本發(fā)明涉及一種適體傳感器，特別涉及一種氧化鐵-介孔碳(fe3o4@c)納米復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

現(xiàn)在大量的自然生成的抗生素經(jīng)常被用于治療生病的動物、促進動物的生長。其中，土霉素(otc)作為一種使用頻率很高的抗生素，被廣泛應(yīng)用于治療農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的傳染性疾病。然而，由于其較低的生物利用度，只有一部分otc可以在動物身體中代謝吸收，殘留的otc將被排泄并釋放到土壤、地表水和地下水中，這導(dǎo)致嚴重的環(huán)境問題和潛在的人類健康風險。因此，為了使人類免受殘留藥物的危害，世界衛(wèi)生組織、歐盟和中國農(nóng)業(yè)部規(guī)定土霉素在牛奶中的最大殘留限量為0.1mg·kg^-1。迄今為止，對殘留土霉素的痕量檢測吸引了很多人的注意。傳統(tǒng)的檢測土霉素的方法有液相色譜、電泳、酶聯(lián)免疫吸附法和高效液相色譜法。即使這些傳統(tǒng)的方法可靠、靈敏和穩(wěn)定，但是它們的應(yīng)用因為一些缺陷如：昂貴的設(shè)施、高成本和樣品準備時間長而受到限制。為了滿足經(jīng)濟快速發(fā)展和食品安全保障的要求，迫切需要制定新的傳感策略，為食品安全領(lǐng)域的otc殘留提供簡單、靈敏度高、便捷的檢測工具。

最近，因為與適配體的靶向結(jié)合位點互補的寡核苷酸的順序可以設(shè)計，適體基生物傳感器檢測小分子靶標(適體傳感器)越來越引起關(guān)注。與抗體生物傳感器相比，適體傳感器具有更高的親和力、合成方法簡單、方便標記和更好的穩(wěn)定性等優(yōu)點。適體傳感器綜合了電化學(xué)技術(shù)的優(yōu)點和適體傳感器的卓越的性能，所以它的發(fā)展引起很多人的興趣。為了尋求更好地固定平臺，已經(jīng)探索不同修飾電極的材料包括碳納米材料、金屬納米粒子、導(dǎo)電聚合物等等，用于提高裝載量以及探針分子的生物活性。

近年來，作為一個新興的納米多孔材料，金屬有機框架材料(mofs)由有機配體連接金屬節(jié)點合成，由于其具有獨特的性能，例如高表面積，以及結(jié)構(gòu)和功能的可調(diào)性，已經(jīng)顯示出很好的應(yīng)用前景。而以mofs為模板制備的相關(guān)納米材料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于超級電容器，電極材料和催化劑。在這些mofs材料中，fe基mofs(fe-mofs)表現(xiàn)出卓越的化學(xué)穩(wěn)定性，因為它們的毒性低且含量豐富，最重要的是它們的路易斯強酸性，這使它可以與羧酸鹽更好地配位，使骨架更穩(wěn)定。此外，fe-mofs用作電極材料時具有優(yōu)異的生物相容性和氧化還原活性。然而，在實際應(yīng)用中fe-mofs的導(dǎo)電性差從而導(dǎo)致循環(huán)性能差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

本發(fā)明提供了一種氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料，包括多孔碳基質(zhì)以及至少均勻分布于所述多孔碳基質(zhì)內(nèi)的復(fù)數(shù)個fe3o4納米顆粒。

進一步的，所述多孔碳基質(zhì)為多孔碳納米片，并且至少所述多孔碳納米片內(nèi)嵌入有復(fù)數(shù)個fe3o4納米顆粒；

優(yōu)選的，所述多孔碳納米片的表面也分布有fe3o4納米顆粒；

優(yōu)選的，所述fe3o4納米顆粒的粒徑為8-70nm，優(yōu)選為40-70nm，尤其優(yōu)選為60-70nm；

優(yōu)選的，所述多孔碳基質(zhì)所含孔洞的孔徑為18.5-29.7nm；

優(yōu)選的，所述多孔碳基質(zhì)為無定型碳基質(zhì)；

優(yōu)選的，所述多孔碳納米片的厚度為3-8nm，所述多孔碳納米片的孔徑為18.5-29.7nm；

優(yōu)選的，所述多孔碳基質(zhì)與所述fe3o4顆粒的質(zhì)量比為10.64∶1-26.08∶1；

優(yōu)選的，所述氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料的比表面積為27.24-315.12m².g^-1。

本發(fā)明還提供了一種氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料的制備方法，包括：

提供fe-mofs，

以及，將fe-mofs于350-900℃溫度下煅燒4-6h，然后冷卻至室溫，獲得氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料。

進一步的，所述方法包括：將fe-mofs以5-7℃·min^-1的升溫速率加熱至350-900℃，并保溫煅燒4-6h，然后自然冷卻至室溫，獲得氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料。

