本發(fā)明涉及酪氨酸濃度檢測領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種快速檢測酪氨酸濃度的方法。

背景技術(shù)：

酪氨酸(tyrosine，tyr)屬于芳香族氧基酸，在體內(nèi)可由苯丙氨酸經(jīng)化而來，是人體重要的半必需氨基酸。酪氨酸的代謝斎亂可導致多種遺傳性疾病的發(fā)生，如酪氨酸血癥、尿黑酸癥等，而且與肝腎疾病、神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病、惡性腫瘤等有一定的相關(guān)性。酪氨酸是人體不可缺少的一種氨基酸，它是合成神經(jīng)遞質(zhì)兒茶酚胺的前體，缺乏酪氨酸人體就會出現(xiàn)生長異常，智能低下等現(xiàn)象，因此國內(nèi)外已普遍開始重視食品中酪氨酸含量的添加。研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的含量在健康人和遺傳性疾病、肝腎疾病以及惡性腫瘤等疾病患者體液中有明顯差異。因此，探索酪氨酸及其代謝產(chǎn)物含量的分析新技術(shù)并應用于實際樣品測定，對某些疾病的診斷、治療和監(jiān)測具有十分重要的臨床意義。測定酪氨酸的方法主要有氨基酸自動分析儀、分光光度法、高效液相色譜法、質(zhì)譜法、核磁共振波譜法和毛細管電泳法等,這些技術(shù)雖然應用比較廣泛，但使用的儀器昂貴、前處理復雜費時、試劑消耗量大且分析時間較長，混合樣品檢測不靈敏的缺陷，檢測限高，不能滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種操作簡單、檢測快速且靈敏度高，能進行混合樣品溶液中酪氨酸的高靈敏識別。

為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種快速檢測酪氨酸濃度的方法，包括以下步驟：

步驟一、采用玻碳電極作為工作電極搭建三電極體系，利用差分脈沖伏安法，分別測量并記錄多份含有不同濃度的酪氨酸的pbs緩沖溶液的差分脈沖伏安曲線，在此過程中記錄每份含酪氨酸的pbs緩沖溶液的電壓強度峰值；

步驟二、以步驟一得到的每份含酪氨酸的緩沖pbs沖溶液的電壓強度峰值與不含酪氨酸的pbs緩沖溶液的電壓強度峰值的差值作為縱坐標，以每份酪氨酸的濃度為橫坐標，繪制標準曲線并計算線性方程；

步驟三、以玻碳電極作為工作電極，使用三電極體系差分脈沖伏安法測量并記錄待測溶液的差分脈沖伏安曲線，得到待測溶液的電壓強度峰值，代入所述線性方程得到待測溶液的酪氨酸濃度。

優(yōu)選的是，步驟一中配制的多份含有不同濃度的酪氨酸的pbs緩沖溶液，pbs緩沖溶液的ph均為7.4，其濃度均為0.1mol/l，酪氨酸濃度依次為5.0×10^-6mol/l、1×10^-5mol/l、2.5×10^-5mol/l、4.5×10^-5mol/l、7×10^-5mol/l、1×10^-4mol/l、1.5×10^-4mol/l、2×10^-4mol/l、3×10^-4mol/l。

優(yōu)選的是，所述玻碳電極經(jīng)過打磨處理，具體為：將玻碳電極先用紫薯粉水溶液浸泡20～30min，取出玻碳電極用大豆磷脂的四氯化碳溶液浸泡20～30min，再依次用質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇水溶液、二次蒸餾水分別超聲清洗5～10min，然后依次用粒徑為0.3μm、0.05μm的氧化鋁粉末打磨，再用質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇水溶液、二次蒸餾水分別超聲清洗5～10min，最后用氮氣吹干即可；

其中，紫薯粉水溶液的制備具體為：紫薯粉與去離子水以質(zhì)量體積比為1g:10～20ml混合，并置于40～60℃水浴條件下攪拌20～30min；

大豆磷脂與四氯化碳的質(zhì)量體積比為1g:20～50ml。

優(yōu)選的是，打磨處理后的玻碳電極進行修飾，具體為：以質(zhì)量體積比為1g:10ml往研缽內(nèi)加入碳納米管和質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇，研磨10～15min后，再加入去離子水并進行超聲處理，超聲溫度為40～60℃，超聲頻率為400khz，超聲時間為20～30min，形成碳納米管懸浮液，取5ml碳納米管懸浮液滴加在打磨處理后的玻碳電極上，經(jīng)紅外干燥即可。

