本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及幽門螺桿菌的快速鑒定及毒力分析方法。

背景技術(shù)：

幽門螺桿菌(helicobacterpylori,h.pylori)是一種主要寄生在人體胃部的桿狀革蘭陰性菌，h.pylori感染是萎縮性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的重要危險(xiǎn)因素。目前h.pylori鑒定和毒力檢測(cè)有以下方法：1)生化鑒定；2)組織病理切片染色法；3)尿素呼氣試驗(yàn)(ureabreathtest,ubt)；4)快速尿素酶實(shí)驗(yàn)(rapidureasetest,rut)；5)常規(guī)核酸分析法：包括測(cè)序、pcr、寡核苷酸探針雜交等。生化鑒定法耗時(shí)長(zhǎng)，準(zhǔn)確性低；組織病理切片染色法受h.pylori載量影響明顯，且操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，不適于大通量樣本的檢測(cè)；尿素呼氣試驗(yàn)費(fèi)用高、易受抑菌藥物和抑酸藥物的影響、敏感度低；快速尿素酶實(shí)驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果受到標(biāo)本中h.pylori密度、環(huán)境溫度以及反應(yīng)較弱時(shí)缺乏明確客觀的判斷標(biāo)準(zhǔn)等影響，敏感性、特異性和準(zhǔn)確性均較低；常規(guī)核酸分析法，通量小，成本較高，對(duì)操作者的要求比較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種快速、準(zhǔn)確、高效及低成本的h.pylori的快速鑒定及毒力分析方法。

本發(fā)明提供的h.pylori的快速鑒定及毒力分析方法，包括以下步驟：

(1)：采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)h.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株、臨床分離菌株進(jìn)行特征性鑒定，得到數(shù)據(jù)；

(2)：使用maldi-biotyper和clinprotools軟件對(duì)所述的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析用于區(qū)分h.pylori菌株不同的毒力。

同時(shí)，通過系統(tǒng)地比對(duì)和優(yōu)化，確定了采用70％甲酸作為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定前的預(yù)處理。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

其為一種快速、準(zhǔn)確、高效及低成本的h.pylori鑒定和毒力的新型診斷方法，能夠提高maldi-tofms確定h.pylori菌株的毒力的能力，預(yù)測(cè)胃腸道疾病的發(fā)展以指導(dǎo)臨床采用合理的干預(yù)措施，早期根治高危型的h.pylori感染，預(yù)防和治療h.pylori感染相關(guān)疾病。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例在使用不同試劑處理菌種后后獲得的圖譜。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例37株臨床h.pylori菌株和7株標(biāo)準(zhǔn)h.pylori菌株聚類分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明，以更好地理解本發(fā)明。

實(shí)施例

1材料

1.1樣本來源

2016年1月至2016年7月在華東醫(yī)院就診的且需行胃鏡檢查的胃十二指腸疾病患者350例，其中男性185例，女性165例，平均年齡(50.3±13.8)歲。

1.2對(duì)照菌株

對(duì)照菌株為一株經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化鑒定、并經(jīng)16srrna測(cè)序確認(rèn)的臨床菌株。

1.3材料與試劑

1.4儀器與設(shè)備

其他：數(shù)據(jù)采集軟件為德國布魯克道爾頓公司的flexcontrol；鑒定軟件為德國布魯克道爾頓公司的maldibiotyper軟件,圖譜分析軟件為德國布魯克道爾頓公司的flexanalysis軟件。

1.5主要試劑的配制

1.5.1混合抗生素工作液：用電子天平稱量5mg甲氧芐氨嘧啶(tmp)加入到50ml滅菌蒸餾水中，攪拌混勻并加入2滴乳酸，加熱煮沸。降至室溫后加入萬古霉素100mg,兩性霉素b3.8mg，多粘菌素b20mg，混合均勻之后將混合抗生素溶液用0.45μm針筒濾器進(jìn)行過濾，分裝至滅菌ep管中,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2h.pylori選擇性培養(yǎng)基