進一步的，所述方法包括：將feso4·7h2o，4，4′4″-三甲酸三苯胺(h3ntb)，n-甲基甲酰胺(nmf)和n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)混合后，于140-160℃加熱3-5d，制得所述fe-mofs；

優(yōu)選的，所述h3ntb與feso4·7h2o的摩爾比為(1-3)∶(8-10)；

優(yōu)選的，所述nmf與nmp的體積比為(1-3)∶(1-3)。

本發(fā)明還提供了一種土霉素電化學(xué)適體傳感器，包括：

所述氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料；

修飾于所述氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料上的土霉素適體鏈。

進一步的，所述土霉素電化學(xué)適體傳感器還包括：電極基體，所述fe3o4@c納米復(fù)合材料固定于所述電極基體表面；

優(yōu)選的，所述電極基體包括金電極；

優(yōu)選的，所述土霉素適體鏈的序列為：5‘-cgtacggaattcgctagccgaggcacagtcgctggtgcctacctggttgccgttgtgtggatccgagctccacgtg-3’。

本發(fā)明還提供了一種土霉素電化學(xué)適體傳感器的制備方法，包括：

采用前述的方法制備氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料；

將所述氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料分散于溶劑形成均勻懸浮液，將所述均勻懸浮液施加于電極基體上并干燥；

以土霉素適體鏈的溶液浸潤固定于所述電極基體上的氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料，使土霉素適體鏈修飾于氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料上，形成所述電化學(xué)適體傳感器。

本發(fā)明另一方面還提供了一種土霉素的檢測方法，包括：

提供所述土霉素電化學(xué)適體傳感器；

將所述土霉素電化學(xué)適體傳感器浸漬于可能含有土霉素的待測液體樣品中，之后以所述土霉素電化學(xué)適體傳感器作為工作電極進行電化學(xué)測試，實現(xiàn)對待測液體樣品中土霉素的檢測。

進一步的，所述電化學(xué)測試方法包括電化學(xué)阻抗譜或循環(huán)伏安法。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點包括：

本發(fā)明提供的fe3o4@c納米復(fù)合材料的納米結(jié)構(gòu)具有低毒性、高穩(wěn)定性和電化學(xué)活性；

本發(fā)明提供的基于fe3o4@c納米復(fù)合材料的適體傳感器制備方法簡單，檢測流程簡單；并且所述適體傳感器的比表面積高、生物親和力強、檢測靈敏度高、檢測限低，可用于快速、精確地檢測otc。

附圖說明

圖1a是本發(fā)明實施例1中fe-mofs的ntb配體的配位模式結(jié)構(gòu)示意圖；

圖1b是本發(fā)明實施例1中fe-mofs的1-d棒狀陣列的視圖；

圖1c是本發(fā)明實施例1中fe-mofs的3-d框架結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例1中fe-mofs的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)示意圖；

圖3a、圖3b、圖3c分別是本發(fā)明實施例2中fe-mofs、fe3o4@c納米復(fù)合材料的xrd與tga圖；

圖4a1、圖4a2、圖4b1、圖4b2、圖4c1、圖4c2、圖4d1、圖4d2、圖4e1、圖4e2分別是本發(fā)明實施例2中fe-mofs、fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900納米復(fù)合材料的xps分解譜；

圖5是本發(fā)明實施例2中fe-mofs、fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900復(fù)合材料的xps全譜圖；

圖6a、圖6b是本發(fā)明實施例2中fe-mofs在3000倍和1800倍的sem圖，圖c、圖d是tem圖；

圖7a、圖7b、圖7c、圖7d、圖7e、圖7f、圖7g、圖7h分別是本發(fā)明實施例2中fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900的納米復(fù)合材料的低倍和高倍tem圖像，插圖是相應(yīng)的saed圖；

圖8是本發(fā)明實施例2中fe-mofs和不同fe3o4@c納米復(fù)合材料的氮氣吸附-解吸附等溫線；

圖9a中的cv曲線和圖9b中的eis曲線是本發(fā)明實施例2中使用基于fe-mof開發(fā)的適體傳感器在含有0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-的溶液中檢測otc；

圖10a1、圖10b1、圖10c1、圖10d1、圖10a2、圖10b2、圖10c2、圖10d2分別是本發(fā)明實施例2中使用基于fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900開發(fā)的適體傳感器在含有0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-的溶液中檢測otc的cv和eis曲線圖；

圖11是本發(fā)明實施例2中使用基于fe-mof、fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900開發(fā)的適體傳感器檢測otc的每個階段的δrct值；

圖12a是本發(fā)明實施例2中apt/fe3o4@c900/ae檢測不同濃度的otc(0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1ng·ml^-1)的eis響應(yīng)曲線；