優(yōu)選的是，對碳納米管進行預處理，具體為：

s1、將鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯和β-環(huán)糊精置于離子水中超聲處理，超聲時間為20～30min，再加入碳納米管，繼續(xù)超聲處理2～3h，得混合液a，超聲頻率均為400khz，其中，鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯、β-環(huán)糊精、碳納米管、以及去離子水的質(zhì)量體積比為1g:0.2～0.5g:2～3g:100～120ml；

s2、在攪拌作用下向混合液a中加入質(zhì)量分數(shù)為80％的水合肼，并置于80～90℃水浴中反應4～5h，冷卻后，離心處理得沉淀，并用去離子水對沉淀進行洗滌，用紅外干燥即可，其中，混合液a與質(zhì)量分數(shù)為80％的水合肼的體積比為1:0.2～0.4。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

第一、本發(fā)明的檢測方法具有電子傳遞速率快、穩(wěn)定性好、制備簡單、操作方便的優(yōu)點，檢測過程簡單方便、靈敏度高、檢測限低，可實現(xiàn)實際樣品中酪氨酸的快速檢測；

第二、從差分脈沖伏安曲線中可得知待檢測溶液對應的電壓強度隨酪氨酸的濃度的增加而增強，且電壓強度與酪氨酸濃度有良好的線性關(guān)系，因此，玻碳電極可以作為檢測酪氨酸的電極，快速并定量檢測溶液中酪氨酸的含量，對酪氨酸的檢測限可達到6×10^-7mol/l；

第三、玻碳電極經(jīng)紫薯粉水溶液、大豆磷脂的四氯化碳溶液浸泡后，再打磨，可以緩和利用氧化鋁粉末打磨時與玻碳電極的摩擦作用，以使玻碳電極的表面達到更細致的紋路，減小因紋路的差異而引起的電化學信號誤差，從而提高準確性；

第四、碳納米管由碳原子形成的無縫納米碳材料，中空的管體，具有良好的表面與界面特性和電化學性，玻碳電極利用碳納米管進行修飾后，可以大大提高電極的電化學信號強度，使電子定向傳輸，消除了其它電子干擾因素，大大提升了靈敏度，檢測限可達6×10^-8mol/l；

第五、采用經(jīng)鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯和β-環(huán)糊精超聲處理，及與水合肼反應后的碳納米管，用此碳納米管修飾后的玻碳電極的電化學信號更加穩(wěn)定，使得在5～45℃溫度范圍內(nèi)檢測酪氨酸，其檢測限和檢測準確性仍然很好，且重復測量多次，電化學信能仍然穩(wěn)定。

本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的差分脈沖伏安曲線圖；

圖2為本發(fā)明酪氨酸的標準曲線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。

<實施例1>

一種快速檢測酪氨酸濃度的方法，包括以下步驟：

步驟一、配制的多份含有不同濃度的酪氨酸的pbs緩沖溶液，pbs緩沖溶液的ph均為7.4，其濃度均為0.1mol/l，酪氨酸濃度依次為5.0×10^-6mol/l、1×10^-5mol/l、2.5×10^-5mol/l、4.5×10^-5mol/l、7×10^-5mol/l、1×10^-4mol/l、1.5×10^-4mol/l、2×10^-4mol/l、3×10^-4mol/l。采用玻碳電極作為工作電極搭建三電極體系，設(shè)定初始電位為0.4v，終止電位為1.0v，然后設(shè)置如下脈沖參數(shù)：電位增量為0.004v，方波頻率為50hz，方波幅度為0.05v，等待時間為2s。利用差分脈沖伏安法，分別測量并記錄多份含有不同濃度的酪氨酸的pbs緩沖溶液的差分脈沖伏安曲線，在此過程中記錄每份含酪氨酸的pbs緩沖溶液的電壓強度峰值；

步驟二、以步驟一得到的每份含酪氨酸的緩沖pbs沖溶液的電壓強度峰值與不含酪氨酸的pbs緩沖溶液的電壓強度峰值的差值作為縱坐標，以每份酪氨酸的濃度為橫坐標，繪制標準曲線并計算線性方程；

如圖1為差分脈沖伏安曲線，其中曲線a、b、c、d、e、f、g、h、i和j分別為酪氨酸的標準液濃度為0mol/l、5.0×10^-6mol/l、1×10^-5mol/l、2.5×10^-5mol/l、4.5×10^-5mol/l、7×10^-5mol/l、1×10^-4mol/l、1.5×10^-4mol/l、2×10^-4mol/l和3×10^-4mol/l的標準溶液的差分脈沖伏安曲線。用5.0×10^-6mol/l、1×10^-5mol/l、2.5×10^-5mol/l、4.5×10^-5mol/l、7×10^-5mol/l、1×10^-4mol/l、1.5×10^-4mol/l、2×10^-4mol/l和3×10^-4mol/l的標準溶液的電壓強度峰值分別減去0mol/l標準溶液的電壓強度峰值，得到九個電壓強度峰值差值。從圖1可知待測溶液對應的電壓強度峰值隨酪氨酸的濃度的增加而增強。

