xì)胞染色的基礎(chǔ)上，通過對單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的染色體含量進(jìn)行檢測，從而判斷細(xì)胞所處的周期，但是該方法的檢測流程較為復(fù)雜，檢測速度慢，并需要依賴于細(xì)胞染色，對細(xì)胞有損傷，且無法準(zhǔn)確分辨g2期和m期的細(xì)胞，也無法對群體細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法，利用光散射特性簡單、快速地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期的檢測，以解決現(xiàn)有的細(xì)胞周期檢測技術(shù)中需要染色損傷細(xì)胞、流程復(fù)雜、檢測速度慢等問題。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：

一種基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法，采用各不同細(xì)胞周期的細(xì)胞樣品分別制成具有指定濃度的對應(yīng)各不同細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液，利用廣角光散射儀分別進(jìn)行散射光強(qiáng)度測量，得到各個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線；然后針對待測細(xì)胞樣本，制成具有同樣指定濃度的待測細(xì)胞懸液，在相同測量條件下利用廣角光散射儀進(jìn)行散射光強(qiáng)度測量，得到待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線，并分別與各個(gè)不同細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線進(jìn)行對比，確定與待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線相匹配的一個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞周期判定為待測細(xì)胞樣本的細(xì)胞周期。

上述基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法中，具體而言，具體包括下述步驟：

a）預(yù)先確定檢測所用細(xì)胞懸液的指定濃度；

b）采用g1期、s期、g2期和m期的細(xì)胞樣品，分別制成具有指定濃度的對應(yīng)g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液并裝入玻璃試管內(nèi)，分別搖勻后，在37℃溫度條件下，利用廣角光散射儀分別測量每個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度，根據(jù)測量結(jié)果，得到g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線；

c）針對待測細(xì)胞樣本，制成具有同樣指定濃度的待測細(xì)胞懸液，并裝入玻璃試管內(nèi)，分別搖勻后，在37℃溫度條件下，利用廣角光散射儀測量待測細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度，根據(jù)測量結(jié)果，得到待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線；

d）將待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線分別與各個(gè)不同細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線進(jìn)行對比，確定與待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線相匹配的一個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞周期判定為待測細(xì)胞樣本的細(xì)胞周期。

上述基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法中，作為優(yōu)選方案，所述步驟a）具體為，利用任一細(xì)胞周期的細(xì)胞樣品分別制成10⁶個(gè)細(xì)胞/ml、2×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml、10⁵個(gè)細(xì)胞/ml和5×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml這四種濃度的細(xì)胞懸液并裝入玻璃試管內(nèi)，分別搖勻后，利用廣角光散射儀分別測量該四種濃度的細(xì)胞懸液在90°散射角上的散射光強(qiáng)度，根據(jù)測量結(jié)果，選擇散射光強(qiáng)度最大的一種細(xì)胞懸液的濃度作為檢測所用細(xì)胞懸液的指定濃度。

上述基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法中，作為優(yōu)選方案，所述步驟b）具體為：

b1）采用g1期、s期、g2期和m期的細(xì)胞樣品，分別制成具有指定濃度的對應(yīng)g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液，并裝入玻璃試管內(nèi)；

b2）分別將裝入玻璃試管內(nèi)的g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液搖勻后，在37℃溫度條件下，利用廣角光散射儀分別測量每個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度，得到各不同細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)，并加以記錄；

b3）重復(fù)執(zhí)行步驟b2）5~10次，針對每個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在每一個(gè)散射角度上各次測量所得的散射光強(qiáng)度值，剔除其中離均差率的絕對值大于10%的散射光強(qiáng)度值，再將該散射角度上其它次測量所得的散射光強(qiáng)度值求平均，得到相應(yīng)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在相應(yīng)射角度上的散射光強(qiáng)度平均值，從而分別得到相應(yīng)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度平均值，并進(jìn)行曲線數(shù)據(jù)擬合，再對擬合所得的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑濾波處理，得到相應(yīng)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線；由此分別得到g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線。