圖12b是本發(fā)明實施例2中δrct與otc濃度的曲線，其中插圖為校準曲線的線性部分；

圖13a、圖13b分別是本發(fā)明實施例2中用于檢測otc的fe3o4@c900基適體傳感器的選擇性和重現(xiàn)性圖譜；

圖14a、圖14b分別是本發(fā)明實施例2中用于檢測濃度為0.005ng·ml^-1的otc的fe3o4@c900基適體傳感器的的穩(wěn)定性和再生性圖譜。

具體實施方式

鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本案發(fā)明人經(jīng)長期研究和大量實踐，得以提出本發(fā)明的技術(shù)方案。如下將對該技術(shù)方案、其實施過程及原理等作進一步的解釋說明。

本發(fā)明實施例提供了一種氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料，包括多孔碳基質(zhì)以及至少均勻分布于所述多孔碳基質(zhì)內(nèi)的復(fù)數(shù)個fe3o4納米顆粒。

進一步的，所述多孔碳基質(zhì)為多孔碳納米片，并且至少所述多孔碳納米片內(nèi)嵌入有復(fù)數(shù)個fe3o4納米顆粒；

優(yōu)選的，所述多孔碳納米片的表面也分布有fe3o4納米顆粒；

優(yōu)選的，所述fe3o4納米顆粒的粒徑為8-70nm，優(yōu)選為40-70nm，尤其優(yōu)選為60-70nm；

優(yōu)選的，所述多孔碳基質(zhì)所含孔洞的孔徑為18.5-29.7nm；

優(yōu)選的，所述多孔碳基質(zhì)為無定型碳基質(zhì)；

優(yōu)選的，所述多孔碳納米片的厚度為3-8nm，所述多孔碳納米片的孔徑為18.5-29.7nm；

優(yōu)選的，所述多孔碳基質(zhì)與所述fe3o4顆粒的質(zhì)量比為10.64∶1-26.08∶1；

優(yōu)選的，所述氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料的比表面積為27.24-315.12m²·g^-1。

本發(fā)明還提供了一種氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料的制備方法，包括：

提供fe-mofs，

以及，將fe-mofs于350-900℃溫度下煅燒4-6h，然后冷卻至室溫，獲得氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料。

進一步的，所述方法包括：將fe-mofs以5-7℃·min^-1的升溫速率加熱至350-900℃，并保溫煅燒4-6h，然后自然冷卻至室溫，獲得氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料。

進一步的，所述方法包括：將feso4·7h2o，4，4′4″-三甲酸三苯胺(h3ntb)，n-甲基甲酰胺(nmf)和n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)混合后，于140-160℃加熱3-5d，制得所述fe-mofs；

優(yōu)選的，所述h3ntb與feso4·7h2o的摩爾比為(1-3)∶(8-10)；

優(yōu)選的，所述nmf與nmp的體積比為(1-3)∶(1-3)。

本發(fā)明還提供了一種土霉素電化學(xué)適體傳感器，包括：

所述氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料；

修飾于所述氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料上的土霉素適體鏈。

進一步的，所述土霉素電化學(xué)適體傳感器還包括：電極基體，所述fe3o4@c納米復(fù)合材料固定于所述電極基體表面；

優(yōu)選的，所述電極基體包括金電極；

優(yōu)選的，所述土霉素適體鏈的序列為：5‘-cgtacggaattcgctagccgaggcacagtcgctggtgcctacctggttgccgttgtgtggatccgagctccacgtg-3’。

本發(fā)明還提供了一種土霉素電化學(xué)適體傳感器的制備方法，包括：

采用前述的方法制備氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料；

將所述氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料分散于溶劑形成均勻懸浮液，將所述均勻懸浮液施加于電極基體上并干燥；

以土霉素適體鏈的溶液浸潤固定于所述電極基體上的氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料，使土霉素適體鏈修飾于氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料上，形成所述電化學(xué)適體傳感器。

本發(fā)明另一方面還提供了一種土霉素的檢測方法，包括：

提供所述土霉素電化學(xué)適體傳感器；

將所述土霉素電化學(xué)適體傳感器浸漬于可能含有土霉素的待測液體樣品中，之后以所述土霉素電化學(xué)適體傳感器作為工作電極進行電化學(xué)測試，實現(xiàn)對待測液體樣品中土霉素的檢測。

進一步的，所述電化學(xué)測試方法包括電化學(xué)阻抗譜或循環(huán)伏安法。

如下將結(jié)合具體實施例對該技術(shù)方案、其實施過程及原理等作進一步的解釋說明。

本發(fā)明如下實施例中采用的fe(no3)3·9h2o，4，4′，4″-亞硝基二苯甲酸(h3ntb)，n-甲基吡咯烷酮(nmp)和甲酸可以從上海晶純生化科技股份有限公司購買；土霉素(otc)、四環(huán)素、強力霉素和金霉素可以從索萊寶公司購買。如下實施例中采用的水均是超純水(18.2ωcm^-1)。所有試劑均為分析純級別。本發(fā)明實施例中采用的otc適體序列是：5‘-cgtacggaattcgctagccgaggcacagtcgctggtgcctacctggttgccgttgtgtggatccgagctccacgtg-3’。因為適體是具有獨特3d結(jié)構(gòu)的功能性ssdna或rna，可以以高特異性和親和力識別并結(jié)合其同源靶標，這些功能鏈主要針對目標檢測。

