本發(fā)明涉及一種較大范圍，具體是一種喹諾酮類藥物的檢測方法。

背景技術(shù)：

喹諾酮類（4-quinolones），又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥。喹諾酮類以細菌的脫氧核糖核酸（dna）為靶，妨礙dna回旋酶，進一步造成細菌dna的不可逆損害，達到抗菌效果。

喹諾酮類和其他抗菌藥的作用點不同，它們以細菌的脫氧核糖核酸（dna）為靶。細菌的雙股dna扭曲成為袢狀或螺旋狀（稱為超螺旋），使dna形成超螺旋的酶稱為dna回旋酶，喹諾酮類妨礙此種酶，進一步造成細菌dna的不可逆損害，而使細菌細胞不再分裂。它們對細菌顯示選擇性毒性。當(dāng)前，一些細菌對許多抗生素的耐藥性可因質(zhì)粒傳導(dǎo)而廣泛傳布。本類藥物則不受質(zhì)粒傳導(dǎo)耐藥性的影響，因此，本類藥物與許多抗菌藥物間無交叉耐藥性。

喹諾酮類是主要作用于革蘭陰性菌的抗菌藥物，對革蘭陽性菌的作用較弱（某些品種對金黃色葡萄球菌有較好的抗菌作用）。

喹諾酮按發(fā)明先后及其抗菌性能的不同，分為一、二、三、四代。第一代喹諾酮類，只對大腸桿菌、痢疾桿菌、克雷白桿菌、少部分變形桿菌有抗菌作用。具體品種有萘啶酸（nalidixicacid）和吡咯酸（piromidicacid）等，因療效不佳現(xiàn)已少用。第二代喹諾酮類，在抗菌譜方面有所擴大，對腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌、綠膿桿菌、沙雷桿菌也有一定抗菌作用。吡哌酸是國內(nèi)主要應(yīng)用品種。此外尚有新惡酸（cinoxacin）和甲氧惡喹酸（miloxacin），在國外有生產(chǎn)。第三代喹諾酮類的抗菌譜進一步擴大，對葡萄球菌等革蘭陽性菌也有抗菌作用，對一些革蘭陰性菌的抗菌作用則進一步加強。本類藥物中，國內(nèi)已生產(chǎn)諾氟沙星。尚有氧氟沙星（ofloxacin）、培氟沙星（perfloxacin）、依諾沙星（enoxacin）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin）等。本代藥物的分子中均有氟原子。因此稱為氟喹諾酮。第四代喹諾酮類與前三代藥物相比在結(jié)構(gòu)上修飾，結(jié)構(gòu)中引入8-甲氧基，有助于加強抗厭氧菌活性，而c-7位上的氮雙氧環(huán)結(jié)構(gòu)則加強抗革蘭陽性菌活性并保持原有的抗革蘭陰性菌的活性，不良反應(yīng)更小，但價格較貴。對革蘭陽性菌抗菌活性增強，對厭氧菌包括脆弱擬桿菌的作用增強，對典型病原體如肺炎支原體、肺炎衣原體、軍團菌以及結(jié)核分枝桿菌的作用增強。多數(shù)產(chǎn)品半衰期延長，如加替沙星與莫昔沙星。

本類藥物的不良反應(yīng)主要有：①胃腸道反應(yīng)：惡心、嘔吐、不適、疼痛等；②中樞反應(yīng)：頭痛、頭暈、睡眠不良等，并可致精神癥狀；③由于本類藥物可抑制γ-氨基丁酸（gaba）的作用，因此可誘發(fā)癲癇，有癲癇病史者慎用；④本類藥物可影響軟骨發(fā)育，孕婦、未成年兒童應(yīng)慎用；⑤可產(chǎn)生結(jié)晶尿，尤其在堿性尿中更易發(fā)生；⑥大劑量或長期應(yīng)用本類藥物易致肝損害。

喹諾酮類藥物被廣泛用于人和動物疾病的治療，由于喹諾酮類藥物在動物機體組織中的殘留，人食用動物組織后喹諾酮類抗生素就在人體內(nèi)殘留蓄積，造成人體疾病對該藥物的嚴(yán)重耐藥性，影響人體疾病的治療，俗話說的好，是藥三分毒，長期攝入含有喹諾酮類藥物的動物源食品，對人體有百害而無一利。

人類長期食用含較低濃度qns藥物的動物性食品、中成藥保健食品等，容易誘導(dǎo)耐藥性的傳遞，從而影響該類藥物的臨床療效。因此，喹諾酮類藥物殘留問題越來越引起人們的關(guān)注。聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家聯(lián)席委員會、歐盟都已制定了多種喹諾酮類藥物在動物組織中的最高殘留限量。美國fda于2005年宣布禁止用于治療家禽細菌感染的抗菌藥物恩諾沙星的銷售和使用。