上述基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法中，作為優(yōu)選方案，所述步驟c）具體為：

c1）采用待測細(xì)胞樣本，制成具有指定濃度的待測細(xì)胞懸液，并裝入玻璃試管內(nèi)；

c2）將裝入玻璃試管內(nèi)的待測細(xì)胞懸液搖勻后，在37℃溫度條件下，利用廣角光散射儀測量待測細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度，得到待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)，并加以記錄；

c3）重復(fù)執(zhí)行步驟c2）5~10次，針對待測細(xì)胞懸液在每一個(gè)散射角度上各次測量所得的散射光強(qiáng)度值，剔除其中離均差率的絕對值大于10%的散射光強(qiáng)度值，再將該散射角度上其它次測量所得的散射光強(qiáng)度值求平均，得到待測細(xì)胞懸液在相應(yīng)射角度上的散射光強(qiáng)度平均值，從而分別得到待測細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度平均值，并進(jìn)行曲線數(shù)據(jù)擬合，再對擬合所得的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑濾波處理，得到待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線。

上述基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法中，作為優(yōu)選方案，所述步驟d）具體為：

d1）從0°~180°散射角范圍中，劃分出前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間，其中，前向散射角區(qū)間為0°~20°散射角范圍，側(cè)向散射角區(qū)間為80°~100°散射角范圍，后向散射角區(qū)間為160°~180°散射角范圍；

d2）根據(jù)g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線，分別統(tǒng)計(jì)得到g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖；

d3）根據(jù)待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線，統(tǒng)計(jì)得到待測細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖；

d4）將待測細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖分別與g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖進(jìn)行對比，確定與待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)分布直方圖相匹配的一個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞周期判定為待測細(xì)胞樣本的細(xì)胞周期。

上述基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法中，具體而言，所述步驟d4）中，g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖的匹配依據(jù)為：

m期的樣品細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)最強(qiáng)；

g1期的樣品細(xì)胞懸液在側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)僅次于m期的樣品細(xì)胞懸液，而在前向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)僅強(qiáng)于g2期的樣品細(xì)胞懸液；

s期的樣品細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)僅次于m期的樣品細(xì)胞懸液，在側(cè)向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)僅強(qiáng)于g2期的樣品細(xì)胞懸液，在后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)最弱；

g2期的樣品細(xì)胞懸液除了后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)僅強(qiáng)于s期的樣品細(xì)胞懸液，在前向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)均最弱。

上述基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法中，作為優(yōu)選方案，利用廣角光散射儀進(jìn)行散射光強(qiáng)度測量時(shí)，采用激光器作為光源。

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法，其操作流程簡單，測量速度快，也不需要對細(xì)胞進(jìn)行染色處理，對細(xì)胞沒有損傷，根據(jù)不同周期細(xì)胞在不同角度的光散射特性差異可以很方便直觀的判斷出待測細(xì)胞處于哪個(gè)周期，并且測量過后的細(xì)胞樣品還可以重復(fù)利用，有利于在生物醫(yī)學(xué)研究過程中推廣應(yīng)用，也可用于在體檢測。

2、本發(fā)明基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法，能夠借助散射光強(qiáng)度分布曲線真實(shí)反映生物細(xì)胞在細(xì)胞周期過程中各個(gè)階段g1期、s期、g2期和m期的變化，細(xì)胞的生長、增殖都和細(xì)胞周期是密不可分的，在細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相中由于細(xì)胞核折射率、大小會(huì)發(fā)生變化以及細(xì)胞質(zhì)大小和折射率的改變是造成細(xì)胞光散射曲線差異的原因，故可將這種差異作為散射光強(qiáng)法測定細(xì)胞周期的主要參數(shù)，從而能夠準(zhǔn)確地對生物細(xì)胞的生長行為和周期進(jìn)行判斷和描述。

3、由于光散射特性曲線可以反應(yīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化以及折射率變化，而不同種類的生物細(xì)胞、病毒細(xì)胞不僅形態(tài)結(jié)構(gòu)上有差異，細(xì)胞折射率也存在差異，因此本發(fā)明基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法還能夠用于多種不同種類的生物細(xì)胞、病毒細(xì)胞的細(xì)胞周期對比分析和相關(guān)研究，具有很好的技術(shù)應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法的流程圖。