如下實施例中采用的表征設(shè)備及方式如下：

在perkin-elmer240chn元素分析儀上進行c，h和n的分析，使用nicolet850光譜儀(thermoelectroncorporation，massachusetts，usa)通過傅里葉變換紅外光譜(ftir)分析納米復(fù)合材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)；使用cukα輻射在rigakud/max-2500x射線衍射儀上記錄x射線衍射測量(xrd)；用labsysnetzschtg209setaram儀器在n2氣氛中加熱速率為10℃·min^-1時測量熱重(tga)；使用axishis165光譜儀(kratosanalytical，manchester，uk)采用單色鉻化alkαx射線源(1486.71ev光子)測量x射線光電子能譜(xps)；采用日本jeoljem-2100高分辨透射電子顯微鏡測試高分辨率透射電子顯微鏡圖像(hr-tem)，在超高度真空下，在帶有隔膜和渦輪泵系統(tǒng)的belsorpmax體積吸附設(shè)備上，測量n2吸附-脫附數(shù)據(jù)。

x射線單晶分析：用安裝石墨單色mokα或cukα(λ＝0.71073或)安捷倫科技公司的supernova單晶晶體計在不同溫度下測量數(shù)據(jù)，用shelxs(直接方法)解析結(jié)構(gòu)，并在olex2包中用shelxl(全矩陣最小二乘法)進行修正。所有非氫原子都用各向異性位移參數(shù)重新定義，將連接到碳上的氫原子置于幾何理想的位置，并使用模型進行修復(fù)；由于框架中的溶劑分子性質(zhì)高度無序，不能直接確定，因此采用platon軟件中的squeeze程序進行處理。晶體數(shù)據(jù)、tga和元素分析的組合可以確定化學(xué)式，c372h493na31n66o164的晶體數(shù)據(jù)(m＝5973.07g.mol^-1)：立方體，空間群f-43c(編號219)，a＝48.1642(8)，v＝111731(5)z＝8，t＝293(2)k，μ(cukα)＝0.640mm-1，dcalc＝0.710g·cm-3，15687測量的反射(6.356°≤2θ≤144.072°)，7387獨特(rint＝0.0604，rsigma＝0.0594)，最終的r1為0.0954(i＞2σ(i))，wr2為0.2877。

如下實施例中涉及的電化學(xué)測量方案，包括電化學(xué)阻抗譜(eis)和循環(huán)伏安法(cv)可以采用chi660d電化學(xué)工作站(上海辰華)測量。測試使用常規(guī)的三電極系統(tǒng)，其中包括作為工作電極的直徑為3mm的金電極，作為參比電極的ag/agcl(飽和kcl)電極和作為對電極的鉑片；在含有0.1mkcl的0.5mm[fe(cn)6]^3-/4-(eis參數(shù)：電位：0.21v；頻率范圍：100khz至0.1hz；振幅：5mv)中測得eis曲線；使用zview2軟件分析譜圖，使用非線性最小二乘擬合來確定等效電路中的元件參數(shù)。

實施例1：

通過混合0.242gkh2po4，1.445gna2hpo4·12h2o，0.200gkcl和8.003gnacl，并加入0.1mhcl溶液調(diào)節(jié)混合物的ph＝7.4，獲得磷酸鹽緩沖溶液(pbs，ph7.4)。用pbs配制適體和otc溶液，通過將1.650gk3fe(cn)6和2.111gk4fe(cn)6溶于1lpbs中即可制備電解質(zhì)溶液。

在特氟隆襯里的不銹鋼容器中加入22.2mg的feso4·7h2o，3.0mg的4，4′4″-三甲酸三苯胺(h3ntb)，2ml的n-甲基甲酰胺(nmf)和2ml的n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)的混合物，在160℃的烘箱中下加熱3d。用dmf洗滌之后得到棕色片狀晶體，即為fe-mofs。產(chǎn)率：45％，基于h3ntb配體。ir(kbr，cm^-1)：3414w(br)，1682m，1654m，1592vs，1555m，1505m，1398vs，1354m，1318m，1266m，1173m，1102w，1013w，840w，784m，713w，671w，629w，583w，532w，513w，436w；元素分析(計算值)：c56h50fe3n6o16：c，51.6(52.5)；h，4.43(5.05)；n，7.40(6.93)，所述fe-mofs的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如圖1、2所示。