(1)用電子天平稱量30.5g哥倫比亞血瓊脂干粉，在1000ml錐形瓶?jī)?nèi)溶于780ml蒸餾水中，用玻棒攪拌均勻，蓋上橡膠塞。

(2)121℃，高溫高壓蒸汽滅菌20分鐘。

(3)待溫度降至70℃左右，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至已到達(dá)設(shè)定溫度的水浴鍋內(nèi)(50～55℃)，平衡2小時(shí)左右備用。

(4)向溫度已降至52.5℃的培養(yǎng)基中添加3.9ml混合抗生素工作液，然后用5ml移液器向錐形瓶?jī)?nèi)加入70mll新鮮無菌脫纖維羊血，混合均勻后將其倒入無菌空平板中，高度約4mm。

(5)待平板冷卻凝固后放入4℃環(huán)境下冷藏待用，2周內(nèi)使用完畢。

1.5.3凍存液：用電子天平稱量布氏肉湯干粉2.8g，溶解于70ml蒸餾水中，用量筒量取甘油30ml添加其中,用玻棒攪拌均勻后置入滅菌鍋內(nèi)高壓蒸汽滅菌20分鐘；待凍存液冷卻至室溫，分裝于無菌凍存管中，每管分裝的量大約1ml，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4基質(zhì)液配置：取適量基質(zhì)溶解液加入到chca基質(zhì)中，配置成chca過飽和溶液，常溫下保存?zhèn)溆?；基質(zhì)溶解液：50％超純水，47.5％乙腈，2.5％三氟乙酸(tfa)。

2方法

2.1h.pylori的分離培養(yǎng)

征得患者同意并簽署知情同意書后，由華東醫(yī)院消化內(nèi)鏡室醫(yī)師經(jīng)胃鏡用活檢鉗于近胃幽門部、胃竇部或病變臨近處采集患者胃活檢組織樣本，置保存液(0.9％生理鹽水)中及時(shí)送檢(4h內(nèi))。胃粘膜組織經(jīng)全自動(dòng)研磨儀(65hz，60s)充分研磨形成組織勻漿后，取100μl密集均勻涂布在h.pylori選擇培養(yǎng)基上。在6％o2、10％co2的微需氧條件下，35℃培養(yǎng)5～7天。剩余的組織勻漿置于-80℃冰箱保存。

2.2h.pylori的鑒定

挑取在h.pylori選擇性平板上生長(zhǎng)的疑似菌落(圓形，無色半透明呈露滴狀，直徑約0.5～1mm)進(jìn)行革蘭染色鏡檢，顯微鏡下呈革蘭陰性弧形、螺旋形、s形、海鷗形或者是彎曲短桿狀，氧化酶和觸酶均陽性、脲酶強(qiáng)陽性，根據(jù)上述的特征，即可判斷為h.pylori。傳代后培養(yǎng)48～72h，用無菌棉拭子刮取足量平板上的菌落，置于凍存液中-80℃凍存。

2.3h.pylori菌株的復(fù)蘇

將-80℃凍存的菌株恢復(fù)至室溫后，取100μl菌液接種于h.pylori選擇性平板上均勻涂布，在6％o2、10％co2的條件下，35℃培養(yǎng)3～5天。

2.4細(xì)菌基因組總dna抽提

(1)取適量平板上生長(zhǎng)的h.pylori菌落轉(zhuǎn)移至含有1ml無菌生理鹽水的ep管內(nèi)，13000rpm離心60s，收集菌體沉淀；

(2)參照北京天根公司細(xì)菌dna抽提試劑盒說明書中的步驟抽提細(xì)菌基因組總dna；

(3)將提取好的h.pylori總dna收集到離心管中；用nanodrop分光光度計(jì)測(cè)量其濃度和純度后放入-20℃保存?zhèn)溆?，以進(jìn)行后續(xù)的pcr反應(yīng)。