圖2為實(shí)施例中g(shù)1期、s期、g2期和m期四個(gè)不同細(xì)胞周期的細(xì)胞懸液散射光強(qiáng)度分布曲線圖。

圖3為實(shí)施例中待測hela細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線與g1期、s期、g2期和m期的hela樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線的對比圖。

圖4為實(shí)施例中g(shù)1期、s期、g2期和m期的hela樣品細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布對比直方圖。

圖5為實(shí)施例中待測hela細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間與g1期、s期、g2期和m期的hela樣品細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)分布對比直方圖。

具體實(shí)施方式

針對如何簡單、快速地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期檢測的問題，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)胞周期的生物細(xì)胞，其光散射特性有所不同。生物細(xì)胞的光散射主要是由光在細(xì)胞及細(xì)胞核邊緣的衍射、細(xì)胞質(zhì)、以及細(xì)胞核及周圍介質(zhì)的不同折射率的折射、不同光學(xué)邊界的反射、細(xì)胞內(nèi)的吸收因素造成的。細(xì)胞在不同細(xì)胞周期時(shí)相時(shí)這些光散射特性參數(shù)都會(huì)有所不同，因此利用這種不同造成的散射光信號差異就能判斷細(xì)胞處于哪一細(xì)胞周期。

基于此，本發(fā)明提供了一種基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法，其實(shí)施方式是，采用各不同細(xì)胞周期的細(xì)胞樣品分別制成具有指定濃度的對應(yīng)各不同細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液，利用廣角光散射儀分別進(jìn)行散射光強(qiáng)度測量，得到各個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線；然后針對待測細(xì)胞樣本，制成具有同樣指定濃度的待測細(xì)胞懸液，在相同測量條件下利用廣角光散射儀進(jìn)行散射光強(qiáng)度測量，得到待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線，并分別與各個(gè)不同細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線進(jìn)行對比，確定與待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線相匹配的一個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞周期判定為待測細(xì)胞樣本的細(xì)胞周期。

具體而言，本發(fā)明基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法流程如圖1所示，包括下述步驟：

a）預(yù)先確定檢測所用細(xì)胞懸液的指定濃度。

預(yù)先確定檢測所用細(xì)胞懸液的指定濃度，目的是為了更有利于確保細(xì)胞周期檢測的準(zhǔn)確性。具體實(shí)施操作時(shí)，該步驟可以采用如下的方式來實(shí)現(xiàn)：利用任一細(xì)胞周期的細(xì)胞樣品分別制成10⁶個(gè)細(xì)胞/ml、2×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml、10⁵個(gè)細(xì)胞/ml和5×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml這四種濃度的細(xì)胞懸液并裝入玻璃試管內(nèi)，分別搖勻后，利用廣角光散射儀分別測量該四種濃度的細(xì)胞懸液在90°散射角上的散射光強(qiáng)度，根據(jù)測量結(jié)果，選擇散射光強(qiáng)度最大的一種細(xì)胞懸液的濃度作為檢測所用細(xì)胞懸液的指定濃度。

制作細(xì)胞懸液時(shí)，每一種細(xì)胞懸液可以采用pbs緩沖液（phosphatebuffersaline，磷酸緩沖鹽溶液）作為試劑制作10ml，制作方式是用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)10倍濃度個(gè)細(xì)胞，然后再用pbs緩沖液稀釋到10ml即可；例如，以10⁶個(gè)細(xì)胞/ml濃度的細(xì)胞懸液為例，一共需要10⁷個(gè)細(xì)胞，所以用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算10⁷個(gè)細(xì)胞，然后再用pbs緩沖液稀釋到10ml，即得到10⁶個(gè)細(xì)胞/ml濃度的細(xì)胞懸液；其他濃度的細(xì)胞都是先獲取所需的總細(xì)胞個(gè)數(shù)，然后再用pbs緩沖液稀釋到10ml即可。選擇10⁶個(gè)細(xì)胞/ml、2×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml、10⁵個(gè)細(xì)胞/ml和5×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml這四種濃度的細(xì)胞懸液，是因?yàn)檫@四個(gè)濃度范圍的細(xì)胞懸液，復(fù)散射不會(huì)對散射光強(qiáng)造成影響，有利于確?；诠馍⑸錅y量確定細(xì)胞周期的重復(fù)性和穩(wěn)定性。而經(jīng)90°散射角上的散射光強(qiáng)度測量選擇散射光強(qiáng)度最大的一種細(xì)胞懸液的濃度作為檢測所用細(xì)胞懸液的指定濃度，目的是更好的保證后續(xù)測量所用細(xì)胞懸液的指定濃度能夠獲得更加明顯的光散射特性參數(shù)，更有利于確保細(xì)胞周期檢測的準(zhǔn)確性。