將所制備的fe-mofs置于管式爐中并以5℃·min^-1～7℃.min^-1的升溫速率升至350℃、550℃、700℃和900℃，分別在350℃、550℃、700℃和900℃煅燒4h～6h；然后將樣品自然冷卻至室溫，獲得一系列氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料，其可以被分別命名為：fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900。

fe-mofs和fe3o4@c納米復(fù)合材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)和組分分析：

采用xps測量fe-mofs和fe3o4@c納米復(fù)合材料的化學(xué)成分和所處環(huán)境。五個樣品的xps光譜都表明它們有與c、o和fe相關(guān)的特征峰以及較弱的n峰；c1s和o1s的特征峰來自于有機配體，fe2p的峰源自于配位中心fe。圖3a、3b、3c分別是fe-mofs和fe3o4@c納米復(fù)合材料的xrd和tga圖；

表1為各個原子的百分含量，從表1中可以看出對于在不同溫度下fe-mofs熱解后的材料，例如fe3o4@c350，c1s含量首先降低到一定程度，這是由于含碳有機溶劑(nmf)的揮發(fā)和甲酸的分解。隨著煅燒溫度升高到550℃、700℃和900℃，c1s含量不斷增加，表明有機連接體配體熱分解產(chǎn)生多孔碳。對于fe2p和o1s含量，fe3o4@c350首先增加到一定程度，然后隨著煅燒溫度的升高而連續(xù)下降，變化趨勢與c1s含量相反。

表1fe-mofs和熱裂解后不同fe3o4@c納米復(fù)合材料的原子百分比

為了進一步了解熱分解前后fe-mofs和fe3o4@c納米復(fù)合材料的化學(xué)成分c1s和fe2p，還分析了它們的xps圖(如圖4(a1、a2、b1、b2、c1、c2、d1、d2、e1、e2)所示)。原始的fe-mofs(圖4a1)的c1s分解譜可以分為5個主峰，在～283.7、～284.8、～285.6和～287.9ev，分別對應(yīng)c-c/c-h、c-n、c-o、coo^-和π-π*的基團，這些峰都源自于有機連接配體。至于在不同溫度下熱裂解的材料，例如fe3o4@c350(圖4b1)，在c1s高分辨率xps光譜中有與c＝o基團對應(yīng)的～286.8ev附加峰；對于fe3o4@c550和fe3o4@c700(圖4c1和d1)，c1s高分辨率xps光譜中的結(jié)合能的位置與fe-mofs的結(jié)合能一致，但強度是不同的，至于fe3o4@c900，在c1s高分辨率xps光譜(圖4e1)中也觀察到分配給c＝o基團的～286.8ev處的附加峰。

從五個樣品(圖4a2，圖4b2，圖4c2，圖4d2和圖4e2)的fe2p核心光譜可以觀察到明顯的差異。原始的fe-mofs(圖4a2)的fe2p光譜中的～711.1和～724.9ev，分別對應(yīng)于fe2p3/2和fe2p1/2。fe-mofs熱解后，fe3o4@c350(圖4b2)的fe2p光譜有～711.0和～724.8ev兩個峰，與fe-mofs一致。隨著煅燒溫度的升高，fe3o4@c550(圖4c2)的fe2p光譜分為5個峰，分別為～709.3、～711.4、～717.7、～722.3和～724.1ev，結(jié)合能為711.4和724.1ev的峰是fe³⁺的特征峰，而結(jié)合能為709.3和722.3ev的峰值是由于fe²⁺。此外，結(jié)合能為717.7ev的峰是由于fe²⁺和fe³⁺共同作用產(chǎn)生的伴峰。當溫度升至700℃和900℃時，fe3o4@c700和fe3o4@c900的fe2p光譜觀察到類似的情況(圖4d2和圖4e2)；fe³⁺、fe²⁺的特征峰和伴峰的結(jié)合能分別位于712.5、725.3、710.0、723.0、717.5ev和711.3、724.0、709.2、722.1、717.6ev，樣品中fe²⁺和fe³⁺的存在進一步證實了fe3o4的形成。

圖6為fe-mofs的sem和tem圖像，從圖像中可以看出，fe-mofs是塊狀結(jié)構(gòu)，大多數(shù)晶體超過幾十甚至幾百微米，尺寸不均勻分布，說明制備的fe-mofs更像多晶或粉末材料；fe-mofs的不連續(xù)性導(dǎo)致它們的導(dǎo)電性差，因此電化學(xué)活性不好。如圖7所示，從tem圖中可以看出在不同熱解溫度下的fe3o4@c納米復(fù)合材料的形態(tài)變化；在第一個溫度350℃下，保留了fe-mofs的塊狀形貌，在復(fù)合材料的邊緣可以觀察到fe2o3，如圖7a和圖7b所示大部分fe3o4@c350納米復(fù)合材料有均勻分布的球狀結(jié)構(gòu)，所述球狀結(jié)構(gòu)為fe3o4納米顆粒，平均尺寸約為8-10nm。此外，所選區(qū)域電子衍射(saed，圖7b，插圖)中的電子衍射圖是幾個晶格組成的同心圓形，表明fe3o4@c350納米復(fù)合材料是多晶，并且0.247和0.283nm的晶格空間為對應(yīng)于(311)和(220)晶面，證明了fe3o4@c的形成。