我國也于2002年規(guī)定了環(huán)丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、惡喹酸和氟甲喹等7種qns藥物在動物肌肉組織中的最高殘留限量為10～500μg/kg。喹諾酮類藥物在動物組織中的殘留分析方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa)、高效液相色譜法(hplc)和液相色譜2質(zhì)譜分析法(lc2ms)。

因此，快速檢測喹諾酮類抗菌素成為社會的迫切需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種喹諾酮類藥物的檢測方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種喹諾酮類藥物的檢測方法，包括以下步驟：

（1）預(yù)處理：向待測樣品中加入1-3ml的二氯甲烷，振搖4-6分鐘，靜置5-10分鐘，收集下層萃取液；向所述萃取液中加入濃度為0.0004mol/l-1.2mol/l的鹽酸溶液，振搖4-6分鐘，靜置5-10分鐘，收集上層液體，得到待測樣品預(yù)處理液；

（2）對所述待測樣品預(yù)處理液采用紫外燈下檢視熒光，取有熒光反應(yīng)的待測樣品預(yù)處理液進行顯色反應(yīng)；

（3）向所述有熒光反應(yīng)的待測樣品預(yù)處理液中加入濃度為0.08-500mg/ml的硫酸鐵銨溶液，根據(jù)顯色結(jié)果判斷待測樣品中有無喹諾酮類藥物。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述喹諾酮類為恩諾沙星、環(huán)丙沙星、惡喹酸、沙拉沙星、雙氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、諾氟沙星、丹諾沙星中的一種或幾種。

作為本發(fā)明再進一步的方案：步驟（3）中所述硫酸鐵銨溶液中加有硫酸，硫酸的體積百分比濃度為10-40%。

作為本發(fā)明再進一步的方案：步驟（3）中所述硫酸鐵銨溶液中加有硫酸，硫酸的體積百分比濃度為25%。

作為本發(fā)明再進一步的方案：步驟（3）中向所述有熒光反應(yīng)的待測樣品預(yù)處理液中加入濃度為10-100mg/ml的三氯化鐵溶液，根據(jù)顯色結(jié)果判斷待測樣品中有無喹諾酮類藥物。

作為本發(fā)明再進一步的方案：所述硫酸鐵銨溶液濃度為250mg/ml。

作為本發(fā)明再進一步的方案：所述三氯化鐵溶液濃度為55mg/m。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：利用硫酸鐵按直接與喹諾酮類藥物發(fā)生鰲合反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色從而實現(xiàn)了喹諾酮類藥物的檢測，硫酸鐵按與喹諾酮類藥物的鰲合反應(yīng)具有高專屬性和高靈敏度；操作簡單可快速挑選出疑似陽性樣品，將熒光檢測和硫酸鐵按顯色檢測兩個方法結(jié)合起來，對疑似陽性樣品進行更加精確地檢測。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

本發(fā)明實施例中，選擇甲硝唑?qū)φ掌贰⒙让顾貥?biāo)準(zhǔn)品、地塞米松片、水楊酸對照品、恩諾沙星對照品、環(huán)丙沙星對照品、惡喹酸對照品、沙拉沙星對照品、雙氟沙星對照品、氟甲喹對照品、氧氟沙星對照品、諾氟沙星對照品、丹諾沙星對照品作為待測樣品，對這十一種樣品進行檢測，檢測方法分為如下兩種：

方法一：

（1）預(yù)處理：向待測樣品中加入1ml的二氯甲烷，振搖4分鐘，靜置5分鐘，收集下層萃取液；向所述萃取液中加入濃度為0.0004mol/l的鹽酸溶液，振搖4分鐘，靜置5分鐘，收集上層液體，得到待測樣品預(yù)處理液；

（2）向所述待測樣品預(yù)處理液中加入濃度為0.08mg/ml的硫酸鐵銨溶液，觀察顯色結(jié)果。

方法二：

（1）預(yù)處理：向待測樣品中加入2ml的二氯甲烷，振搖5分鐘，靜置7分鐘，收集下層萃取液；向所述萃取液中加入濃度為0.05mol/l的鹽酸溶液，振搖5分鐘，靜置8分鐘，收集上層液體，得到待測樣品預(yù)處理液；

（2）對所述待測樣品預(yù)處理液采用紫外燈下檢視熒光，取有熒光反應(yīng)的待測樣品預(yù)處理液進行顯色反應(yīng)；

（3）向所述有熒光反應(yīng)的待測樣品預(yù)處理液中加入濃度為200mg/ml的硫酸鐵銨溶液，硫酸鐵銨溶液中加有硫酸，硫酸的體積百分比濃度為25%，觀察顯色結(jié)果。