2.5h.pylori鑒定基因16srrna和毒力基因dupa的擴(kuò)增與測(cè)序

引物序列16srrna(正向引物:tctaacgaataagcaccggcta；反向引物:gtgcagcacctgttttcaagg)，擴(kuò)增長(zhǎng)度為576bp；dupa(正向引物：agcgactcttttagctgagatt；反向引物：ggactttctatgataaatacgcagt),擴(kuò)增長(zhǎng)度為1940bp。以h.pylori臨床分離株總dna為模板，用以上引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)?？偡磻?yīng)體系為25μl，模板dna為1μl。pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃預(yù)變性30s，52～60℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。然后將獲得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行基因測(cè)序(上海桑尼生物科技公司)，測(cè)序結(jié)果與ncbi基因庫進(jìn)行比對(duì)，選擇符合率＞99％的為鑒定結(jié)果。

2.6檢測(cè)前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

采用70％甲酸、甲酸和乙腈(1：1)、50％異丙醇(含有0.1％三氟乙酸)和ddh2o(陰性對(duì)照)，對(duì)臨床菌株進(jìn)行前處理(每個(gè)檢測(cè)樣本添加1μl的前處理試劑)，自然干燥后，進(jìn)行質(zhì)譜分析，比較上述不同試劑的細(xì)菌前處理能力，以選擇h.pylori最佳的前處理方法。

2.7h.pylori樣本準(zhǔn)備及maldi-tofms分析

microflexlt儀器參數(shù)設(shè)置為：線性陽離子模式，n2激光，λ＝355nm，脈沖持續(xù)時(shí)間：150ns，激光頻率為200hz，采集的質(zhì)量范圍為m/z＝2000-20,000da，每張圖譜采集200個(gè)shots。在進(jìn)行檢測(cè)前，用細(xì)菌實(shí)驗(yàn)標(biāo)本品(bts)進(jìn)行外部校準(zhǔn)，校準(zhǔn)后的誤差小于200ppm。然后用flexanalysis軟件查看獲得的圖譜，評(píng)價(jià)圖譜的質(zhì)量。

臨床分離菌株樣品按照以下程序進(jìn)行制備：用竹簽挑取在哥倫比亞血瓊脂上生長(zhǎng)良好的h.pylori菌落，然后將其均勻涂布在靶板上，將1μl預(yù)處理試劑覆蓋在樣品上，在室溫下完全干燥后，向靶板中加入1μlchca基質(zhì)液并在常溫下干燥。處理好的樣品隨后進(jìn)行maldi-tofms分析。每個(gè)樣本做2個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣本孔采集≥3張質(zhì)譜圖。flexcontrol(brukerdaltonics，germany)軟件用于獲取質(zhì)譜圖。

2.8細(xì)菌鑒定結(jié)果解讀

maldibiotyper：使用biotyper軟件將獲得的質(zhì)譜圖與參考圖譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，判斷標(biāo)準(zhǔn)采用廠商的標(biāo)準(zhǔn)：分值≥2.000表示鑒定到種水平，分值為1.700～1.999表示鑒定到屬水平，分值＜1.700表示未鑒定。

2.9建立參考數(shù)據(jù)庫

本發(fā)明maldibiotyper平臺(tái)上建立了參考數(shù)據(jù)庫用于臨床h.pylori的鑒定:使用biotyper3.1軟件對(duì)37株臨床h.pylori分離株構(gòu)建主圖譜預(yù)測(cè)(mainspectralprojection,msp)。msp的構(gòu)建基于平滑，基線減法，正?；?，和峰值抓取處理后的原始圖譜。每個(gè)菌株獲得6張?jiān)紙D譜用于構(gòu)建一個(gè)msp，共得到37個(gè)msps。將所有新建的msp添加到biotyper參考數(shù)據(jù)庫中。軟件參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。