如圖7c和圖7d所示，在第二階段(550℃)中，發(fā)現(xiàn)更大的球形顆粒形成并嵌入到多孔碳納米片中，而大多數(shù)顆粒團聚得到尺寸在100-150nm之間的納米球(所述納米球為fe3o4顆粒形成的團聚體)。這可能是因為有機殘余物作為還原劑使fe2o3轉(zhuǎn)化為fe3o4，并且在制備用于tem的樣品時可能分散的不完全。此外，如圖7d，插圖中的saed圖案顯示了fe2o3和fe3o4的晶格，其中所述fe3o4納米顆粒呈現(xiàn)為單分散狀態(tài)。如圖7e圖，圖7f，圖7g和圖7h所示，當煅燒溫度進一步提高至700℃和900℃，由于晶體聚集會引起的氧化鐵顆粒增大。如圖7e和7f所示，從700℃下煅燒的fe-mofs的tem圖像可以看出納米復(fù)合材料是復(fù)合結(jié)構(gòu)，從中可以看到平均直徑為40nm的由薄碳邊界單獨包裹的fe3o4納米顆粒，并且這些顆粒分散在多孔碳的基質(zhì)內(nèi)部和/或表面，如圖7g和圖7h所示，在fe3o4@c900納米復(fù)合材料中觀察到類似的情況，fe3o4顆粒的平均尺寸(粒徑)增加到60-70nm，多孔碳作為fe3o4顆粒聚集的緩沖區(qū)使晶體分布的更均勻，圖7f和7h中的插圖saed說明已經(jīng)形成典型的fe3o4晶格，進一步證明了fe3o4的形成。

fe-mofs和不同fe3o4@c納米復(fù)合材料的n2吸附-脫附等溫線如圖8所示，fe-mofs和煅燒產(chǎn)物的比表面積分別為846.19，27.24，119.45，315.12和258.03m².g^-1。

實施例2：

將適體在90℃下孵育5min，然后緩慢冷卻至室溫，將實施例1所制備的fe3o4@c350粉末(0.5mg)加入到乙醇中并徹底超聲直至獲得均勻的fe3o4@c350懸浮液；然后，將10μl的fe3o4@c350懸浮液(0.5mg·ml^-1)鋪展到金電極(ae)的表面上，然后在室溫下干燥5h；隨后，將修飾的電極浸入適體溶液(100nm)中2h，保證適體鏈固定在電極表面上直至達到飽和狀態(tài)；在該過程中，適體與fe3o4@c納米復(fù)合材料通過適體鏈與靶特異性部分形成酰胺鍵結(jié)合，這將導(dǎo)致氧化還原探針對修飾的ae的表面接近程度降低，因此電化學(xué)活性將減小。最后，將適體固定的fe3o4@c350/ae浸入otc溶液中進行電化學(xué)測試。在電化學(xué)檢測中，配體可以形成與otc具有高親和力的g-四鏈體結(jié)構(gòu)。

為了比較，也以相同的方式構(gòu)筑基于前述fe-mofs、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900的適體傳感器作為對比。

之后將空白ae、基于前述fe-mofs的適體傳感器、基于前述各氧化鐵-介孔碳納米復(fù)合材料的適體傳感器在含有一定濃度otc、0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-的溶液中檢測otc，其中采用的電化學(xué)檢測方法是cv和eis。

如圖9a中的cv曲線所示，空白ae圖中有一對明確的可逆氧化還原峰，峰間電位差(δep)為248mv。ae經(jīng)fe-mofs改性后(fe-mof/ae)，δep增加到292mv，氧化還原峰電流相應(yīng)降低，說明fe-mofs涂在ae上后導(dǎo)電率降低。當otc靶向適體鏈(apt)固定在fe-mof/ae表面時(apt/fe-mof/ae)，δep稍微升高到311mv，氧化還原峰電流幾乎不變，表明apt對于fe-mof/ae的影響不明顯。然而，當使用制備的apt/fe-mof/ae檢測otc時(otc/apt/fe-mof/ae)，δep進一步增加到369mv，氧化還原峰電流進一步降低，證明了otc/apt/fe-mof/ae的導(dǎo)電性和電化學(xué)性降低。從圖9b中的eis圖中可以得出檢測otc的不同階段的四種aes的電荷轉(zhuǎn)移電阻(rct)分別為141.2、366.6、427.5和478.1ω，表明在空白ae上固定有fe-mofs，apt和otc之后電化學(xué)活性降低依次，rct結(jié)果的變化趨勢與上述cv結(jié)果一致。