b）采用g1期、s期、g2期和m期的細(xì)胞樣品，分別制成具有指定濃度的對應(yīng)g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液并裝入玻璃試管內(nèi)，分別搖勻后，在37℃溫度條件下，利用廣角光散射儀分別測量每個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度，根據(jù)測量結(jié)果，得到g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線。

該步驟中，利用廣角光散射儀具體執(zhí)行散射光強(qiáng)度測量時(shí)，可以優(yōu)選采用激光器作為光源，其優(yōu)點(diǎn)是光束質(zhì)量好，具有非常好的單色性、方向性和穩(wěn)定性。測量操作中，g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線的測量，可以分別通過一次測量而得到。但為了更好的確保所得g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線的可參考性，可以采用優(yōu)化的步驟b）測量方案，具體為：

b1）采用g1期、s期、g2期和m期的細(xì)胞樣品，分別制成具有指定濃度的對應(yīng)g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液，并裝入玻璃試管內(nèi)；

b2）分別將裝入玻璃試管內(nèi)的g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液搖勻后，在37℃溫度條件下，利用廣角光散射儀分別測量每個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度，得到各不同細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)，并加以記錄；

b3）重復(fù)執(zhí)行步驟b2）5~10次，針對每個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在每一個(gè)散射角度上各次測量所得的散射光強(qiáng)度值，剔除其中離均差率的絕對值大于10%的散射光強(qiáng)度值，再將該散射角度上其它次測量所得的散射光強(qiáng)度值求平均，得到相應(yīng)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在相應(yīng)射角度上的散射光強(qiáng)度平均值，從而分別得到相應(yīng)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度平均值，并進(jìn)行曲線數(shù)據(jù)擬合，再對擬合所得的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑濾波處理，得到相應(yīng)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線；由此分別得到g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線。

在步驟b）中，為了獲取準(zhǔn)確的散射光強(qiáng)信息，首先要確保細(xì)胞樣品處于自然生長狀態(tài)，采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察細(xì)胞的形態(tài)，獲取處于細(xì)胞周期不同時(shí)相（g1期、s期、g2期和m期）的細(xì)胞，將其作為細(xì)胞周期標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞樣品。而針對每個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液，分別都進(jìn)行5~10次的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)測量，并進(jìn)行平均擬合和平滑濾波處理，在平均擬合過程中剔除了離均差率（離均差率=(個(gè)體值-全體均值)/全體均值）的絕對值大于10%的散射光強(qiáng)度值再求平均，目的是為了消除測量中各種原因引起的散射光強(qiáng)畸變誤差，確保所得的g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線具有更好的可參考性。

c）針對待測細(xì)胞樣本，制成具有同樣指定濃度的待測細(xì)胞懸液，并裝入玻璃試管內(nèi)，分別搖勻后，在37℃溫度條件下，利用廣角光散射儀測量待測細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度，根據(jù)測量結(jié)果，得到待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線。

該步驟中該步驟中，利用廣角光散射儀具體執(zhí)行散射光強(qiáng)度測量時(shí)，也優(yōu)選采用激光器作為光源。測量操作中，待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線的測量，也可以僅通過一次測量而得到。但為了更好的確保所得待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線的測量準(zhǔn)確性，可以采用優(yōu)化的步驟c）測量方案，具體為：

c1）采用待測細(xì)胞樣本，制成具有指定濃度的待測細(xì)胞懸液，并裝入玻璃試管內(nèi)；

c2）將裝入玻璃試管內(nèi)的待測細(xì)胞懸液搖勻后，在37℃溫度條件下，利用廣角光散射儀測量待測細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度，得到待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)，并加以記錄；