圖2為酪氨酸的標準曲線圖，圖中y為電壓強度峰值差值，單位為mv，x為酪氨酸的標準液濃度，單位為μm，電壓強度與酪氨酸濃度有良好的線性關(guān)系，r²＝0.9961，檢測限為6×10^-7mol/l。

步驟三、按照步驟一測量并記錄待檢測溶液的差分脈沖伏安曲線，得到待測溶液的電壓強度峰值，該差分脈沖伏安曲線的電壓強度峰值與不含酪氨酸的pbs緩沖溶液的電壓強度峰值的差值代入到所述線性方程中，從差分脈沖伏安曲線讀出電壓強度峰值減去0mol/l標準溶液的電壓強度峰值，即得到y(tǒng)值，將y值代入線性方程即可解出x，即可得到待檢測溶液中酪氨酸的濃度。

<實施例2>

一種快速檢測酪氨酸濃度的方法，測定步驟同實施例1，其中，

所述玻碳電極經(jīng)過打磨處理，具體為：將玻碳電極先用紫薯粉水溶液浸泡20min，取出玻碳電極用大豆磷脂的四氯化碳溶液浸泡20min，再依次用質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇水溶液、二次蒸餾水分別超聲清洗5min，然后依次用粒徑為0.3μm、0.05μm的氧化鋁粉末打磨，再用質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇水溶液、二次蒸餾水分別超聲清洗5min，最后用氮氣吹干即可；

其中，紫薯粉水溶液的制備具體為：紫薯粉與去離子水以質(zhì)量體積比為1g:10ml混合，并置于40℃水浴條件下攪拌20min；

大豆磷脂與四氯化碳的質(zhì)量體積比為1g:20ml。

打磨處理后的玻碳電極進行修飾，具體為：以質(zhì)量體積比為1g:10ml往研缽內(nèi)加入碳納米管和質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇，研磨10min后，再加入去離子水并進行超聲處理，超聲溫度為40℃，超聲頻率為400khz，超聲時間為20min，形成碳納米管懸浮液，取5ml碳納米管懸浮液滴加在打磨處理后的玻碳電極上，經(jīng)紅外干燥即可。

碳納米管進行預處理，具體為：

s1、將鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯和β-環(huán)糊精置于離子水中超聲處理，超聲時間為20min，再加入碳納米管，繼續(xù)超聲處理2h，得混合液a，超聲頻率均為400khz，其中，鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯、β-環(huán)糊精、碳納米管、以及去離子水的質(zhì)量體積比為1g:0.2g:2g:100ml；

s2、在攪拌作用下向混合液a中加入質(zhì)量分數(shù)為80％的水合肼，并置于80℃水浴中反應4h，冷卻后，離心處理得沉淀，并用去離子水對沉淀進行洗滌，用紅外干燥即可，其中，混合液a與質(zhì)量分數(shù)為80％的水合肼的體積比為1:0.2。

電壓強度與酪氨酸濃度有良好的線性關(guān)系，r²＝0.9995。

<實施例3>

一種快速檢測酪氨酸濃度的方法，測定步驟同實施例1，其中，

所述玻碳電極經(jīng)過打磨處理，具體為：將玻碳電極先用紫薯粉水溶液浸泡30min，取出玻碳電極用大豆磷脂的四氯化碳溶液浸泡30min，再依次用質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇水溶液、二次蒸餾水分別超聲清洗10min，然后依次用粒徑為0.3μm、0.05μm的氧化鋁粉末打磨，再用質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇水溶液、二次蒸餾水分別超聲清洗10min，最后用氮氣吹干即可；

其中，紫薯粉水溶液的制備具體為：紫薯粉與去離子水以質(zhì)量體積比為1g:20ml混合，并置于60℃水浴條件下攪拌30min；

大豆磷脂與四氯化碳的質(zhì)量體積比為1g:50ml。

打磨處理后的玻碳電極進行修飾，具體為：以質(zhì)量體積比為1g:10ml往研缽內(nèi)加入碳納米管和質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇，研磨15min后，再加入去離子水并進行超聲處理，超聲溫度為60℃，超聲頻率為400khz，超聲時間為30min，形成碳納米管懸浮液，取5ml碳納米管懸浮液滴加在打磨處理后的玻碳電極上，經(jīng)紅外干燥即可。