方法一的實驗結(jié)果：

甲硝唑?qū)φ掌返娘@色結(jié)果是無色，為陰性；

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的顯色結(jié)果是無色，為陰性；

地塞米松片的顯色結(jié)果是無色，為陰性；

水楊酸對照品的顯色結(jié)果是紫紅色，為陰性；

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、惡喹酸、沙拉沙星、雙氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、諾氟沙星、丹諾沙星的顯色結(jié)果均為橙紅色，為陽性。

方法二的實驗結(jié)果：

除了甲硝唑?qū)φ掌泛吐让顾貥?biāo)準(zhǔn)品無熒光外，其余樣品均有熒光，其中:地塞米松片有微黃色熒光，水楊酸對照品有藍色熒光，恩諾沙星、惡喹酸、沙拉沙星、雙氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、諾氟沙星、丹諾沙星均有黃綠色熒光出現(xiàn)，環(huán)丙沙星出現(xiàn)藍色熒光，因此將無熒光出現(xiàn)的甲硝哩對照品、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品判定為陰性樣品，不再進行后續(xù)的顯色反應(yīng)，而其他樣品均有熒光出現(xiàn)，判定為疑似陽性樣品，進行后續(xù)的顯色反應(yīng)。

顯色結(jié)果為：

地塞米松片的顯色結(jié)果是無色，為陰性；

水楊酸對照品的顯色結(jié)果是紫紅色，為陰性；

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、惡喹酸、沙拉沙星、雙氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、諾氟沙星、丹諾沙星的顯色結(jié)果均為橙紅色，為陽性。

根據(jù)方法一和方法二的實驗結(jié)果可以看出，硫酸鐵按溶液能夠?qū)Ｒ恍缘貦z測喹諾酮類藥物，且熒光檢測也可以實現(xiàn)對喹諾酮類藥物的初篩，繼而搭配硫酸鐵按溶液檢測，可簡化檢測操作，提高檢測效率。

實施例2

本發(fā)明實施例中，選擇甲硝唑?qū)φ掌贰⒙让顾貥?biāo)準(zhǔn)品、地塞米松片、水楊酸對照品、恩諾沙星對照品、環(huán)丙沙星對照品、惡喹酸對照品、沙拉沙星對照品、雙氟沙星對照品、氟甲喹對照品、氧氟沙星對照品、諾氟沙星對照品、丹諾沙星對照品作為待測樣品，對這十一種樣品進行檢測，檢測方法分為如下：

（1）預(yù)處理：向待測樣品中加入3ml的二氯甲烷，振搖6分鐘，靜置10分鐘，收集下層萃取液；向所述萃取液中加入濃度為1.2mol/l的鹽酸溶液，振搖6分鐘，靜置10分鐘，收集上層液體，得到待測樣品預(yù)處理液；

（2）對所述待測樣品預(yù)處理液采用紫外燈下檢視熒光，取有熒光反應(yīng)的待測樣品預(yù)處理液進行顯色反應(yīng)；

（3）向所述有熒光反應(yīng)的待測樣品預(yù)處理液中加入濃度為55mg/ml的三氯化鐵溶液，觀察顯色結(jié)果。

實驗結(jié)果：

除了甲硝唑?qū)φ掌泛吐让顾貥?biāo)準(zhǔn)品無熒光外，其余樣品均有熒光，其中:地塞米松片有微黃色熒光，水楊酸對照品有藍色熒光，恩諾沙星、惡喹酸、沙拉沙星、雙氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、諾氟沙星、丹諾沙星均有黃綠色熒光出現(xiàn)，環(huán)丙沙星出現(xiàn)藍色熒光，因此將無熒光出現(xiàn)的甲硝哩對照品、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品判定為陰性樣品，不再進行后續(xù)的顯色反應(yīng)，而其他樣品均有熒光出現(xiàn)，判定為疑似陽性樣品，進行后續(xù)的顯色反應(yīng)。

顯色結(jié)果為：

地塞米松片的顯色結(jié)果是無色，為陰性；

水楊酸對照品的顯色結(jié)果是紫紅色，為陰性；

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、惡喹酸、沙拉沙星、雙氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、諾氟沙星、丹諾沙星的顯色結(jié)果均為橙紅色，為陽性。

根據(jù)實驗結(jié)果可以看出，該結(jié)果和本實施例1中的硫酸鐵銨檢測一致。

因此，本發(fā)明在向待測樣品預(yù)處理液中加入硫酸鐵銨溶液或三氯化鐵溶液，即顯淡橙紅色至橙紅色，則判定為陽性，待測樣品中添加有喹諾酮類藥物；其余顯色結(jié)果判定為陰性，說明待測樣品中沒有添加喹諾酮類藥物。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。