采用同樣的方式測試基于前述fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900的適體傳感器的cv曲線，結(jié)果如圖10a1、10b1、10c1、10d1所示。其中，基于fe3o4@c350的傳感器(apt/fe3o4@c350/ae)的四個aes的δep分別為271、301、354和399mv；基于fe3o4@c550的傳感器(apt/fe3o4@c550/ae)的四個aes的δep分別為256、305、402和463mv；基于fe3o4@c700的傳感器(apt/fe3o4@c700/ae)的四個aes的δep分別為243、354、433和500mv；基于fe3o4@c900的傳感器(apt/fe3o4@c900/ae)的四個aes的δep為251、283、354和420mv。結(jié)果表明，δep和氧化還原峰電流的變化趨勢均符合相同的規(guī)律，即在空白ae被fe3o4@c、apt和otc連續(xù)固定后，δep連續(xù)增加，氧化還原峰電流下降，四種基于fe3o4@c納米復(fù)合材料的適體傳感器的電化學(xué)活性相應(yīng)降低。如圖10a2、10b2、10c2、10d2所示，是用eis表示基于在不同溫度下煅燒的四種fe3o4@c納米復(fù)合材料適體傳感器來檢測otc的整個過程。對于空白ae，在較高頻率處有小的半圓，分別對應(yīng)(a)fe3o4@c350，(b)fe3o4@c550，(c)fe3o4@c700和(d)fe3o4@c900的rct值為122.7、39.26、69.17和42.24ω。用四種fe3o4@c納米復(fù)合材料分別改性后，rct值分別明顯增大到260.7、98.4、133.3和119.6ω，表明fe3o4@c納米復(fù)合材料的電導(dǎo)率相對較差；當otc靶向適體(apt)鏈固定在fe3o4@c/aes表面時，apt/fe3o4@c/ae的rct值分別進一步分別增加到330.3、183.0、236.8和334.1ω，因為適體鏈中包含的帶負電荷的磷酸基與[fe(cn)6]^3-/4-氧化還原對之間的相互排斥作用，所以分析物溶液和電極之間的界面處的rct增加。當使用制備的fe3o4@c基適體傳感器來測定otc時，eis曲線的半圓進一步增加，半圓曲線的相應(yīng)rct值分別為409.6、288.2、375.3和507.3ω，在otc存在的情況下，otc靶向的適體鏈通過與otc結(jié)合而改變其構(gòu)象，以形成g-四鏈聯(lián)體，這將阻止電荷轉(zhuǎn)移。此外，如在n2吸附-脫附等溫線中所討論的，fe3o4@c納米復(fù)合材料具有介孔結(jié)構(gòu)和高比表面積，因此otc可以吸附到fe3o4@c納米復(fù)合材料上，大量的otc被吸附到apt/fe3o4@c/aes的表面，進一步使電荷轉(zhuǎn)移變得困難。因此，otc的阻塞和阻塞效應(yīng)都導(dǎo)致apt/fe3o4@c/ae的電化學(xué)活性顯著降低。

為了比較fe-mofs和四種基于fe3o4@c納米復(fù)合材料的電化學(xué)適體傳感器對檢測otc的不同檢測效果，本發(fā)明提供了前述五個生物傳感體系每步的rct值(δrct)的變化并表示在圖11中。δrct值的差異如圖11中的柱狀圖所示，從柱狀圖可以看出，與其他四種材料相比，fe3o4@c900/ae表面的apt吸附量最大，由于fe3o4@c900/ae的比表面積和介孔結(jié)構(gòu)最高，因此可以進一步幫助吸收大多數(shù)otc，并具有最大的δrct(rct，apt-rct，材料)和δrct(rct，otc--rct，apt)。因此，測量電化學(xué)的最佳電極材料是fe3o4@c900。

apt/fe3o4@c900/ae的靈敏度測試：通過將apt/fe3o4@c900/ae與不同濃度的otc一起孵育，然后在[fe(cn)6]^3-/4-溶液中測定它們的eis圖譜。圖12a是用于檢測不同濃度的otc的apt/fe3o4@c900/ae的eis圖，因為適體傳感器對otc的有效識別，所以rct的值隨otc濃度的增加(從0.005至1.0ng·ml^-1)而逐漸增加。這可能是因為隨著otc濃度的增加，在納米復(fù)合電極表面上產(chǎn)生了抗原-抗體復(fù)合物之間更多的分子識別，從而導(dǎo)致了rct值的增強。傳感器在檢測otc之前和之后的δrct是確定的數(shù)值(參閱圖12b)，且當otc濃度的對數(shù)值(logcotc)的范圍從-2.301到0時，δrct值與logcotc成正比，它的線性回歸方程為δrct＝0.676logcotc+1.762，相關(guān)系數(shù)(r²)為0.9944。根據(jù)langmuir吸附方程，在信噪比(s/n)比為3時，模擬檢測限(lod)低至0.027pg·ml^-1。