c3）重復(fù)執(zhí)行步驟c2）5~10次，針對待測細(xì)胞懸液在每一個(gè)散射角度上各次測量所得的散射光強(qiáng)度值，剔除其中離均差率的絕對值大于10%的散射光強(qiáng)度值，再將該散射角度上其它次測量所得的散射光強(qiáng)度值求平均，得到待測細(xì)胞懸液在相應(yīng)射角度上的散射光強(qiáng)度平均值，從而分別得到待測細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度平均值，并進(jìn)行曲線數(shù)據(jù)擬合，再對擬合所得的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑濾波處理，得到待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線。

針對待測細(xì)胞懸液進(jìn)行5~10次的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)測量，并進(jìn)行平均擬合和平滑濾波處理，在平均擬合過程中剔除了離均差率的絕對值大于10%的散射光強(qiáng)度值再求平均，目的是為了消除測量中各種原因引起的散射光強(qiáng)畸變誤差，更好的確保所得的待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線的測量準(zhǔn)確性。

d）將待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線分別與各個(gè)不同細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線進(jìn)行對比，確定與待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線相匹配的一個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞周期判定為待測細(xì)胞樣本的細(xì)胞周期。

在步驟d）中，待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線分別與各個(gè)不同細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線之間的對比匹配方式，可以采用對比誤差分析的方式，找出待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線分別與各個(gè)不同細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線之間對比誤差最小的一個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液，判定為與待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線相匹配。為了進(jìn)一步的減小對比匹配的數(shù)據(jù)運(yùn)算量，可以采用如下的優(yōu)選方案：

d1）從0°~180°散射角范圍中，劃分出前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間，其中，前向散射角區(qū)間為0°~20°散射角范圍，側(cè)向散射角區(qū)間為80°~100°散射角范圍，后向散射角區(qū)間為160°~180°散射角范圍；

d2）根據(jù)g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線，分別統(tǒng)計(jì)得到g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖；

d3）根據(jù)待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線，統(tǒng)計(jì)得到待測細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖；

d4）將待測細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖分別與g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖進(jìn)行對比，確定與待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)分布直方圖相匹配的一個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞周期判定為待測細(xì)胞樣本的細(xì)胞周期。

借助細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線在前向散射角區(qū)間（0°~20°散射角范圍）、側(cè)向散射角區(qū)間（80°~100°散射角范圍）和后向散射角區(qū)間（160°~180°散射角范圍）的散射光強(qiáng)分布情況，能夠很好的體現(xiàn)其各自的散射光強(qiáng)度分布特性，因此能夠有效的用以進(jìn)行細(xì)胞周期的對比匹配和識(shí)別；并且這樣的匹配對比方式，只需要將待測細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖分別與g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖進(jìn)行對比匹配運(yùn)算，有助于在保證細(xì)胞周期檢測準(zhǔn)確性的前提下減少對比匹配的數(shù)據(jù)運(yùn)算量。在具體求取前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖時(shí)，可以通過分別統(tǒng)計(jì)計(jì)算前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間、后向散射角區(qū)間各自的散射角范圍內(nèi)每間隔5°測量的5個(gè)散射光強(qiáng)度值的總和或平均值來得到。

通過上述流程可以看到，本發(fā)明基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法，其操作流程簡單，測量速度快，也不需要對細(xì)胞進(jìn)行染色處理，對細(xì)胞沒有損傷，根據(jù)不同周期細(xì)胞在不同角度的光散射特性差異可以很方便直觀的判斷出待測細(xì)胞處于哪個(gè)周期，并且測量過后的細(xì)胞樣品還可以重復(fù)利用，有利于在生物醫(yī)學(xué)研究過程中推廣應(yīng)用，也可用于在體檢測。

下面用實(shí)施方式來說明本發(fā)明方法。應(yīng)該理解的是這些實(shí)施方式僅僅是用于進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)施方案，而不是用于限制本發(fā)明。

實(shí)施例：

采用本發(fā)明的方法，對hela細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，具體包括下述步驟：