2.10maldi-tofms用于h.pylori毒力分析模型(dupa⁺/dupa^-)的建立

mspdendrogram是一種在各種規(guī)模均能進(jìn)行的通過創(chuàng)建一個(gè)集群功能樹或樹狀圖的分組方法。用44張msps(包括原始數(shù)據(jù)庫中的7張msps和來自臨床分離株的37張msps)建立mspdendrogram?；趍spdendrogram的結(jié)果，具有共同特征的菌株可以被分到同一個(gè)組。然后基于mspdendrogram的分組結(jié)果，使用clinprotools建立毒力分類模型以區(qū)分dupa(+)/dupa(-)臨床h.pylori分離株。clinprotools軟件主要操作設(shè)置如下：信噪比(s/n)的閾值設(shè)置為5，相對(duì)強(qiáng)度閾值為1.5％，用于區(qū)分的峰的個(gè)數(shù)設(shè)置為10。

結(jié)果

1.h.pylori的分離鑒定結(jié)果

為了構(gòu)建新的參考數(shù)據(jù)庫和毒力分析模型，從350例臨床活檢樣本中共分離出68株h.pylori菌株，總的陽性分離率為19.4％。所有的h.pylori臨床分離株均對(duì)其高度保守和穩(wěn)定的基因16srrna進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。其中31株h.pylori菌株用于建立maldi-tofms參考數(shù)據(jù)庫和毒力類型(dupa⁺/dupa^-)分析模型,其余37株用于評(píng)估參考數(shù)據(jù)庫和毒力類型(dupa⁺/dupa^-)分析模型的臨床應(yīng)用能力。

2.h.pylori毒力基因dupa鑒定

共有37株h.pylori菌株被添加到biotyper原始數(shù)據(jù)庫中并用于建立mspdendrogram和clinprotools毒力類型(dupa⁺/dupa^-)分析模型，其中，24株為dupa陽性，13株為dupa陰性。所有菌株的遺傳和臨床背景見表1-1。

表1-1臨床h.pylori菌株的臨床和基因背景

注：cag：慢性萎縮性胃炎；n：非萎縮性胃炎；du：十二指腸潰瘍；gu：

胃潰瘍；hp：幽門螺桿菌。

3.細(xì)菌前處理?xiàng)l件的優(yōu)化結(jié)果

maldibiotyper:1株已知遺傳背景的臨床h.pylori分離株被用于maldi-tofms檢測(cè)預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化。圖1顯示了在使用不同試劑處理后獲得的圖譜：無處理、ddh2o、50％異丙醇(含有0.1％tfa)、70％甲酸和乙腈(1:1)和70％甲酸。與其他三種預(yù)處理試劑相比，70％甲酸處理后獲得的圖譜顯示了最高的峰強(qiáng)度和最多的h.pylori特異性峰。此外，在16000da后的位置依然可以觀察到離子峰。因此，70％甲酸作為優(yōu)化的預(yù)處理試劑用于h.pylori后續(xù)的maldi-tofms檢測(cè)。

注：maldi-tof分析前加入各種預(yù)處理試劑用于優(yōu)化檢測(cè)效率。圖2顯示了每種試劑處理后獲得的圖譜。70％甲酸處理后可以獲得最佳的圖譜。m/z：質(zhì)荷比；maldi基質(zhì)：α-chca。

4.h.pylori菌株參考數(shù)據(jù)庫和毒力類型(dupa⁺/dupa^-)分析模型的建立

maldibiotyper參考數(shù)據(jù)庫：37株臨床h.pylori分離株被加入到原有數(shù)據(jù)庫中，每株h.pylori菌株采集六張圖譜，然后將其用于構(gòu)建一個(gè)msp，共獲得37張msps加入到biotyper數(shù)據(jù)庫中。