apt/fe3o4@c900/ae的選擇性和穩(wěn)定性測試：使用apt/fe3o4@c900/ae分別檢測可能與otc共存的濃度為10^-3nm(otc濃度的10倍)的抗生素包括四環(huán)素、多西環(huán)素、金霉素和空白pbs緩沖液。如圖13a所示，與檢測otc顯著的δrct響應(yīng)值相反，通過添加其他干擾得到的響應(yīng)變化可忽略。因此，otc與其相應(yīng)的探針適體之間具有高度特異性，電化學(xué)適體傳感器對otc具有較高的選擇性；再現(xiàn)性是評估開發(fā)適體傳感器性能的重要指標，在相同條件下制備的五個基于fe3o4@c900納米復(fù)合材料的適體傳感器，通過檢測在室溫(25℃)下溶解于pbs中的10^-5nm的otc引起的δrct值來測試適體傳感器的再現(xiàn)性(圖13b)。用五個適體傳感器同時檢測相同濃度的otc的δrct值的相對標準偏差(rsd)為2.6％，表明傳感器之間的重現(xiàn)性很好。

此外，穩(wěn)定性和再生性也是評估適體傳感器性能的重要指標。在數(shù)天之內(nèi)，每次測量后將電極浸入超純水中并將其保存在4℃的冰箱中并記錄電極的δrct值，用這些δrct值來表示fe3o4@c900適體傳感器的穩(wěn)定性(圖14a)。15天后未發(fā)現(xiàn)60nmotc的rct明顯減少；再過一周，rct值下降約10％，一個月后，下降了約17％。在室溫下將結(jié)合有otc的納米復(fù)合電極浸入1.0mnaoh中80分鐘并用水洗滌，測其rct值，然后再浸入相同濃度的otc溶液中2小時測其rct值，重復(fù)這個步驟數(shù)次，比較rct值并評估再生性。如圖14b所示，在前5次再生運行期間，觀察到適體傳感器的δrct值沒有實質(zhì)變化，表明可以容易地再生。所有這些結(jié)果表明，本發(fā)明提供的適體傳感器不僅具有高靈敏度和選擇性，而且具有良好的再現(xiàn)性，穩(wěn)定性和再生性。

實施例3：

采用實施例2制得的一系列傳感器對實際樣品進行測試，該實際樣品為牛奶。相應(yīng)的測試過程包括：

在50ml離心管中，將12ml生奶與18ml超純水以及6ml10％三氯乙酸和氯仿的混合物在渦流震蕩下混合1min以沉積蛋白質(zhì)并溶解基質(zhì)中的有機物質(zhì)，然后將混合物在20℃下超聲處理15min，并以13000rpm離心10min以分離沉積物；將上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中，并以10000rpm離心10min以再次除去沉積物；在原液中加入一定量的otc，然后按照上述步驟進行預(yù)處理和分析；根據(jù)上述方法檢測所述溶液，通過hplc分析加標樣品以驗證所提出的分析方法的可靠性。

根據(jù)圖12b的標準曲線得到結(jié)果。如表2所示，該適體傳感器的回收率為98％至104％，rsd小于3.0％。同時，根據(jù)中國國家標準gb/t22990-2008，還用hplc測定了牛奶中的otc，通過比較得出本發(fā)明提供的適體傳感器的結(jié)果完全符合hplc的要求，這些都表明這一新策略對于快速檢測牛奶中的otc具有很高的重現(xiàn)性，準確性和可行性。

表2開發(fā)的適體傳感器檢測牛奶樣品中的otc

本發(fā)明通過將fe-mofs于不同溫度熱解形成一系列fe3o4@c納米復(fù)合材料，在這些納米復(fù)合材料中fe3o4納米顆粒均嵌入介孔無定形碳基底中，使得這些納米復(fù)合材料均具有比表面積高，生物相容性好，生物親和力強等優(yōu)點，特別是其中的fe3o4@c900對otc的檢測顯示出最佳的電化學(xué)活性，因此可以用于構(gòu)建電化學(xué)適體傳感器。尤其是，基于fe3o4@c900開發(fā)的otc適體傳感器顯示出高靈敏度，在otc濃度從0.005到1ng·ml^-1的寬線性范圍內(nèi)檢測限低至0.027pg·ml^-1，同時該傳感器還具有高選擇性，良好的再現(xiàn)性，穩(wěn)定性，再生性和適用性等特征。

應(yīng)當理解，上述實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。