1）預(yù)先確定檢測所用細(xì)胞懸液的指定濃度。預(yù)先獲取各不同細(xì)胞周期的hela細(xì)胞樣品，利用任一細(xì)胞周期的hela細(xì)胞樣品分別制成10⁶個(gè)細(xì)胞/ml、2×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml、10⁵個(gè)細(xì)胞/ml和5×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml這四種濃度的細(xì)胞懸液并裝入玻璃試管內(nèi)，分別搖勻后，利用廣角光散射儀分別測量該四種濃度的細(xì)胞懸液在90°散射角上的散射光強(qiáng)度，根據(jù)測量結(jié)果，選擇散射光強(qiáng)度最大的一種細(xì)胞懸液的濃度作為檢測所用細(xì)胞懸液的指定濃度。

2）各時(shí)相hela細(xì)胞樣品散射光譜的測量。采用g1期、s期、g2期和m期的hela細(xì)胞樣品，分別制成具有指定濃度的對應(yīng)g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液并裝入玻璃試管內(nèi)，分別搖勻后，在37℃溫度條件下，利用廣角光散射儀分別測量每個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度，根據(jù)測量結(jié)果，得到g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線。該步驟具體為：

21）采用g1期、s期、g2期和m期的hela細(xì)胞樣品，分別制成具有指定濃度的對應(yīng)g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液，并裝入玻璃試管內(nèi)。

22）分別將裝入玻璃試管內(nèi)的g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液搖勻后，在37℃溫度條件下，利用廣角光散射儀分別測量每個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度，得到各不同細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)，并加以記錄。

23）重復(fù)執(zhí)行步驟22）5~10次，針對每個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在每一個(gè)散射角度上各次測量所得的散射光強(qiáng)度值，剔除其中離均差率的絕對值大于10%的散射光強(qiáng)度值，再將該散射角度上其它次測量所得的散射光強(qiáng)度值求平均，得到相應(yīng)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在相應(yīng)射角度上的散射光強(qiáng)度平均值，從而分別得到相應(yīng)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液在在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度平均值，并進(jìn)行曲線數(shù)據(jù)擬合，再對擬合所得的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑濾波處理，得到相應(yīng)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線；由此分別得到g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線。

本實(shí)施例中得到的g1期、s期、g2期和m期的hela樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線如圖2所示。

3）待測hela細(xì)胞樣本散射光譜的測量。獲取細(xì)胞周期未知的待測hela細(xì)胞樣本，制成具有同樣指定濃度的待測細(xì)胞懸液，并裝入玻璃試管內(nèi)，分別搖勻后，在37℃溫度條件下，利用廣角光散射儀測量待測細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度，根據(jù)測量結(jié)果，得到待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線。該步驟具體為：

31）采用待測hela細(xì)胞樣本，制成具有指定濃度的待測細(xì)胞懸液，并裝入玻璃試管內(nèi)。

32）將裝入玻璃試管內(nèi)的待測細(xì)胞懸液搖勻后，在37℃溫度條件下，利用廣角光散射儀測量待測細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度，得到待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)，并加以記錄。

33）重復(fù)執(zhí)行步驟32）5~10次，針對待測細(xì)胞懸液在每一個(gè)散射角度上各次測量所得的散射光強(qiáng)度值，剔除其中離均差率的絕對值大于10%的散射光強(qiáng)度值，再將該散射角度上其它次測量所得的散射光強(qiáng)度值求平均，得到待測細(xì)胞懸液在相應(yīng)射角度上的散射光強(qiáng)度平均值，從而分別得到待測細(xì)胞懸液在0°~180°散射角范圍內(nèi)每間隔5°上的散射光強(qiáng)度平均值，并進(jìn)行曲線數(shù)據(jù)擬合，再對擬合所得的散射光強(qiáng)度分布曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑濾波處理，得到待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線。

本實(shí)施例中得到的待測hela細(xì)胞懸液（圖3中的sample）的散射光強(qiáng)度分布曲線與g1期、s期、g2期和m期的hela樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線的對比圖如圖3所示。

4）將待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線分別與各個(gè)不同細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線進(jìn)行對比，確定與待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線相匹配的一個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞周期判定為待測細(xì)胞樣本的細(xì)胞周期。本實(shí)施例中，采用優(yōu)化的對比匹配方式，具體為：