mspdendrogram的建立：7株h.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株和37株臨床h.pylori分離株構(gòu)建了一張mspdendrogram?；谒鼈兊挠H緣性遠(yuǎn)近可以將這些菌株分成幾個(gè)不同的組。原始biotyper數(shù)據(jù)庫中的7株標(biāo)準(zhǔn)菌株中有6株被分為一個(gè)單獨(dú)的組，如圖2所示。37株臨床h.pylori分離株中的30株被分為2組：組1(10株)和組2(20株)，每個(gè)組可分為2個(gè)亞組：組1-1(g1-1)，組1-2(g1-2)，組2-1(g2-1)和組2-2(g2-2)。g1-2和g2-1中菌株導(dǎo)致十二指腸/胃潰瘍的比例顯著高于g1-1和g2-2(90％vs10％)。相應(yīng)地，g1-2和g2-1中的dupa(+)分離株的數(shù)目也顯著高于g1-1和g2-2(85％vs20％)。這種現(xiàn)象表明dupa(+)和dupa(-)菌株可能存在著不同的圖譜模式，并且與不同的臨床特征相關(guān)。g1-1和g2-2組dupa(-)菌株比例較大，患有十二指腸潰瘍的概率小，臨床危險(xiǎn)性低；g1-2和g2-1組dupa(+)菌株比例較大，患有十二指腸潰瘍的概率大，臨床危險(xiǎn)性高，需要根除治療。

注：mspdendrogram由maldibiotyper3.1軟件使用默認(rèn)設(shè)置生成。37株臨床分離株中的30株可被分為4組。g1-1：第1-1組；g1-2：第1-2組；g2-1：第2-1組；g2-2：第2-2組。其余的7株臨床h.pylori分離株和7株標(biāo)準(zhǔn)菌株參考圖譜為“其他”組；hp：幽門螺桿菌。

clinprotools毒力類型(dupa⁺/dupa^-)分析模型的建立：除了mspdendrogram，clinprotools(v.3.0.22；brukerdaltonics)被進(jìn)一步用于建立毒力分類模型以區(qū)分dupa(+)和dupa(-)臨床h.pylori分離株。24株dupa(+)分離株和13株dupa(-)分離株用于創(chuàng)建分類模型。由遺傳算法(geneticalgorithm,ga)建立clinprotools模型獲得的用于分類dupa(+)和dupa(-)菌株的10個(gè)譜峰的質(zhì)荷比(masstochargeratio,m/z)為:7767、8391、7286、6069、2789、6272、7668、13880、6554和14019。使用flexanalysis軟件進(jìn)一步確認(rèn)發(fā)現(xiàn)，m/z＝8391、7286和7684為dupa(-)菌株的特異峰，m/z＝7767和14019為dupa(+)菌株的特異峰。clinprotools所建立的遺傳算法模型的識(shí)別能力(recognitioncapability，rc)為99.29％,交叉驗(yàn)證能力(crossvalidation,cv)為94.32％，表明了dupa(+)/dupa(-)臨床h.pylori分離株可以被較好地區(qū)分。rc是指模型能正確分類用于建立模型的圖譜的能力的一種度量。它通過檢測(cè)用于相對(duì)于模型本身用于建立模型的每個(gè)圖譜并將能正確分類的圖譜數(shù)除以總數(shù)來計(jì)算。vc是模型可靠性的一種度量，并可用于預(yù)測(cè)其未來性能。它是通過將建立模型的圖譜隨機(jī)分成模型子集和測(cè)試子集來進(jìn)行計(jì)算的。該過程重復(fù)多次以計(jì)算出一個(gè)歸一化的交叉驗(yàn)證值。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

其為一種快速、準(zhǔn)確、高效及低成本的h.pylori鑒定和毒力的新型診斷方法，能夠提高maldi-tofms確定h.pylori菌株的毒力的能力，預(yù)測(cè)胃腸道疾病的發(fā)展以指導(dǎo)臨床采用合理的干預(yù)措施，早期根治高危型的h.pylori感染，預(yù)防和治療h.pylori感染相關(guān)疾病。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。