碳納米管進行預處理，具體為：

s1、將鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯和β-環(huán)糊精置于離子水中超聲處理，超聲時間為30min，再加入碳納米管，繼續(xù)超聲處理3h，得混合液a，超聲頻率均為400khz，其中，鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯、β-環(huán)糊精、碳納米管、以及去離子水的質(zhì)量體積比為1g:0.5g:3g:120ml；

s2、在攪拌作用下向混合液a中加入質(zhì)量分數(shù)為80％的水合肼，并置于90℃水浴中反應5h，冷卻后，離心處理得沉淀，并用去離子水對沉淀進行洗滌，用紅外干燥即可，其中，混合液a與質(zhì)量分數(shù)為80％的水合肼的體積比為1:0.4。

電壓強度與酪氨酸濃度有良好的線性關(guān)系，r²＝0.9995。

<實施例4>

一種快速檢測酪氨酸濃度的方法，測定步驟同實施例1，其中，

所述玻碳電極經(jīng)過打磨處理，具體為：將玻碳電極先用紫薯粉水溶液浸泡25min，取出玻碳電極用大豆磷脂的四氯化碳溶液浸泡25min，再依次用質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇水溶液、二次蒸餾水分別超聲清洗8min，然后依次用粒徑為0.3μm、0.05μm的氧化鋁粉末打磨，再用質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇水溶液、二次蒸餾水分別超聲清洗8min，最后用氮氣吹干即可；

其中，紫薯粉水溶液的制備具體為：紫薯粉與去離子水以質(zhì)量體積比為1g:15ml混合，并置于50℃水浴條件下攪拌25min；

大豆磷脂與四氯化碳的質(zhì)量體積比為1g:30ml。

打磨處理后的玻碳電極進行修飾，具體為：以質(zhì)量體積比為1g:10ml往研缽內(nèi)加入碳納米管和質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇，研磨12min后，再加入去離子水并進行超聲處理，超聲溫度為50℃，超聲頻率為400khz，超聲時間為25min，形成碳納米管懸浮液，取5ml碳納米管懸浮液滴加在打磨處理后的玻碳電極上，經(jīng)紅外干燥即可。

碳納米管進行預處理，具體為：

s1、將鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯和β-環(huán)糊精置于離子水中超聲處理，超聲時間為25min，再加入碳納米管，繼續(xù)超聲處理2.5h，得混合液a，超聲頻率均為400khz，其中，鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯、β-環(huán)糊精、碳納米管、以及去離子水的質(zhì)量體積比為1g:0.3g:2.5g:110ml；

s2、在攪拌作用下向混合液a中加入質(zhì)量分數(shù)為80％的水合肼，并置于85℃水浴中反應4.5h，冷卻后，離心處理得沉淀，并用去離子水對沉淀進行洗滌，用紅外干燥即可，其中，混合液a與質(zhì)量分數(shù)為80％的水合肼的體積比為1:0.3。

電壓強度與酪氨酸濃度有良好的線性關(guān)系，r²＝0.9995。

抗溫度干擾檢測方法

一種快速檢測酪氨酸濃度的方法，測定步驟同實施例4，其中，

在三種不同的溫度下進行檢測實驗，第一組檢測時配制的多份含有不同濃度的酪氨酸的pbs緩沖溶液和不含酪氨酸的pbs緩沖溶液的溫度為5℃，玻碳電極的溫度為5℃，待檢測溶液的溫度為5℃；第二組檢測時配制的多份含有不同濃度的酪氨酸的pbs緩沖溶液和不含酪氨酸的pbs緩沖溶液的溫度為25℃，玻碳電極的溫度為25℃，待檢測溶液的溫度為25℃，第三組檢測時配制的多份含有不同濃度的酪氨酸的pbs緩沖溶液和不含酪氨酸的pbs緩沖溶液的溫度為45℃，玻碳電極的溫度為45℃，待檢測溶液的溫度為45℃。上述三組檢測實驗的待檢測溶液的酪氨酸濃度為已知濃度且均相同，通過上述實驗可知在5～45℃范圍內(nèi)，電壓強度與酪氨酸濃度有良好的線性關(guān)系，r²在0.9990～0.9996之間，檢測限為6×10^-8mol/l。

這里說明的設(shè)備數(shù)量和處理規(guī)模是用來簡化本發(fā)明的說明的。對本發(fā)明的應用、修改和變化對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。