41）從0°~180°散射角范圍中，劃分出前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間，其中，前向散射角區(qū)間為0°~20°散射角范圍，側(cè)向散射角區(qū)間為80°~100°散射角范圍，后向散射角區(qū)間為160°~180°散射角范圍。

42）根據(jù)g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自對應(yīng)的散射光強(qiáng)度分布曲線，分別統(tǒng)計(jì)得到g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖。本實(shí)施例得到的g1期、s期、g2期和m期的hela樣品細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布對比直方圖如圖4所示。

43）根據(jù)待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)度分布曲線，統(tǒng)計(jì)得到待測細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖。本實(shí)施例得到的待測hela細(xì)胞懸液（圖5中的sample）在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間與g1期、s期、g2期和m期的hela樣品細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)分布對比直方圖如圖5所示。

44）將待測細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖分別與g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖進(jìn)行對比，確定與待測細(xì)胞懸液的散射光強(qiáng)分布直方圖相匹配的一個(gè)細(xì)胞周期的樣品細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞周期判定為待測細(xì)胞樣本的細(xì)胞周期。

在該步驟中，g1期、s期、g2期和m期的樣品細(xì)胞懸液各自在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)分布直方圖的匹配依據(jù)為：m期的樣品細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間、側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)最強(qiáng)；g1期的樣品細(xì)胞懸液在側(cè)向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)僅次于m期的樣品細(xì)胞懸液，而在前向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)僅強(qiáng)于g2期的樣品細(xì)胞懸液；s期的樣品細(xì)胞懸液在前向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)僅次于m期的樣品細(xì)胞懸液，在側(cè)向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)僅強(qiáng)于g2期的樣品細(xì)胞懸液，在后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)最弱；g2期的樣品細(xì)胞懸液除了后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)僅強(qiáng)于s期的樣品細(xì)胞懸液，在前向散射角區(qū)間和后向散射角區(qū)間的散射光強(qiáng)均最弱。本實(shí)施例中，通過圖5的對比發(fā)現(xiàn)，待測hela細(xì)胞懸液（圖5中的sample）在側(cè)向散射角區(qū)間（80°~100°）和后向散射角區(qū)間（160°~180°）的散射光強(qiáng)僅次于m期的hela樣品細(xì)胞懸液，在前向散射角區(qū)間（0°~20°）的散射光強(qiáng)僅強(qiáng)于g2期的hela樣品細(xì)胞懸液，與g1期的樣品細(xì)胞懸液散射光強(qiáng)分布特征相匹配，因此判定待測hela細(xì)胞的為g1期的hela細(xì)胞。

在上述的圖2~圖5中，橫坐標(biāo)均表示散射角度值（angle），縱坐標(biāo)均表示散射光強(qiáng)度值（lightscattering）。

綜上所述，可以看到，本發(fā)明基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法，能夠借助散射光強(qiáng)度分布曲線真實(shí)反映生物細(xì)胞在細(xì)胞周期過程中各個(gè)階段g1期、s期、g2期和m期的變化，細(xì)胞的生長、增殖都和細(xì)胞周期是密不可分的，在細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相中由于細(xì)胞核折射率、大小會(huì)發(fā)生變化以及細(xì)胞質(zhì)大小和折射率的改變是造成細(xì)胞光散射曲線差異的原因，故可將這種差異作為散射光強(qiáng)法測定細(xì)胞周期的主要參數(shù)，從而能夠準(zhǔn)確地對生物細(xì)胞的生長行為和周期進(jìn)行判斷和描述；并且，由于光散射特性曲線可以反應(yīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化以及折射率變化，而不同種類的生物細(xì)胞、病毒細(xì)胞不僅形態(tài)結(jié)構(gòu)上有差異，細(xì)胞折射率也存在差異，因此本發(fā)明基于光散射測量的細(xì)胞周期檢測方法還能夠用于多種不同種類的生物細(xì)胞、病毒細(xì)胞的細(xì)胞周期對比分析和相關(guān)研究，具有很好的技術(shù)應(yīng)用前景。

最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。